化學(xué)合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在基因編輯中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在基因編輯中的應(yīng)用；所述CRISPR/Cpf1系統(tǒng)中包括a1)或a2)：a1)化學(xué)合成的crRNA；a2)表達(dá)crRNA的載體。所述CRISPR/Cpf1系統(tǒng)為c1)或c2)或c3)或c4)：c1)LbCRISPR/Cpf1系統(tǒng)；c2)Lb2CRISPR/Cpf1系統(tǒng)；c3)FnCRISPR/Cpf1系統(tǒng)；c4)AsCRISPR/Cpf1系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)證明，化學(xué)合成的crRNA能有效行使引導(dǎo)Cpf1剪切編輯特定靶位點(diǎn)的作用，且效率很高。載體表達(dá)的crRNA或化學(xué)合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在基因編輯中均具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】
化學(xué)合成的crRNA用于CRISPR/Cpf1系統(tǒng)在基因編輯中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及化學(xué)合成的crRNA用于CRISPR/Cpfl系統(tǒng)在基 因編輯中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因編輯是在基因組水平上進(jìn)行精確修飾的一種技術(shù)，可完成基因定點(diǎn)刪除 (InDel)突變、基因定點(diǎn)插入突變、多位點(diǎn)同時(shí)突變和小片段的刪失等?；蚓庉嫾夹g(shù)可用 于基因功能及疾病發(fā)病機(jī)理研究、構(gòu)建疾病動(dòng)物模型、生物治療、遺傳和腫瘤相關(guān)疾病研 究、整合病毒疾病研究和改良農(nóng)畜牧物種。基因編輯技術(shù)是從根本上改變物種遺傳物質(zhì)DNA 的工具，具有極其廣泛的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展前景。
[0003] 鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9系統(tǒng)是 三大基因編輯技術(shù)，本質(zhì)上均是利用非同源末端鏈接途徑(NHEJ)修復(fù)和同源重組(HR)修 復(fù)，聯(lián)合特異性DNA的靶向識(shí)別及核酸內(nèi)切酶完成的DNA序列改變。NHEJ修復(fù)使基因產(chǎn)生插 入或刪除突變，從而造成基因移碼突變，以實(shí)現(xiàn)編碼蛋白基因敲除，如果是基因組鄰近位置 兩處雙鏈斷裂，NHEJ修復(fù)后則可造成基因組片段缺失。鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活子樣效 應(yīng)因子核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9系統(tǒng)三種編輯技術(shù)的共同點(diǎn)是含有靶點(diǎn)DNA序列的識(shí) 另眍域及DNA剪切功能區(qū)域。其中ZFN通過鋅指結(jié)構(gòu)域識(shí)別靶點(diǎn)DNA序列，TALEN識(shí)別靶點(diǎn)DNA 序列的區(qū)域是重復(fù)可變雙殘基的重復(fù)，ZFN和TALEN的DNA剪切功能區(qū)域均為一種名為Fokl 的核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)okI結(jié)構(gòu)需要形成二聚體才能發(fā)揮DSB剪切功能，所以ZFNs和TALEN 均需要表達(dá)兩個(gè)DNA靶向-Fokl核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)融合蛋白。而CRISPR/Cas9系統(tǒng)是存在于大 多數(shù)細(xì)菌(約40%)和古細(xì)菌（約90%)中的一種后天免疫系統(tǒng)，可用來消滅或?qū)雇鈦淼馁|(zhì) 體或者噬菌體，并在自身基因組中留下外來基因片段作為"記憶"，在下一次外源DNA入侵 時(shí)，表達(dá)的Cas9核酸酶在含有記憶片段的crRNA及tracrRNA的指導(dǎo)下切割與記憶片段一樣 且含有PAM的外源基因，發(fā)揮抵抗外源DNA片段入侵的免疫作用。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯 生物基因組，可在靶標(biāo)片段處造成不同形式的缺失或插入，現(xiàn)已成功應(yīng)用于人類細(xì)胞系、斑 馬魚、大鼠、小鼠、果蠅等生物中。與ZFN和TALEN相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)中蛋白質(zhì)對(duì)DNA序列 的識(shí)別要更加精確得多，降低了脫靶切割的幾率，減低了細(xì)胞毒性，而且CRISPR/Cas9系統(tǒng) 的構(gòu)建僅僅需要設(shè)計(jì)與靶序列互補(bǔ)的gRNA即可，更為簡(jiǎn)單和廉價(jià)，大大提高了基因操作的 效率及簡(jiǎn)便性。但是，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也存在著一些不足，如Cas9蛋白不能對(duì)任意序列進(jìn) 行切割，其靶點(diǎn)3 '端要求必須含有PAM序列（如SpCas9蛋白要求PAM序列為NGG)。
[0004] 最新發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cpfl 系統(tǒng)（Zetsche B，Gootenberg JS et al · Cpfl is a single RNA-guided endonuclease of a class 2CRISPR-Cas system.Cell.20150ct 22； 163(3) :759-71 ·)和CRISPR/Cas9系統(tǒng)同屬CRISPR-Cas Class2系統(tǒng)，但前者僅需要一條更 短的crRNA即可實(shí)現(xiàn)基因編輯，更有潛力實(shí)現(xiàn)更簡(jiǎn)單、更精確的基因組工程操作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何進(jìn)行基因編輯。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了 CRI SPR/Cpfl系統(tǒng)在基因編輯中的應(yīng)用； 所述CRISPR/Cpfl系統(tǒng)中包括al)或a2):
[0007] al)化學(xué)合成的crRNA;
[0008] a2)表達(dá)crRNA的載體。
[0009]所述a2)中，所述載體可為將所述crRNA的編碼DNA插入骨架載體的多克隆位點(diǎn)得 到的重組載體。所述骨架載體可為克隆載體。所述克隆載體具體可為蘇州吉瑪基因股份有 限公司的生產(chǎn)的質(zhì)粒pU6gRNA。
[0010] 所述a2)中，所述載體具體可為將質(zhì)粒pU6gRNA的限制性內(nèi)切酶Bbsl和EcoRI識(shí)別 序列間的片段(質(zhì)粒pU6gRNA被限制性內(nèi)切酶Bbsl和EcoRI切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段， 該DNA為該小片段)替換為所述crRNA的編碼DNA得到的重組載體。
[0011] 上述應(yīng)用中，所述CRISPR/Cpfl系統(tǒng)可為cl)或c2)或c3)或c4):
[0012] cl)LbCRISPR/Cpfl 系統(tǒng)；
[0013] c2)Lb2CRISPR/Cpfl 系統(tǒng)；
[0014] c3)FnCRISPR/Cpfl 系統(tǒng)；
[0015] c4)AsCRISPR/Cpfl 系統(tǒng)。
[0016] 所述AsCRISPR/Cpfl系統(tǒng)來自Acidaminococcus_sp ·BV3L6，其表達(dá)AsCpfl蛋白。所 述FnCRISPR/Cpf 1系統(tǒng)來自Francisella_novicida，其表達(dá)FnCpf 1蛋白。所述LbCRISPR/ Cpfl系統(tǒng)來自 Lachnospiraceae bacterium ND2006，其表達(dá)LbCpfl蛋白。所述Lb2CRISPR/ Cpfl 系統(tǒng)來自 Lachnospiraceae_bacterium_MA2020，其表達(dá)的Lb2Cpf 1蛋白。
[0017] 所述AsCpfl蛋白可為hi)或h2)或h3):
[0018] hi)氨基酸序列是序列表中序列6所示的蛋白質(zhì)；
[0019] h2)在hi)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；
[0020] h3)將序列表中序列6所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。
[0021] 所述FnCpfl蛋白可為il)或i2)或i3):
[0022] il)氨基酸序列是序列表中序列5所示的蛋白質(zhì)；
[0023 ] i 2)在i 1)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；
[0024] i3)將序列表中序列5所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。
[0025]所述LbCpfl蛋白可為jl)或j2)或j3):
[0026] jl)氨基酸序列是序列表中序列3所示的蛋白質(zhì)；
[0027] j2)在j 1)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；
[0028] j3)將序列表中序列3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。
[0029] 所述Lb2Cpfl蛋白可為kl)或k2)或k3):
[0030] kl)氨基酸序列是序列表中序列4所示的蛋白質(zhì)；
[0031 ] k2)在kl)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；
[0032] k3)將序列表中序列4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。
