一種微生物生產(chǎn)羥基氧代色烯苯酸的方法
【專利摘要】一種微生物生產(chǎn)羥基氧代色烯苯酸的方法，具體是一種釀酒酵母生物催化制備醫(yī)藥中間體2?（5，6，7?3羥基?4?氧代?4H?色烯?2?基）?苯酸的方法，微生物發(fā)酵液中加入底物，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，產(chǎn)品收率高，反應(yīng)條件溫和，常溫、常壓操作，解決了現(xiàn)有方法生產(chǎn)條件苛刻的困難。
【專利說明】
一種微生物生產(chǎn)羥基氧代色烯苯酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于制藥工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到釀酒酵母生物催化制備醫(yī)藥中間體2_ (5,6,7_ 3羥基-4-氧代-4H-色烯-2-基)-苯酸的技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物催化具有催化效率高、選擇性強(qiáng)、條件溫和、環(huán)境友好等突出優(yōu)點(diǎn)，是可持續(xù) 發(fā)展過程中替代和拓展傳統(tǒng)有機(jī)化學(xué)合成的重要方法。其中微生物催化是生物催化最具吸 引力的應(yīng)用領(lǐng)域之一，在工業(yè)生物催化中一直扮演著重要角色。
[0003] 芳烴的羧化反應(yīng)是一類重要的反應(yīng)，其產(chǎn)物為芳烴羥基羧酸，是重要的藥物合成 起始原料。但是，現(xiàn)在的生產(chǎn)采用傳統(tǒng)的化學(xué)合成，用芳烴與C0 2反應(yīng)，反應(yīng)壓力高達(dá)lOMPa， 溫度高達(dá)140-380°C，反應(yīng)選擇性差，副產(chǎn)物多。采用微生物催化，則可能改變這種狀況。采 用微生物催化，可以在常溫、常壓下反應(yīng)生產(chǎn)芳烴羥基羧酸，條件溫和，選擇性高，副反應(yīng) 少，產(chǎn)率高。
[0004] 本發(fā)明將采用微生物催化反應(yīng)，生產(chǎn)芳烴羥基羧酸：2_( 5，6，7- 3羥基-4-氧代_ 4H-色烯-2-基)-苯酸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明采用釀酒酵母催化制備2-(5,6,7_ 3羥基-4-氧代-4H-色烯-2-基)-苯酸， 反應(yīng)式如下：
底物5，6，7- 3羥基-2-苯基-色烯-4-酮（1)經(jīng)釀酒酵母催化反應(yīng)，得到產(chǎn)物2-(5，6，7-3羥基-4-氧代-4H-色烯-2-基)-苯酸(2)。有多種微生物可以催化此反應(yīng)，經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)篩 選，最終確定采用釀酒酵母作為催化劑，因?yàn)槠浯呋磻?yīng)的效果最好，副產(chǎn)物極少，反應(yīng)收 率高。
[0006] 許多酵母都可以進(jìn)行生物催化此反應(yīng)，然而，其效果不同，相差很大，經(jīng)實(shí)驗(yàn)，本發(fā) 明 由于底物溶解度較低，所以，加入表面活性劑以增加底物的溶解度。盡管表面活性劑增 加了底物溶解度，底物仍然不能很好溶解，于液-液2相反應(yīng)，底物、產(chǎn)物的相間傳質(zhì)為 反應(yīng)的限制環(huán)節(jié)，所以，還需采取措施，以提高反應(yīng)速度。增加非均相反應(yīng)的反應(yīng)界面，是提 高非均相反應(yīng)的有效措施之一。加入表面活性劑后，在強(qiáng)烈攪拌下，反應(yīng)液成為乳液，使得 催化反應(yīng)界面大幅度增加，從而大幅度提高反應(yīng)速度。特別是，加入的表面活性劑，必須生 物相容，不抑制微生物的催化活性，所以，表面活性劑種類和濃度的選擇，是非常重要的。大 量實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于本反應(yīng)，加入支鏈化13碳格爾伯特醇聚氧乙烯醚25-28g/L是最佳的。