[0033] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了定向編輯基因組的方法。
[0034] 本發(fā)明所提供的定向編輯基因組的方法可為方法一，可包括如下步驟：
[0035] (1)根據(jù)受體基因組中預(yù)期進(jìn)行定向編輯的靶基因設(shè)計(jì)crRNA;
[0036] (2)化學(xué)合成所述crRNA;
[0037] (3)將所述化學(xué)合成的crRNA和編碼Cpfl蛋白的基因?qū)胨鍪荏w，從而定向編輯 所述受體基因組中的所述靶基因。
[0038] 所述（1)和（3)中，所述靶基因具體可為hAAVSl基因 （Gene ID: 54776)和THUMTO3-AS1基因 （Gene ID:440944)。根據(jù)所述hAAVSl基因的核苷酸序列選擇靶序列I，所述靶序列I 的核苷酸序列具體可為:5 ' -TCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGG-3 '。根據(jù)所述THUMPD3-AS1基因的 核苷酸序列選擇靶序列Π ，所述靶序列Π 的核苷酸序列具體可為：5 ' -GAGAACAAGCGCCTCCCACCCACA-3,。
[0039]所述(3)中，所述Cpfl蛋白可為所述AsCpfl蛋白、所述FnCpfl蛋白、所述LbCpfl蛋 白或所述Lb2Cpfl蛋白。
[0040] 所述(2)和(3)中，所述化學(xué)合成的crRNA具體可為e9)-e 14)中的任一種：
[0041] e9)5'-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUucuguccccuccaccccac_3'；
[0042] elO)5'-AAUUUCUACUAAGUGUAGAUgagaacaagcgccucccac_3'；
[0043] ell)5'-AAUUUCUACUAUUGUAGAUucuguccccuccaccccac_3'；
[0044] el2)5'-AAUUUCUACUAUUGUAGAUucuguccccuccaccccacagug_3'；
[0045] el3)5'-AAUUUCUACUAUUGUAGAUgagaacaagcgccucccac_3'；
[0046] el4)5'-AAUUUCUACUAUUGUAGAUgagaacaagcgccucccacccac-3' 〇
[0047] 所述e9)或所述e 10)，具體可和編碼所述LbCpf 1蛋白的基因?qū)胨鍪荏w。所述編 碼所述LbCpfl蛋白的基因可通過質(zhì)粒的形式導(dǎo)入所述受體。所述質(zhì)粒具體可為Addgene公 司的質(zhì)粒pcDNA3.1-hLbCpf 1。所述受體可為293T細(xì)胞。
[0048] 所述ell)或所述el2)或所述el3)或所述el4)，具體可和編碼所述Lb2Cpf 1蛋白的 基因?qū)胨鍪荏w。所述編碼所述Lb2Cpfl蛋白的基因可通過質(zhì)粒的形式導(dǎo)入所述受體。所 述質(zhì)粒具體可為Addgene公司的質(zhì)粒pcDNA3. l_hLb2Cpf 1。所述受體可為293T細(xì)胞。
[0049] 本發(fā)明所提供的定向編輯基因組的方法可為方法二，可包括如下步驟：
[0050] ㈠ 根據(jù)受體基因組中預(yù)期進(jìn)行定向編輯的靶基因設(shè)計(jì)crRNA;
[0051 ] ㈡構(gòu)建表達(dá)所述crRNA的重組載體；
[0052]㈢將所述重組載體和編碼Cpfl蛋白的基因?qū)胨鍪荏w，從而定向編輯所述受體 基因組中的所述靶基因。
[0053]所述㈡和㈢中，所述重組載體可為將所述crRNA的編碼DNA插入骨架載體的多克隆 位點(diǎn)得到的重組載體。所述骨架載體可為克隆載體。所述克隆載體具體可為蘇州吉瑪基因 股份有限公司的生產(chǎn)的質(zhì)粒pU6gRNA。
[0054] 所述㈡和㈢中，所述重組載體具體可為將質(zhì)粒pU6gRNA的限制性內(nèi)切酶Bbsl和 EcoRI識(shí)別序列間的片段(質(zhì)粒pU6gRNA被限制性內(nèi)切酶Bbsl和EcoRI切成一個(gè)大片段和一 個(gè)小片段，該DNA為該小片段)替換為所述crRNA的編碼DNA得到的重組載體。
[0055] 所述㈠ 和㈢中，所述靶基因具體可為hAAVSl基因 （Gene ID:54776)和THUMPD3-AS1 基因 （Gene ID:440944)。根據(jù)所述hAAVSl基因的核苷酸序列選擇靶序列I，所述靶序列I的 核苷酸序列具體可為:5 ' -TCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGG-3 '。根據(jù)所述THUMPD3-AS1基因的核 苷酸序列選擇靶序列Π ，所述靶序列Π 的核苷酸序列具體可為：5 ' -GAGAACAAGCGCCTCCCACCCACA-3,。
[0056]所述(Ξ)中，所述Cpfl蛋白可為所述AsCpfl蛋白、所述FnCpfl蛋白、所述LbCpfl蛋白 或所述Lb2Cpfl蛋白。
[0057]所述(-)中，所述"根據(jù)受體基因組中預(yù)期進(jìn)行定向編輯的靶基因設(shè)計(jì)crRNA"具體 可為el)_e8)中的任一種：
[0058] e1)5 '-UAAUUUCUACUCUUGUAGAUucuguccccuccaccccacaguggUUUUUU-3 '；
[0059] e 2)5，-UAAUUUCUACUCUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCACAUUUUUU-3，；
[0060] e3)5，-UAAUUUCUACUGUUGUAGAUucuguccccuccaccccacaguggUUUUUU-3,；
[0061 ] e4)5，-UAAUUUCUACUGUUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCACAUUUUUU-3，；
[0062] e5)5'-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUucuguccccuccaccccacaguggUUUUUU-3'；
[0063] e 6)5，-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGAGAACAAGCGCCUCCCACCCACAUUUUUU-3，；
[0064] e7)5'-GAAUUUCUACUAUUGUAGAUucuguccccuccaccccacaguggUUUUUU-3'；
[0065] e8)5，-GAAUUUCUACUAUUGUAGAUGAGUUCUUGCGCCUCCCACCCACAUUUUUU-3，。
[0066] 表達(dá)所述el)或所述e2)的重組載體，具體可和編碼所述AsCpfl蛋白的基因?qū)胨?述受體。所述編碼所述AsCpfl蛋白的基因可通過質(zhì)粒的形式導(dǎo)入所述受體。所述質(zhì)粒具體 可為Addgene公司的質(zhì)粒pcDNA3.1 -hAsCpf 1。所述受體可為293T細(xì)胞。
[0067]表達(dá)所述e3)或所述e4)的重組載體，具體可和編碼所述FnCpfl蛋白的基因?qū)胨?述受體。所述編碼所述FnCpfl蛋白的基因可通過質(zhì)粒的形式導(dǎo)入所述受體。所述質(zhì)粒具體 可為Addgene公司的質(zhì)粒pcDNA3.1 -hFnCpf 1。所述受體可為293T細(xì)胞。
[0068]表達(dá)所述e5)或所述e6)的重組載體，具體可和編碼所述LbCpfl蛋白的基因?qū)胨?述受體。所述編碼所述LbCpfl蛋白的基因可通過質(zhì)粒的形式導(dǎo)入所述受體。所述質(zhì)粒具體 可為Addgene公司的質(zhì)粒pcDNA3.1-hLbCpfl。所述受體可為293T細(xì)胞。
[0069]表達(dá)所述e7)或所述e8)的重組載體，具體可和編碼所述Lb2Cpfl蛋白的基因?qū)?所述受體。所述編碼所述Lb2Cpfl蛋白的基因可通過質(zhì)粒的形式導(dǎo)入所述受體。所述質(zhì)粒具 體可為Addgene公司的質(zhì)粒pcDNA3.1-hLb2Cpfl。所述受體可為293T細(xì)胞。
[0070]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了定向編輯基因組的CRISPR/Cpfl系統(tǒng)。
[0071]本發(fā)明所提供的定向編輯基因組的CRI SPR/Cpf 1系統(tǒng)，該系統(tǒng)中包括a 1)或a2):
[0072] al)化學(xué)合成的crRNA;
[0073] a2)表達(dá)crRNA的載體。
[0074] 所述a2)中，所述載體可為將所述crRNA的編碼DNA插入骨架載體的多克隆位點(diǎn)得 到的重組載體。所述骨架載體可為克隆載體。所述克隆載體具體可為蘇州吉瑪基因股份有 限公司的生產(chǎn)的質(zhì)粒pU6gRNA。
[0075] 所述a2)中，所述載體具體可為將質(zhì)粒pU6gRNA的限制性內(nèi)切酶Bbsl和EcoRI識(shí)別 序列間的片段(質(zhì)粒pU6gRNA被限制性內(nèi)切酶Bbsl和EcoRI切成一個(gè)大片段和一個(gè)小片段， 該DNA為該小片段)替換為所述crRNA的編碼DNA得到的重組載體。
[0076] 上述系統(tǒng)中，所述CRISPR/Cpfl系統(tǒng)可為上述任一所述LbCRISPR/Cpfl系統(tǒng)或上述 任一所述Lb2CRISPR/Cpfl系統(tǒng)或上述任一所述FnCRISPR/Cpfl系統(tǒng)或上述任一所述 AsCRISPR/Cpfl 系統(tǒng)。
[0077] 實(shí)驗(yàn)證明，重組載體表達(dá)的crRNA在AsCRISPR/Cpfl系統(tǒng)、FnCRISPR/Cpfl系統(tǒng)、 LbCRISPR/Cpfl系統(tǒng)和Lb2CRISPR/Cpfl系統(tǒng)中均有一定的基因編輯能力，且上述各CRISPR/ Cpfl系統(tǒng)的基因編輯能力依次為:AsCRISPR/Cpfl系統(tǒng)>FnCRISPR/Cpfl系統(tǒng)>LbCRISPR/ Cpfl系統(tǒng)>Lb2CRISPR/Cpfl系統(tǒng);化學(xué)合成的crRNA能有效行使引導(dǎo)Cpfl剪切編輯特定靶 位點(diǎn)的作用，且效率很高，同時(shí)化學(xué)合成的crRNA在LbCRISPR/Cpfl系統(tǒng)和Lb2CRISPR/Cpfl 系統(tǒng)中均有一定的基因編輯能力，并且化學(xué)合成的crRNA可直接轉(zhuǎn)染，比通過構(gòu)建重組載體 轉(zhuǎn)染便于操作，更可控，并且便于進(jìn)行化學(xué)修飾。因此，重組載體表達(dá)的crRNA和/或化學(xué)合 成的crRNA用于CRISPR/Cpfl系統(tǒng)在基因編輯中均具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0078]圖1為實(shí)施例1步驟二中3的T7E1突變檢測(cè)結(jié)果。
[0079]圖2為實(shí)施例1步驟二中4的測(cè)序結(jié)果。
[0080]圖3為實(shí)施例2步驟二中3的T7E1突變檢測(cè)結(jié)果。
[0081]圖4為實(shí)施例2步驟二中4的測(cè)序結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0082]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0083]下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0084] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0085] 以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0086] 質(zhì)粒pcDNA3 · 1-hAsCpf 1、質(zhì)粒pcDNA3 · 1-hFnCpf 1、質(zhì)粒pcDNA3 · 1-hLbCpf 1 和質(zhì)粒 pcDNA3. l_hLb2Cpfl均為Addgene公司的產(chǎn)品，在下文中，質(zhì)粒pcDNA3.1-hAsCpfl簡(jiǎn)稱為質(zhì) 粒Y1681，質(zhì)粒pcDNA3.1-hFnCpfl簡(jiǎn)稱為質(zhì)粒Y1682，質(zhì)粒pcDNA3.1-hLbCpfl簡(jiǎn)稱為質(zhì)粒 Y1683，質(zhì)粒pcDNA3 · l-hLb2Cpfl簡(jiǎn)稱為質(zhì)粒Y1684。
[0087]質(zhì)粒pU6gRNA為蘇州吉瑪基因股份有限公司的產(chǎn)品，質(zhì)粒pU6gRNA(環(huán)形）的核苷酸 序列如序列表序列1所示。在下文中，質(zhì)粒pU6gRNA簡(jiǎn)稱為Y523293T細(xì)胞為中國科學(xué)院細(xì)胞 庫產(chǎn)品，目錄號(hào)為GNHU17AMEM培養(yǎng)基和FBS均為Gibco公司的產(chǎn)品。細(xì)胞孔板為Corning公 司的產(chǎn)品。Max酶為Vazyme公司產(chǎn)品，貨號(hào)為PSOSaGenomic DNA Extraction kit為Takara 公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為#9765。Trypsin-EDTA Solution為Hyclone公司，貨號(hào)為 SH30042.02WBS緩沖液是用超純水稀釋PBS(10 X )至10倍體積得到的；PBS(10 X )為生工生 物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品，貨號(hào)為E607016。0ΡΤΙ-ΜΕΜ培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品，產(chǎn)品 目錄號(hào)為ftSI^SS-OTOalipofectamine 2000為thermo fisher-invitrogen公司產(chǎn)品，貨號(hào) 為11668-027 J7E1為T7E1突變檢測(cè)試劑盒中的組件;T7E1突變檢測(cè)試劑盒為蘇州吉瑪基因 股份有限公司的產(chǎn)品。DNA Marker為Thermo Fisher公司產(chǎn)品，產(chǎn)品名稱為GeneRuler DNA Ladder Mix，貨號(hào)為SM033U10X退火buffer:含 10mM EDTA· 2Na、1000mM NaCl的pH 8.0、 lOOmM Tris-HCl緩沖液。
[0088] 實(shí)施例 1、檢測(cè) AsCRISPR/Cpfl 系統(tǒng)、FnCRISPR/Cpfl 系統(tǒng)、LbCRISPR/Cpfl 系統(tǒng)和 Lb2CRISPR/Cpfl系統(tǒng)的基因編輯能力
[0089] 選擇hAAVSl基因 （Gene ID:54776)和THUMPD3-AS1 基因 （Gene ID:440944)作為檢 測(cè) AsCRI SPR/Cpfl 系統(tǒng)、FnCRI SPR/Cpfl 系統(tǒng)、LbCRI SPR/Cpfl 系統(tǒng)和Lb2CRI SPR/Cpfl 系統(tǒng)的 基因編輯能力的靶基因。其中AsCRISPR/Cpfl系統(tǒng)來自Acidaminococcus_sp.BV3L6,其表達(dá) 序列表中序列6所示的AsCpf 1蛋白；FnCRISPR/Cpf 1系統(tǒng)來自Francisella_novicida，其表 達(dá)序列表中序列5所示的FnCpfl蛋白；LbCRISPR/Cpfl系統(tǒng)來自Lachnospiraceae bacterium ND2006,其表達(dá)序列表中序列3所示的LbCpfl蛋白；Lb2CRISPR/Cpfl系統(tǒng)來自 Lachnospiraceae_bacterium_MA2020，其表達(dá)序列表中序列4所不的Lb2Cpf 1蛋白。
[0090] 根據(jù)hAAVSl基因的核苷酸序列選擇靶序列I，根據(jù)THUMPD3-AS1基因的核苷酸序列 選擇靶序列Π 。靶序列I和靶序列Π 的序列如下：
[0091 ]靶序列1:5 ' -TCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGG-3 ' ；
[0092]靶序列 Π : 5 ' -GAGAACAAGCGCCTCCCACCCACA-3 '。
[0093] 一、質(zhì)粒的構(gòu)建
[0094] 1、質(zhì)粒Y1640的構(gòu)建
[0095] (1)用限制性內(nèi)切酶Bbsl和EcoRI雙酶切質(zhì)粒pU6gRNA，回收約2955bp的載體骨架。
[0096] (2)由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成引物Y1640-S: 5 ' -CACCgTAATTTCTACTCTTGT AGATtctgtcccctccaccccacagtggTTTTTTg-3'（單下劃線為AscrRNA骨架序列，雙下劃線為靶 序列T，波浪線為終十序列）和引物Y1 640-A : 5 ' -aattxAMAAAccactgtggggtggaggggacaga ATCTACAAGAGTAGAAATTAc-3'（單下劃線為AscrRNA骨架序列，雙下劃線為靶序列I，波浪線為 終止序列），用去離子水分別將引物Y1640-S和引物Y1640-A稀釋至100μΜ，得到引物Y1640-S 稀釋液和引物Υ1640-Α稀釋液;然后進(jìn)行退火反應(yīng)，形成DNA分子I。
[0097] 退火體系：引物Y1640-S稀釋液5yL、引物Y1640-S稀釋液5yL、去離子水35yL、10X 退火 buffer (含）5yL。
[0098] 退火程序：99。(：10111丨11，851€5111丨11，801€5111丨11，75 1€5111丨11，701€5111丨11，16。(：保存。
[0099] (3)將載體骨架和DNA分子I連接，得到質(zhì)粒Y1640。
[0100] 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)質(zhì)粒Y1640進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pU6gRNA的限制性內(nèi)切酶 Bbsl和EcoRI識(shí)別序列間的片段（質(zhì)粒pU6gRNA被限制性內(nèi)切酶Bbsl和EcoRI切成一個(gè)大片 段和一個(gè)小片段，該DNA為該小片段)替換為DNA分子I。質(zhì)粒Y1640的核苷酸序列如序列表序 列2所示。
[0101] 2、質(zhì)粒Y1641的構(gòu)建
[0102]按照步驟1的方法，僅將DNA分子I替換為DNA分子Π ，其它步驟均不變，得到質(zhì)粒 Y1641。
[0103] DNA分子Π 的制備方法如下：由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成引物Y1641-S:5'_ CACCgTAATTTCTACTCTTGTAGATGAGAACAAGCGCCTCCCACCCACATITTTTg-3 '（單下創(chuàng)線為AscrRNA 骨架序列，雙下劃線為靶序列Π ，波浪線為終止序列）和引物Y1641-A:5'-aattc AAAAAAtgtg戰(zhàn)t.gggaggcgcttgttct.cATCTACAAGAGTAGAAATTAc-3'（單下劃線為AscrRNA骨架 序列，雙下劃線為靶序列Π ，波浪線為終止序列），用去離子水分別將引物Y1641-S和引物 Y164卜A稀釋至100μΜ，得到引物Y164卜S稀釋液和引物Y164卜A稀釋液;然后進(jìn)行退火反應(yīng)， 形成DNA分子Π 。
[0104] 退火體系：引物Y1641-S稀釋液5yL、引物Y1641-S稀釋液5yL、去離子水35yL、10X 退火 buffer (含）5yL。
[0105] 退火程序：99。(：10111丨11，851€5111丨11，801€5111丨11，75 1€5111丨11，701€5111丨11，16。(：保存。
[0106] 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)質(zhì)粒Y1641進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pU6gRNA的限制性內(nèi)切酶 Bbsl和EcoRI識(shí)別序列間的片段（質(zhì)粒pU6gRNA被限制性內(nèi)切酶Bbsl和EcoRI切成一個(gè)大片 段和一個(gè)小片段，該DNA為該小片段)替換為DNA分子Π 。
[0107] 3、質(zhì)粒Y1642的構(gòu)建
[0108] 按照步驟1的方法，僅將DNA分子I替換為DNA分子ΙΠ ，其它步驟均不變，得到質(zhì)粒 Y1642〇
[0109] DNA分子ΙΠ 的制備方法如下：由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成引物Y1642-S:5'_ CACCgTAATTTCTACTGTTGTAGATtctRtcccctccaccccacagtgRTTTTTTg-3，(單下劃線為Fn crRNA骨架序列，雙下劃線為靶序列I，波浪線為終止序列）和引物Y1642-A:5'-aattc AAAAAAccactgtggggtggaggggacagaATCTACAAGAGTAGAAATTAc-3'（單下劃線為Fn crRNA骨架 序列，雙下劃線為靶序列I，波浪線為終止序列），用去離子水分別將引物Y1642-S和引物 Y1642-A稀釋至100μΜ，得到引物Y1642-S稀釋液和引物Y1642-A稀釋液;然后進(jìn)行退火反應(yīng)， 形成DNA分子m。
[0110] 退火體系：引物Y1642-S稀釋液5yL、引物Y1642-S稀釋液5yL、去離子水35yL、10X 退火 buffer (含）5yL。
[0111] 退火程序：99。(：10111丨11，851€5111丨11，801€5111丨11，75 1€5111丨11，701€5111丨11，16。(：保存。
[0112] 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)質(zhì)粒Y1642進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pU6gRNA的限制性內(nèi)切酶 Bbsl和EcoRI識(shí)別序列間的片段（質(zhì)粒pU6gRNA被限制性內(nèi)切酶Bbsl和EcoRI切成一個(gè)大片 段和一個(gè)小片段，該DNA為該小片段)替換為DNA分子ΙΠ 。
[0113] 4、質(zhì)粒Y1643的構(gòu)建
[0114] 按照步驟1的方法，僅將DNA分子I替換為DNA分子IV，其它步驟均不變，得到質(zhì)粒 Y1643；
[0115] DNA分子IV的制備方法如下：由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成引物Y1643-S:5'_ CACCgTAATTTCTACTGTTGTAGATGAGAACAAGCGCCTCCCACCCACATTTTTTg-3 ,(單下劃線為Fn crRNA骨架序列，雙下劃線為靶序列Π ，波浪線為終止序列）和引物Y1643-A:5'-aattc AAAAAAtgtgggtgggaggcgcttgttctcATCTACAAGAGTAGAAATTAc-3'（單下劃線為Fn crRNA骨架 序列，雙下劃線為靶序列Π ，波浪線為終止序列），用去離子水分別將引物Y1643-S和引物 Y1643-A稀釋至100μΜ，得到引物Y1643-S稀釋液和引物Y1643-A稀釋液;然后進(jìn)行退火反應(yīng)， 形成DNA分子m。
[0116] 退火體系：引物Y1643-S稀釋液5yL、引物Y1643-S稀釋液5yL、去離子水35yL、10X 退火 buffer (含）5yL。
[0117] 退火程序：99°C10min，85°C5min，80°C5min，75°C5min，70°C5min，16°C 保存。
[0118] 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)質(zhì)粒Y1643進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pU6gRNA的限制性內(nèi)切酶 Bbsl和EcoRI識(shí)別序列間的片段（質(zhì)粒pU6gRNA被限制性內(nèi)切酶Bbsl和EcoRI切成一個(gè)大片 段和一個(gè)小片段，該DNA為該小片段)替換為DNA分子IV。
[0119] 5、質(zhì)粒Y1644的構(gòu)建
[0120]按照步驟1的方法，僅將DNA分子I替換為DNA分子V，其它步驟均不變，得到質(zhì)粒 Y1644。
[0121] DNA分子V的制備方法如下：由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成引物Y1644-S:5'_ CACCgTAATTTCTACTAAGTGTAGATtctgtcccctccaccccacagtggTTT!TTg-：r (里下創(chuàng)錢為T,h crRNA骨架序列，雙下劃線為靶序列I，波浪線為終止序列）和引物Y1644-A:5'-aattc AAAAAAccactgtggggtggaggggacagaATCTACACTTAGTAGAAATTAc-3 '（單下劃線為Lb crRNA骨 架序列，雙下劃線為靶序列I，波浪線為終止序列），用去離子水分別將引物Y1644-S和引物 Y1644-A稀釋至100μΜ，得到引物Y1644-S稀釋液和引物Y1644-A稀釋液;然后進(jìn)行退火反應(yīng)， 形成DNA分子V。
[0122] 退火體系：引物Y1644-S稀釋液5yL、引物Y1644-S稀釋液5yL、去離子水35yL、10X 退火 buffer (含）5yL。
[0123] 退火程序：99°C10min，85°C5min，80°C5min，75°C5min，70°C5min，16°C 保存。
[0124] 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)質(zhì)粒Y1644進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pU6gRNA的限制性內(nèi)切酶 Bbsl和EcoRI識(shí)別序列間的片段（質(zhì)粒pU6gRNA被限制性內(nèi)切酶Bbsl和EcoRI切成一個(gè)大片 段和一個(gè)小片段，該DNA為該小片段)替換為DNA分子V。
[0125] 6、質(zhì)粒Y1645的構(gòu)建
[0126] 按照步驟1的方法，僅將DNA分子I替換為DNA分子VI，其它步驟均不變，得到質(zhì)粒 Y1645〇
[0127] DNA分子VI的制備方法如下：由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成引物Y1645-S:5'_ CACCgTAATTTCTACTAAGTGTAGATGAGAACAAGCGCCTCCCACCCACATTTTTTg-：T (里下創(chuàng)錢為T,h crRNA骨架序列，雙下劃線為靶序列Π ，波浪線為終止序列）和引物Y1645-A:5'-aattc AAAAAAtgtgggtgggaggcgcttgttctcATCTACACTTAGTAGAAATTAc-3 '（單下劃線為Lb crRNA骨 架序列，雙下劃線為靶序列Π ，波浪線為終止序列），用去離子水分別將引物Y1645-S和引物 Y1645-A稀釋至100μΜ，得到引物Y1645-S稀釋液和引物Y1645-A稀釋液;然后進(jìn)行退火反應(yīng)， 形成DNA分子VI。
[0128] 退火體系：引物Y1645-S稀釋液5yL、引物Y1645-S稀釋液5yL、去離子水35yL、10X 退火 buffer (含）5yL。
[0129] 退火程序：99。(：10111丨11，851€5111丨11，801€5111丨11，75 1€5111丨11，701€5111丨11，16。(：保存。
[0130] 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)質(zhì)粒Y1645進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pU6gRNA的限制性內(nèi)切酶 Bbsl和EcoRI識(shí)別序列間的片段（質(zhì)粒pU6gRNA被限制性內(nèi)切酶Bbsl和EcoRI切成一個(gè)大片 段和一個(gè)小片段，該DNA為該小片段)替換為DNA分子VI。
[0131] 7、質(zhì)粒Y1646的構(gòu)建
[0132] 按照步驟1的方法，僅將DNA分子I替換為DNA分子W，其它步驟均不變，得到質(zhì)粒 Υ1646〇
[0133] DNA分子W的制備方法如下：由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成引物Y1646-S:5'_ CACCgGAATTTCTACTATTGTAGATte；tgtcecctGcaceccacagtggTTTTTTg-3 '（單下劃線為 Lb2crRNA骨架序列，雙下劃線為靶序列I，波浪線為終止序列）和引物Y1646-A:5'-aattc AAAAAAccactgtggR-R'tggaggggacagaATCTACAATAGTAGAAATTCc-3 ,(單下劃線為Lb2crRNA骨架 序列，雙下劃線為靶序列I，波浪線為終止序列），用去離子水分別將引物Y1646-S和引物 Y1646-A稀釋至100μΜ，得到引物Y1646-S稀釋液和引物Y1646-A稀釋液;然后進(jìn)行退火反應(yīng)， 形成DNA分子W。
[0134] 退火體系：引物Y1646-S稀釋液5yL、引物Y1646-S稀釋液5yL、去離子水35yL、10X 退火 buffer (含）5yL。
[0135] 退火程序：99。(：10111丨11，851€5111丨11，801€5111丨11，75 1€5111丨11，701€5111丨11，16。(：保存。
[0136] 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)質(zhì)粒Y1646進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pU6gRNA的限制性內(nèi)切酶 Bbsl和EcoRI識(shí)別序列間的片段（質(zhì)粒pU6gRNA被限制性內(nèi)切酶Bbsl和EcoRI切成一個(gè)大片 段和一個(gè)小片段，該DNA為該小片段)替換為DNA分子W。
[0137] 8、質(zhì)粒Υ1647的構(gòu)建
[0138] 按照步驟1的方法，僅將DNA分子I替換為DNA分子珊，其它步驟均不變，得到質(zhì)粒 Υ1647〇
[0139] DNA分子珊的制備方法如下：由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成引物Y1647-S:5'_ CACCgGAATTTCTACTATTGTAGATGAGAACAAGCGCCTCCCACCCACATTTTTTg-3 '（單下劃線為 Lb2crRNA骨架序列，雙下劃線為靶序列Π ，波浪線為終止序列）和引物Y1647-A:5'-aattc AMAAAtstgggtgRaaRgcgcttgttctGATCTACAATAGTAGAAATTCc-3 ,(單下劃線為Lb2crRNA骨架 序列，雙下劃線為靶序列Π ，波浪線為終止序列），用去離子水分別將引物Y1647-S和引物 Y1647-A稀釋至100μΜ，得到引物Y1647-S稀釋液和引物Y1647-A稀釋液;然后進(jìn)行退火反應(yīng)， 形成DNA分子珊。
[0140] 退火體系：引物Y1647-S稀釋液5yL、引物Y1647-S稀釋液5yL、去離子水35yL、10X 退火 buffer (含）5yL。
[0141] 退火程序：99°C10min，85°C5min，80°C5min，75°C5min，70°C5min，16°C 保存。
[0142] 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)質(zhì)粒Y1647進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將質(zhì)粒pU6gRNA的限制性內(nèi)切酶 Bbsl和EcoRI識(shí)別序列間的片段（質(zhì)粒pU6gRNA被限制性內(nèi)切酶Bbsl和EcoRI切成一個(gè)大片 段和一個(gè)小片段，該DNA為該小片段)替換為DNA分子珊。
[0143] 二、檢測(cè)AsCRISPR/Cpfl 系統(tǒng)、FnCRISPR/Cpf 1系統(tǒng)、LbCRISPR/Cpfl 系統(tǒng)和 Lb2CRISPR/Cpfl系統(tǒng)的基因編輯能力
[0144] 1、共轉(zhuǎn)染
[0145] (1 )Y1681-Y1640_293T 細(xì)胞組的獲得
[0146] 質(zhì)粒Υ1681和質(zhì)粒Υ1640共轉(zhuǎn)染293Τ細(xì)胞的步驟如下：
[0147] ①將293Τ細(xì)胞置于裝有10% (體積比）FBS的DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(直徑為10cm)， 37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待293T細(xì)胞培養(yǎng)至80~90 %融合時(shí)，棄培養(yǎng)基，用3mL PBS洗滌 兩次。
[0148] ②完成步驟①后，向所述培養(yǎng)皿中加入lmL Trypsin-EDTA Solution，混勻，然后 吸出液相，37°C靜置1~2min。
[0149] ③完成步驟②后，向所述培養(yǎng)皿中加入2mL含10 % (體積比）FBS的DMEM培養(yǎng)基，吹 打形成單細(xì)胞懸液。
[0150] ④完成步驟③后，將所述單細(xì)胞懸液接種于6孔板，每孔約接種2X105個(gè)293T細(xì) 胞，37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
[0151] ⑤完成步驟④后，將所述6孔板中的培養(yǎng)基更換為0ΡΤΙ-ΜΕΜ培養(yǎng)基，然后加入4yg 質(zhì)粒Y1681和4yg質(zhì)粒Y1640,進(jìn)行共轉(zhuǎn)染(共轉(zhuǎn)染過程中，轉(zhuǎn)染試劑為lipofectamine 2000， 培養(yǎng)基為0ΡΤΙ-ΜΕΜ培養(yǎng)基，共轉(zhuǎn)染的步驟參考Lipofectamin2000說明書），然后37°C、5% C02培養(yǎng)箱中孵育6h，然后更換為新的0ΡΤΙ-ΜΕΜ培養(yǎng)基，37 °C、5 %C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18h。
[0152] ⑥重復(fù)步驟⑤一次。
[0153] ⑦完成步驟⑥后48h，收集細(xì)胞，然后用lmL PBS洗滌一次。
[0154] ⑧完成步驟⑦后，向所述培養(yǎng)皿中加入0.5mL Trypsin-EDTA Solution，混勻，然 后吸出液相，37°C靜置1~2min。
[0155] ⑨完成步驟⑧后，向所述培養(yǎng)皿中加入lmL含10 % (體積比）FBS的DMEM培養(yǎng)基，吹 打形成單細(xì)胞懸液;將該單細(xì)胞懸液l〇〇〇rpm離心3min，得到沉淀1。
[0156] ⑩完成步驟⑨后，向所述沉淀中加入lmL PBS，1000rpm離心3min，得到沉淀2。
[0157] 沉淀2即為質(zhì)粒Y1681和質(zhì)粒Y1640共轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞組，簡(jiǎn)稱Y1681-Y1640-293T細(xì)胞組。
[0158] (2)Y1681-293T 細(xì)胞組的獲得
[0159] 質(zhì)粒Υ1681轉(zhuǎn)染293Τ細(xì)胞的步驟如下：
[0160] ①同步驟（1)中①。
[0161] ②同步驟(1)中②。
[0162] ③同步驟(1)中③。
[0163] ④同步驟(1)中④。
[0164] ⑤完成步驟④后，將所述6孔板中的培養(yǎng)基更換為0ΡΤΙ-ΜΕΜ培養(yǎng)基，然后加入4yg 質(zhì)粒Y1681，進(jìn)行轉(zhuǎn)染(共轉(zhuǎn)染過程中，轉(zhuǎn)染試劑為lipofectamine 2000,培養(yǎng)基為0ΡΤΙ-ΜΕΜ 培養(yǎng)基，共轉(zhuǎn)染的步驟參考Lipofectamin2000說明書），然后37°C、5%C02培養(yǎng)箱中孵育6h， 然后更換為新的0ΡΤΙ-ΜΕΜ培養(yǎng)基，37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18h。
[0165] ⑥重復(fù)步驟⑤一次。
[0166] ⑦同步驟(1)中⑦。
[0167] ⑧同步驟(1)中⑧。
[0168] ⑨同步驟（1)中⑨。
[0169] ⑩同步驟（1)中⑩。
[0170] 步驟⑩獲得的沉淀即為質(zhì)粒Y1681轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞組，簡(jiǎn)稱Y1681-293T細(xì)胞組。
[0171] (3)Y1681-Y1641-293T 細(xì)胞組的獲得
[0172] 按照上述步驟（1)的方法，將質(zhì)粒Υ1640替換為質(zhì)粒Υ1641，其它步驟均不變，得到 Υ1681-Υ1641-293Τ 細(xì)胞組。
[0173] (4)Υ1681-Υ1642-293Τ 細(xì)胞組的獲得
[0174] 按照上述步驟（1)的方法，將質(zhì)粒Υ1640替換為質(zhì)粒Υ1642,其它步驟均不變，得到 Υ1681-Υ1642-293Τ 細(xì)胞組。
[0175] (5)Υ1681-Υ1643-293Τ 細(xì)胞組的獲得
[0176] 按照上述步驟（1)的方法，將質(zhì)粒Y1640替換為質(zhì)粒Y1643,其它步驟均不變，得到 Y1681-Y1643-293T 細(xì)胞組。
[0177] (6)Y1681-Y1644-293T 細(xì)胞組的獲得
[0178] 按照上述步驟（1)的方法，將質(zhì)粒Υ1640替換為質(zhì)粒Υ1644,其它步驟均不變，得到 Υ1681-Υ1644-293Τ 細(xì)胞組。
[0179] (7)Υ1681-Υ1645-293Τ 細(xì)胞組的獲得
[0180] 按照上述步驟（1)的方法，將質(zhì)粒Υ1640替換為質(zhì)粒Υ1645,其它步驟均不變，得到 Υ1681-Υ1645-293Τ 細(xì)胞組。
[0181] (8)Υ1681-Υ1646-293Τ 細(xì)胞組的獲得
[0182] 按照上述步驟（1)的方法，將質(zhì)粒Υ1640替換為質(zhì)粒Υ1646,其它步驟均不變，得到 Υ1681-Υ1646-293Τ 細(xì)胞組。
[0183] (9)Υ1681-Υ1647-293Τ 細(xì)胞組的獲得
[0184] 按照上述步驟（1)的方法，將質(zhì)粒Υ1640替換為質(zhì)粒Υ1647,其它步驟均不變，得到 Υ1681-Υ1647-293Τ 細(xì)胞組。
[0185] (10)Υ1682-Υ1640-293Τ 細(xì)胞組、Υ1683-Υ1640-293Τ 細(xì)胞組和 Υ1684-Υ1640-293Τ 細(xì) 胞組的獲得
[0186] 按照上述步驟（1)的方法，將質(zhì)粒Υ1681分別替換為質(zhì)粒Υ1682、質(zhì)粒Υ1683和質(zhì)粒 Υ1684,其它步驟均不變，得到Υ1682-Υ1640-293Τ細(xì)胞組、Υ1683-Υ1640-293Τ細(xì)胞組和 Υ1684-Υ1640-293Τ 細(xì)胞組。
[0187] (11)￥1682-2931'細(xì)胞組、￥1683-2931'細(xì)胞組和￥1684-2931'細(xì)胞組的獲得
[0188] 按照上述步驟(2)的方法，將質(zhì)粒Υ1681分別替換為質(zhì)粒Υ1682、質(zhì)粒Υ1683和質(zhì)粒 Υ1684,其它步驟均不變，得到Υ1682-293Τ細(xì)胞組、Υ1683-293Τ細(xì)胞組和Υ1684-293Τ細(xì)胞組。
[0189] (12)Υ1682-Υ1641-293Τ 細(xì)胞組、Υ1683-Υ1641-293Τ 細(xì)胞組和 Υ1684-Υ1641-293Τ 細(xì) 胞組的獲得
[0190] 按照上述步驟（1)的方法，將質(zhì)粒Υ1640替換為質(zhì)粒Υ1641，將質(zhì)粒Υ1681分別替換 為質(zhì)粒Υ1682、質(zhì)粒Υ1683和質(zhì)粒Υ1684,其它步驟均不變，得到Υ1682-Υ1641-293Τ細(xì)胞組、 Υ1683-Υ1641-293Τ 細(xì)胞組和 Υ1684-Υ1641-293Τ 細(xì)胞組。
[0191] (13)Υ1682-Υ1642-293Τ 細(xì)胞組、Υ1683-Υ1642-293Τ 細(xì)胞組和 Υ1684-Υ1642-293Τ 細(xì) 胞組的獲得
[0192] 按照上述步驟（1)的方法，將質(zhì)粒Υ1640替換為質(zhì)粒Υ1642,將質(zhì)粒Υ1681分別替換 為質(zhì)粒Υ1682、質(zhì)粒Υ1683和質(zhì)粒Υ1684,其它步驟均不變，得到Υ1682-Υ1642-293Τ細(xì)胞組、 Υ1683-Υ1642-293Τ 細(xì)胞組和 Υ1684-Υ1642-293Τ 細(xì)胞組。
[0193] (14)Υ1682-Υ1643-293Τ 細(xì)胞組、Υ1683-Υ1643-293Τ 細(xì)胞組和 Υ1684-Υ1643-293Τ 細(xì) 胞組的獲得
[0194] 按照上述步驟（1)的方法，將質(zhì)粒Υ1640替換為質(zhì)粒Υ1643,將質(zhì)粒Υ1681分別替換 為質(zhì)粒Υ1682、質(zhì)粒Υ1683和質(zhì)粒Υ1684,其它步驟均不變，得到Υ1682-Υ1643-293Τ細(xì)胞組、 Υ1683-Υ1643-293Τ 細(xì)胞組和 Υ1684-Υ1643-293Τ 細(xì)胞組。
[0195] (15)Υ1682-Υ1644-293Τ 細(xì)胞組、Υ1683-Υ1644-293Τ 細(xì)胞組和 Υ1684-Υ1644-293Τ 細(xì) 胞組的獲得
[0196] 按照上述步驟（1)的方法，將質(zhì)粒Y1640替換為質(zhì)粒Y1644,將質(zhì)粒Y1681分別替換 為質(zhì)粒Y1682、質(zhì)粒Y1683和質(zhì)粒Y1684,其它步驟均不變，得到Y(jié)1682-Y1644-293T細(xì)胞組、 Y1683-Y1644-293T 細(xì)胞組和 Y1684-Y1644-293T 細(xì)胞組。
[0197] (16)Y1682-Y1645-293T 細(xì)胞組、Y1683-Y1645-293T 細(xì)胞組和 Y1684-Y1645-293T 細(xì) 胞組的獲得
[0198] 按照上述步驟（1)的方法，將質(zhì)粒Υ1640替換為質(zhì)粒Υ1645,將質(zhì)粒Υ1681分別替換 為質(zhì)粒Υ1682、質(zhì)粒Υ1683和質(zhì)粒Υ1684,其它步驟均不變，得到Υ1682-Υ1645-293Τ細(xì)胞組、 Υ1683-Υ1645-293Τ 細(xì)胞組和 Υ1684-Υ1645-293Τ 細(xì)胞組。
[0199] (17)Υ1682-Υ1646-293Τ 細(xì)胞組、Υ1683-Υ1646-293Τ 細(xì)胞組和 Υ1684-Υ1646-293Τ 細(xì) 胞組的獲得
[0200] 按照上述步驟（1)的方法，將質(zhì)粒Υ1640替換為質(zhì)粒Υ1646,將質(zhì)粒Υ1681分別替換 為質(zhì)粒Υ1682、質(zhì)粒Υ1683和質(zhì)粒Υ1684,其它步驟均不變，得到Υ1682-Υ1646-293Τ細(xì)胞組、 Υ1683-Υ1646-293Τ 細(xì)胞組和 Υ1684-Υ1646-293Τ 細(xì)胞組。
[0201] (18)Υ1682-Υ1647-293Τ 細(xì)胞組、Υ1683-Υ1647-293Τ 細(xì)胞組和 Υ1684-Υ1647-293Τ 細(xì) 胞組的獲得
[0202]按照上述步驟（1)的方法，將質(zhì)粒Υ1640替換為質(zhì)粒Υ1647,將質(zhì)粒Υ1681分別替換 為質(zhì)粒Υ1682、質(zhì)粒Υ1683和質(zhì)粒Υ1684,其它步驟均不變，得到Υ1682-Υ1647-293Τ細(xì)胞組、 Υ1683-Υ1647-293Τ 細(xì)胞組和 Υ1684-Υ1647-293Τ 細(xì)胞組。
[0203] 2、各細(xì)胞的基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收
[0204] (1)用Genomic DNA Extraction kit分別提取步驟1獲得的各細(xì)胞組的基因組 DNA〇
[0205] (2)完成步驟（1)后，以步驟（1)提取的Y1681-Y1640-293T細(xì)胞組、Y1682-Y1640-293T 細(xì)胞組、Y1683-Y1640-293T 細(xì)胞組和 Y1684-Y1640-293T 細(xì)胞組、Y1681-Y1642-293T 細(xì) 胞組、Y1682-Y1642-293T 細(xì)胞組、Y1683-Y1642-293T 細(xì)胞組、Y1684-Y1642-293T 細(xì)胞組、 Y1681-Y1644-293T 細(xì)胞組、Y1682-Y1644-293T 細(xì)胞組、Y1683-Y1644-293T 細(xì)胞組、Y1684-Y1644-293T 細(xì)胞組、Y1681-Y1646-293T 細(xì)胞組、Y1682-Y1646-293T 細(xì)胞組、Y1683-Y1646-29 3T細(xì)胞組或Y1684-Y1646-29 3T細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以hAAV-F: 5' -GGGTCACCTCTCACTCCTTTCAT-3 ' 和 hAAV-R: 5 ' -ATCCTCTCTGGCTCCATCGTAAG-3 ' 組成的引物，用 Max酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到475bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物甲。
[0206] (3)完成步驟（1)后，以步驟（1)提取的Y1681-Y1641-293T細(xì)胞組、Y1682-Y1641- 293T 細(xì)胞組、Y1683-Y1641-293T 細(xì)胞組和 Y1684-Y1641-293T 細(xì)胞組、Y1681-Y1643-293T 細(xì) 胞組、Y1682-Y1643-293T 細(xì)胞組、Y1683-Y1643-293T 細(xì)胞組、Y1684-Y1643-293T 細(xì)胞組、 Y1681-Y1645-293T 細(xì)胞組、Y1682-Y1645-293T 細(xì)胞組、Y1683-Y1645-293T 細(xì)胞組、Y1684-Y1645-293T 細(xì)胞組、Y1681-Y1647-293T 細(xì)胞組、Y1682-Y1647-293T 細(xì)胞組、Y1683-Y1647-293T細(xì)胞組或Y1684-Y1647-293T細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以hRosa26-F:5'-AACCTCGACACCAACTCTAGTCC-3 ' 和 hRosa26-R: 5 ' -TCTCACATGAGCGAAACCACTGC-3 ' 組成的引 物，用Max酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到670bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物乙。
[0207] 3、T7E1突變檢測(cè)
[0208] (1)樣品的制備
[0209] ①將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物甲進(jìn)行膠回收，得到回收產(chǎn)物甲；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物乙進(jìn)行膠回收， 得到回收產(chǎn)物乙。
[0210] ②完成步驟①后，配制退火反應(yīng)體系：退火反應(yīng)體系包括回收產(chǎn)物甲或回收產(chǎn)物 乙1~3yg、突變檢測(cè)buffer 3yL，用ddH2〇補(bǔ)至30yL。
[0211] ③完成步驟②后，進(jìn)行退火反應(yīng)。反應(yīng)條件為:首先98°C10min，然后緩慢降溫（降 溫速度〈l°C/10s)至25°C，最后25°C5min。
[0212] 完成步驟③后的退火反應(yīng)體系即為制備的樣品。
[0213] (2)T7E1 處理
[0214] 取步驟（1)制備的樣品20yL，加入0.5yL T7E1，得到處理體系；然后37°C條件下反 應(yīng)30min。
[0215] (3)電泳分析和結(jié)果判斷
[0216] 將完成步驟(2)的處理體系用濃度為1.8%的瓊脂糖凝膠電泳分析，然后進(jìn)行如下 結(jié)果判斷：
[0217] 如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物甲可被T7EI酶切為兩段且大小分別約為198bp和277bp、說明相 應(yīng)的CRISPR/Cpf 1系統(tǒng)造成hAAVSl基因的突變;如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物甲被T7EI酶切后的大小無 明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpfl系統(tǒng)不造成hAAVSl基因的突變；
[0218] 如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物乙可被T7EI酶切為兩段且大小分別約為286bp和384bp、說明相 應(yīng)的CRISPR/Cpfl系統(tǒng)造成THUMPD3-AS1基因的突變;如果PCR擴(kuò)增產(chǎn)物乙被T7EI酶切后的 大小無明顯變化，則相應(yīng)的CRISPR/Cpfl系統(tǒng)不造成THUMPD3-AS1基因的突變。
[0219] T7E1突變檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1 (圖1中A為hAAVSl基因的突變檢測(cè)結(jié)果：左上為 AsCRISPR/Cpf 1 系統(tǒng)，其中Μ為DNA Marker，為Y1681-293T細(xì)胞組，As為Y1681-Y1640-293T 細(xì)胞組，F(xiàn)n 為 Y1681-Y1642-293T 細(xì)胞組，Lb 為 Y1681-Y1644-293T 細(xì)胞組，Lb2 為 Y1681-Y1646-293T細(xì)胞組；右上為FnCRISPR/Cpfl系統(tǒng)，其中Μ為DNA Marker，為Y1682-293T細(xì) 胞組，As 為 Y1682-Y1640-293T 細(xì)胞組，F(xiàn)n 為 Y1682-Y1642-293T 細(xì)胞組，Lb 為 Y1682-Y1644-293T細(xì)胞組，Lb2為Y1682-Y1646-293T細(xì)胞組；左下為LbCRISPR/Cpfl系統(tǒng)，其中Μ為DNA Marker，為Υ1683-293Τ細(xì)胞組，As為Υ1683-Υ1640-293Τ細(xì)胞組，F(xiàn)n為Υ1683-Υ1642-293Τ 細(xì)胞組，Lb為Y1683-Y1644-293T細(xì)胞組，Lb2為Y1683-Y1646-293T細(xì)胞組；右下為 Lb2CRISPR/Cpfl系統(tǒng)，其中Μ為DNA Marker，為Y1684-293T細(xì)胞組，As為Y1684-Y1640-293T 細(xì)胞組，F(xiàn)n 為 Y1684-Y1642-293T 細(xì)胞組，Lb 為 Y1684-Y1644-293T 細(xì)胞組，Lb2 為 Y1684-Y1646-293T細(xì)胞組。圖1中B為THUMPD3-AS1基因的突變檢測(cè)結(jié)果：左上為AsCRISPR/Cpfl系 統(tǒng)，其中 Μ 為 DNA Marker，為 Y1681-293T 細(xì)胞組，As 為 Y1681-Y1641-293T 細(xì)胞組，F(xiàn)n 為 Y1681-Y1643-293T 細(xì)胞組，Lb 為 Y1681-Y1645-293T 細(xì)胞組，Lb2 為 Y1681-Y1647-293T 細(xì)胞 組；右上為FnCRISPR/Cpfl系統(tǒng)，其中Μ為DNA Marker，為Y1682-293T細(xì)胞組，As為Y1682-Y1641-293T 細(xì)胞組，F(xiàn)n 為 Y1682-Y1643-293T 細(xì)胞組，Lb 為 Y1682-Y1645-293T 細(xì)胞組，Lb2 為 Y1682-Y1647-293T細(xì)胞組；左下為LbCRISPR/Cpfl系統(tǒng)，其中Μ為DNA Marker，為Y1683-293T 細(xì)胞組，As 為 Y1683-Y1641-293T 細(xì)胞組，F(xiàn)n 為 Y1683-Y1643-293T 細(xì)胞組，Lb 為 Y1683-Y1645-293T 細(xì)胞組，Lb2 為 Y1683-Y1647-293T 細(xì)胞組；右下為 Lb2CRISPR/Cpfl 系統(tǒng)，其中 Μ 為 DNA Marker，為Υ1684-293Τ細(xì)胞組，As為Υ1684-Υ1641-293Τ細(xì)胞組，F(xiàn)n為Υ1684-Υ1643-293T 細(xì)胞組，Lb 為 Y1684-Y1645-293T 細(xì)胞組，Lb2 為 Y1684-Y1647-293T 細(xì)胞組）。結(jié)果表明， AsCRI SPR/Cpfl 系統(tǒng)、FnCRI SPR/Cpfl 系統(tǒng)、LbCRI SPR/Cpf 1 系統(tǒng)和Lb2CRI SPR/Cpfl 系統(tǒng)均造 成hAAVSl基因和THUMPD3-AS1基因的突變。因此，上述各CRISPR/Cpfl系統(tǒng)均有一定的基因 編輯能力。
[0220] 4、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物甲和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物乙的測(cè)序
[0221] 將步驟2中（2)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物甲進(jìn)行測(cè)序，引物為hAAV-ce : 5 ' -cagctcccctaccccccttac-3'。將步驟2中（3)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物乙進(jìn)行測(cè)序，引物為 hRosa26_ce: 5 ' -cgcccagggaccaagttagc-3 '。測(cè)序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。
[0222] 測(cè)序結(jié)果見圖2(圖2中A為AsCRISPR/Cpfl系統(tǒng)對(duì)hAAVSl基因的編輯能力，其中（a) 為Y1681-293T細(xì)胞組，（b)為Y1681-Y1640-293T細(xì)胞組，（c)為Y1681-Y1642-293T細(xì)胞組， (d)為Y1681-Y1644-293T細(xì)胞組，（e)為Y1681-Y1646-293T細(xì)胞組；圖2中B為AsCRISPR/Cpfl 系統(tǒng)對(duì)THUMPD3-AS1基因的編輯能力，其中（a)為Y1681-293T細(xì)胞組，（b)為Y1681-Y1641-293T細(xì)胞組，（c)為Y1681-Y1643-293T細(xì)胞組，（d)為Y1681-Y1645-293T細(xì)胞組，（e)為 Y1681-Y1647-293T細(xì)胞組；圖2中C為FnCRISPR/Cpfl系統(tǒng)對(duì)hAAVSl基因的編輯能力，其中 (a)為Y1682-293T細(xì)胞組，（b)為Y1682-Y1640-293T細(xì)胞組，（c)為Y1682-Y1642-293T細(xì)胞 組，（d)為Y1682-Y1644-293T細(xì)胞組，（e)為Y1682-Y1646-293T細(xì)胞組；圖2中D為FnCRISPR/ Cpfl系統(tǒng)對(duì)THUMPD3-AS1基因的編輯能力，其中（a)為Y1682-293T細(xì)胞組，（b)為Y1682-Y1641-293T細(xì)胞組，（c)為Y1682-Y1643-293T細(xì)胞組，（d)為Y1682-Y1645-293T細(xì)胞組，（e) 為Y1682-Y1647-293T細(xì)胞組；圖2中E為LbCRISPR/Cpfl系統(tǒng)對(duì)hAAVSl基因的編輯能力，其中 (a)為Y1683-293T細(xì)胞組，（b)為Y1683-Y1640-293T細(xì)胞組，（c)為Y1683-Y1642-293T細(xì)胞 組，（d)為Y1683-Y1644-293T細(xì)胞組，（e)為Y1683-Y1646-293T細(xì)胞組；圖2中F為LbCRISPR/ Cpfl系統(tǒng)對(duì)THUMPD3-AS1基因的編輯能力，其中（a)為Y1683-293T細(xì)胞組，（b)為Y1683-Y1641-293T細(xì)胞組，（c)為Y1683-Y1643-293T細(xì)胞組，（d)為Y1683-Y1645-293T細(xì)胞組，（e) 為Y1683-Y1647-293T細(xì)胞組；圖2中G為Lb2CRISPR/Cpfl系統(tǒng)對(duì)hAAVSl基因的編輯能力，其 中（a)為Y1684-293T細(xì)胞組，（b)為Y1684-Y1640-293T細(xì)胞組，（c)為Y1684-Y1642-293T細(xì)胞 組，（d)為Y1684-Y1644-293T細(xì)胞組，（e)為Y1684-Y1646-293T細(xì)胞組；圖2中Η為Lb2CRISPR/ Cpfl系統(tǒng)對(duì)THUMPD3-AS1基因的編輯能力，其中（a)為Y1684-293T細(xì)胞組，（b)為Y1684-Y1641-293T細(xì)胞組，（c)為Y1684-Y1643-293T細(xì)胞組，（d)為Y1684-Y1645-293T細(xì)胞組，（e) 為 Y1684-Y1647-293T 細(xì)胞組）。測(cè)序結(jié)果表明，AsCRISPR/Cpfl 系統(tǒng)、FnCRISPR/Cpfl 系統(tǒng)、 LbCRISPR/Cpfl系統(tǒng)和Lb2CRISPR/Cpfl系統(tǒng)均造成hAAVSl基因和THUMPD3-AS1基因的突變， 且上述各CRISPR/Cpfl系統(tǒng)的基因編輯能力依次為:AsCRISPR/Cpfl系統(tǒng)>FnCRISPR/Cpfl 系統(tǒng) >LbCRISPR/Cpfl 系統(tǒng) >Lb2CRISPR/Cpfl 系統(tǒng)。因此，AsCRISPR/Cpfl 系統(tǒng)、FnCRISPR/ Cpfl系統(tǒng)、LbCRISPR/Cpfl系統(tǒng)和Lb2CRISPR/Cpfl系統(tǒng)均可運(yùn)用于基因編輯技術(shù)。
[0223] 實(shí)施例2、化學(xué)合成的crRNA用于CRISPR/Cpfl系統(tǒng)在基因編輯中的應(yīng)用
[0224] -、化學(xué)合成的crRNA的制備
[0225] 合成表1中所示的crRNA。表1中，單下劃線為Lb crRNA骨架序列自5'末端起第2至 21位，虛線為Lb2crRNA骨架序列自5 '末端起第2至20位，雙下劃線為靶序列I自5 '末端起第1 至19位，方框?yàn)榘行蛄蠭自5'末端起第1至23位，單波浪線為靶序列Π 自5'末端起第1至23 位，雙波浪線為靶序列Π 自5'末端起第1至19位。
[0226] 表1中所示的所有crRNA為均10D(33yg) -管，每管中加入66yL DEPC水，得到RNA濃 度均為0.5yg/yL的RNA溶液。
[0227] 表1.化學(xué)合成的crRNA的基本信息
[0228]
[0229] 二、檢測(cè)化學(xué)合成的crRNA用于CRISPR/Cpfl系統(tǒng)中的基因編輯能力
[0230] 1、共轉(zhuǎn)染
[0231] (1 )Y1683-A39-293T 細(xì)胞組的獲得
[0232] 質(zhì)粒Y1683和A39共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞的步驟如下：
[0233] ①同實(shí)施例1步驟二1(1)中①。
[0234] ②同實(shí)施例1步驟二1(1)中②。
[0235] ③同實(shí)施例1步驟二1(1)中③。
[0236] ④同實(shí)施例1步驟二1(1)中④。
[0237] ⑤完成步驟④后，將所述6孔板中的培養(yǎng)基更換為OPTI-MEM培養(yǎng)基，然后加入4yg 質(zhì)粒Y1683和2yg A39(即加入RNA溶液4yL)，進(jìn)行共轉(zhuǎn)染（共轉(zhuǎn)染過程中，轉(zhuǎn)染試劑為 1 ipofectamine 2000，培養(yǎng)基為ΟΡΤΙ-ΜΕΜ培養(yǎng)基，共轉(zhuǎn)染的步驟參考Lipofectamin2000說 明書），然后37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中孵育6h，然后更換為新的0ΡΤΙ-ΜΕΜ培養(yǎng)基，37 °C、5 % C02培 養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18h。
[0238] ⑥重復(fù)步驟⑤一次。
[0239] ⑦同實(shí)施例1步驟二1(1)中⑦。
[0240] ⑧同實(shí)施例1步驟二1(1)中⑧。
[0241] ⑨同實(shí)施例1步驟二1(1)中⑨。
[0242] ⑩同實(shí)施例1步驟二1(1)中⑩。
[0243] 步驟⑩中的沉淀即為質(zhì)粒Y1683和A39共轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞組，簡(jiǎn)稱Y1683-A39-293T細(xì)胞組。
[0244] (2)Y1683-R39-293T 細(xì)胞組的獲得
[0245] 按照上述步驟（1)的方法，將質(zhì)粒A39替換為R39,其它步驟均不變，得到Y(jié)1683-R39-293T細(xì)胞組。
[0246] (3)Υ1683_293Τ 細(xì)胞組的獲得
[0247] 按照實(shí)施例1步驟二1中（2)的方法，將質(zhì)粒Υ1681替換為質(zhì)粒Υ1683,其它步驟均不 變，得到Υ1683-293Τ細(xì)胞組。
[0248] (4)Υ1683-Υ1644-293Τ 細(xì)胞組的獲得
[0249] 按照實(shí)施例1步驟二1中（1)的方法，將質(zhì)粒Υ1640替換為質(zhì)粒Υ1644,將質(zhì)粒Υ1681 替換為質(zhì)粒Υ1683,其它步驟均不變，得到Υ1683-Υ1644-293Τ細(xì)胞組。
[0250] (5)Υ1683-Υ1645-293Τ 細(xì)胞組的獲得
[0251] 按照實(shí)施例1步驟二1中（1)的方法，將質(zhì)粒Υ1640替換為質(zhì)粒Υ1645,將質(zhì)粒Υ1681 替換為質(zhì)粒Υ1683,其它步驟均不變，得到Υ1683-Υ1645-293Τ細(xì)胞組。
[0252] (6)Υ1684-Α38-293Τ 細(xì)胞組的獲得
[0253] 按照上述步驟（1)的方法，將質(zhì)粒Υ1683替換為質(zhì)粒Υ1684,將質(zhì)粒Α39替換為Α38， 其它步驟均不變，得到Π 684-Α38-293Τ細(xì)胞組。
[0254] (7)Υ1684-Α42-293Τ 細(xì)胞組的獲得
[0255] 按照上述步驟（1)的方法，將質(zhì)粒Υ1683替換為質(zhì)粒Υ1684，將質(zhì)粒Α39替換為Α42， 其它步驟均不變，得到Π 684-Α42-293Τ細(xì)胞組。
[0256] (8)Y1684-R38-293T 細(xì)胞組的獲得
[0257] 按照上述步驟（1)的方法，將質(zhì)粒Y1683替換為質(zhì)粒Y1684，將質(zhì)粒A39替換為R38， 其它步驟均不變，得到n684-R38-293T細(xì)胞組。
[0258] (9)Y1684-R42-293T 細(xì)胞組的獲得
[0259] 按照上述步驟（1)的方法，將質(zhì)粒Y1683替換為質(zhì)粒Y1684,將質(zhì)粒A39替換為R42， 其它步驟均不變，得到n684-R42-293T細(xì)胞組。
[0260] (10)Y1684-293T 細(xì)胞組的獲得
[0261] 按照實(shí)施例1步驟二1中（2)的方法，將質(zhì)粒Υ1681替換為質(zhì)粒Υ1684,其它步驟均不 變，得到Υ1684-293Τ細(xì)胞組。
[0262] (11 )Υ1684-Υ1646_293Τ 細(xì)胞組的獲得
[0263] 按照實(shí)施例1步驟二1中（1)的方法，將質(zhì)粒Υ1640替換為質(zhì)粒Υ1646,將質(zhì)粒Υ1681 替換為質(zhì)粒Υ1684,其它步驟均不變，得到Υ1684-Υ1646-293Τ細(xì)胞組。
[0264] (12)Υ1684-Υ1647-293Τ 細(xì)胞組的獲得
[0265] 按照實(shí)施例1步驟二1中（1)的方法，將質(zhì)粒Υ1640替換為質(zhì)粒Υ1647,將質(zhì)粒Υ1681 替換為質(zhì)粒Υ1684,其它步驟均不變，得到Υ1684-Υ1647-293Τ細(xì)胞組。
[0266] 2、各細(xì)胞的基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的回收
[0267] (1)用Genomic DNA Extraction kit分別提取步驟1獲得的各細(xì)胞組的基因組 DNA〇
[0268] (2)完成步驟（1)后，以步驟（1)提取的Y1683-293T細(xì)胞組、Y1683-Y1644-293T細(xì)胞 組、Y1684-Y1646-293T 細(xì)胞組、Y1683-A39-293T 細(xì)胞組、Y1684-A38-293T 細(xì)胞組或 Y1684-A42-293T 細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以hAAV-F: 5 ' -GGGTCACCTCTCACTCCTTTCAT-3 ' R: 5 ' -ATCCTCTCTGGCTCCATCGTAAG-3 ' 組成的引物，用Max酶進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到 475bp的 PCR 擴(kuò) 增產(chǎn)物甲。
[0269] (3)完成步驟（1)后，以步驟（1)提取的Y1684-293T細(xì)胞組、Y1683-Y1645-293T細(xì)胞 組、Y1684-Y1647-293T 細(xì)胞組、Y1683-R39-293T 細(xì)胞組、Y1684-R38-293T 細(xì)胞組或 Y1684-R42-293T細(xì)胞組的基因組DNA為模板，以hRosa26-F: 5 '-AACCTCGACACCAACTCTAGTCC-3 ' 和 hRosa26-R: 5 ' -TCTCACATGAGCGAAACCACTGC-3 ' 組成的引物，用Max酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到 670bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物乙。
[0270] 3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的T7E1突變檢測(cè)
[0271] 同實(shí)施例1步驟二中3。
[0272] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3(圖3中A為化學(xué)合成的crRNA用于CRISPR/Cpfl系統(tǒng)中hAAVSl基因 的突變檢測(cè)結(jié)果：其中Μ為DNA Marker，B為Y1683-293T細(xì)胞組，LbA為Y1683-Y1644-293T細(xì) 胞組，Lb2A 為 Y1684-Y1646-293T 細(xì)胞組，A39 為 Y1683-A39-293T 細(xì)胞組，A38 為 Y1684-A38-293T細(xì)胞組，A42為Y1684-A42-293T細(xì)胞組；圖3中B為化學(xué)合成的crRNA用于CRISPR/Cpfl系 統(tǒng)中THUMPD3-AS1基因的突變檢測(cè)結(jié)果：其中Μ為Marker，B為Y1684-293T細(xì)胞組，LbR為 Y1683-Y1645-293T 細(xì)胞組，Lb2R 為 Y1684-Y1647-293T 細(xì)胞組，R39 為 Y1683-R39-293T 細(xì)胞 組，R38為Y1684-R38-293T細(xì)胞組，R42為Y1684-R42-293T細(xì)胞組）。結(jié)果表明，化學(xué)合成的 crRNA在LbCRISPR/Cpfl系統(tǒng)和Lb2CRISPR/Cpfl系統(tǒng)中均有一定的基因編輯能力。
[0273] 4、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序
[0274] 同實(shí)施例1步驟二中4。測(cè)序結(jié)果見圖4(圖4中A為化學(xué)合成的crRNA用于CRISPR/ Cpfl系統(tǒng)中hAAVSl基因的編輯能力：其中LbCpfl為Y1683-293T細(xì)胞組，LbCpfl+LbA為 Y1683-Y1644-293T 細(xì)胞組，Lb2Cpfl+Lb2A 為 Y1684-Y1646-293T 細(xì)胞組，LbCpfl+A39 為 Y1683-A39-293T 細(xì)胞組，Lb2Cpfl+A38 為 Y1684-A38-293T 細(xì)胞組，Lb2Cpfl+A42 為 Y1684-A42-293T細(xì)胞組。圖4中B為化學(xué)合成的crRNA用于CRISPR/Cpfl系統(tǒng)中THUMPD3-AS1基因的 編輯能力：其中Lb2Cpfl 為 Y1684-293T 細(xì)胞組，LbCpfl+LbR 為 Y1683-Y1645-293T 細(xì)胞組， Lb2Cpf l+Lb2R 為 Y1684-Y1647-293T 細(xì)胞組，LbCpfl+R39 為 Y1683-R39-293T 細(xì)胞組，Lb2Cpfl +R38為Y1684-R38-293T細(xì)胞組，Lb2Cpfl+R42為Y1684-R42-293T細(xì)胞組）。測(cè)序結(jié)果表明，化 學(xué)合成的crRNA能有效行使引導(dǎo)Cpfl剪切編輯特定靶位點(diǎn)的作用，且效率很高。因此，化學(xué) 合成的crRNA在LbCRISPR/Cpfl系統(tǒng)和Lb2CRISPR/Cpfl系統(tǒng)中均有一定的基因編輯能力。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. CRI SPR/Cpfl系統(tǒng)在基因編輯中的應(yīng)用;所述CRI SPR/Cpfl系統(tǒng)中包括a I)或a2): al)化學(xué)合成的crRNA; a2)表達(dá)crRNA的載體。2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述a2)中，所述表達(dá)crRNA的載體是將所述 crRNA的編碼DNA插入骨架載體的多克隆位點(diǎn)得到的重組載體。3. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述骨架載體為克隆載體。4. 如權(quán)利要求1至3任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述CRISPR/Cpfl系統(tǒng)為cl)或c2)或 c3)或c4): c l)LbCRI SPR/Cpfl 系統(tǒng)； c2) Lb2CRI SPR/Cpfl 系統(tǒng)； c3)FnCRISPR/Cpfl 系統(tǒng)； c4)AsCRI SPR/Cpfl 系統(tǒng)。5. -種定向編輯基因組的方法，包括如下步驟： (1) 根據(jù)受體基因組中預(yù)期進(jìn)行定向編輯的靶基因設(shè)計(jì)crRNA; (2) 化學(xué)合成所述crRNA; (3) 將所述化學(xué)合成的crRNA和編碼Cpfl蛋白的基因?qū)胨鍪荏w，從而定向編輯所述 受體基因組中的所述靶基因。6. -種定向編輯基因組的方法，包括如下步驟： (-)根據(jù)受體基因組中預(yù)期進(jìn)行定向編輯的靶基因設(shè)計(jì)crRNA; ㈡構(gòu)建表達(dá)所述crRNA的重組載體； ㈢將所述重組載體和編碼Cpfl蛋白的基因?qū)胨鍪荏w，從而定向編輯所述受體基因 組中的所述靶基因。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述表達(dá)所述crRNA的重組載體是將所述 crRNA的編碼DNA插入骨架載體的多克隆位點(diǎn)得到的。8. 如權(quán)利要求5至7任一所述的方法，其特征在于：所述編碼Cpfl蛋白的基因是通過質(zhì) 粒的形式導(dǎo)入所述受體的。9. 一種定向編輯基因組的CRISPR/Cpfl系統(tǒng)，其特征在于:所述CRISPR/Cpfl系統(tǒng)中包 括al)或a2): al)化學(xué)合成的crRNA; a2)表達(dá)crRNA的載體。10. 如權(quán)利要求9所述的系統(tǒng)，其特征在于:所述CRISPR/Cpfl系統(tǒng)為cl)或c2)或c3)或 c4)： c l)LbCRI SPR/Cpfl 系統(tǒng)； c2) Lb2CRI SPR/Cpfl 系統(tǒng)； c3)FnCRISPR/Cpfl 系統(tǒng)； c4)AsCRI SPR/Cpfl 系統(tǒng)。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK105907785SQ201610292302
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年5月5日
【發(fā)明人】張佩琢, 王德華, 徐明亮
【申請(qǐng)人】蘇州吉瑪基因股份有限公司