[0007] 反應(yīng)結(jié)束后，用有機(jī)溶劑萃取產(chǎn)物。需要破乳，有多種方法可以破乳，包括鹽析法： 加入氯化鈉、硫酸銨或氯化鈣、氯化鎂、硫酸鈣、硫酸鎂;凝聚法:加入聚合氯化鋁、明礬等； 或者將上述2類混合加入;加熱等。不同產(chǎn)物，所用的方法不同，實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于本反應(yīng)，加入 1.1%的氯化鈉+〇. 1%的聚合氯化鋁是最佳的。
[0008] 羧化反應(yīng)中，采用NaHC〇3提供C02,實(shí)際上，有多種物質(zhì)可以提供C02,但是，通過大 量實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，對(duì)于本發(fā)明，使用NaHC0 3是最佳的。由于加入NaHC03會(huì)使反應(yīng)液的pH升 高，而適宜的PH，對(duì)微生物催化反應(yīng)致關(guān)重要，所以，不能一次加入，必須采用流加方式加入 NaHC03。然而，即使流加 NaHC03，反應(yīng)液的pH仍然升高，所以，還必須采取措施，維持反應(yīng)液處 于適宜的PH，使微生物能夠正常發(fā)揮生物催化作用。通過大量實(shí)驗(yàn)表明，流加鹽酸水溶液是 適宜的方法，調(diào)節(jié)NaHC0 3與鹽酸水溶液的流加速率，可以使溶液的pH處于最佳范圍，使生物 催化反應(yīng)正常進(jìn)行。
[0009] 可以明顯看出，本發(fā)明所涉及的微生物菌株選擇、表面活性劑選擇、破乳劑選擇、 C02供體選擇，還有反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)pH，底物濃度，生物催化反應(yīng)液成分確定等，眾 多因素均需考慮，并且，它們相互影響。特別是，需要從實(shí)驗(yàn)室小試、中試，直到工業(yè)規(guī)模反 應(yīng)，更是大幅度增加了工作難度、工作量。所以，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)至管重要，如此多的因素，生物催 化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)理論分析和實(shí)驗(yàn)工作量巨大。
[0010] 培養(yǎng)介質(zhì)： 1、種子培養(yǎng)基成份為：酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，pH6.8;配 制固體培養(yǎng)基時(shí)添加15g/L的瓊脂粉。
[0011] 2、培養(yǎng)液成份:蛋白胨1.1-1.5 g/L，酵母浸膏6-8 g/L，葡萄糖22-25 g/L，麥芽浸 膏15-20g，硫酸銨0.2-0.25g/L，硫酸鎂0.3-0.4g/L，磷酸二氧鉀1.8-2.3g/L;固體培養(yǎng)基成 份：在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉；pH6.5。
[0012] 3、固體培養(yǎng)基成份：在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。
[0013]微生物發(fā)酵液制備。釀酒酵母DSM-3797經(jīng)斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液;發(fā) 酵罐加入培養(yǎng)液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至27-28Γ，將釀酒酵母種子液接種至發(fā)酵 罐，接種比例為6-6.5 %，通氣比為0.5-0.7VAV·分鐘），27-28°C培養(yǎng)40-44小時(shí)，發(fā)酵液中 濕酵母細(xì)胞濃度為96-99g/L，此發(fā)酵液用作生物催化反應(yīng)催化劑。
[0014] 用HPLC測(cè)產(chǎn)品收率及純度，C18柱，紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)254nm，流動(dòng)相為pH3的磷酸緩 沖液：甲醇=90:10。
[0015] 生物催化反應(yīng):發(fā)酵罐，即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底物5，6， 7- 3羥基-2-苯基-色烯-4-酮，使?jié)舛葹?0-95g/L，補(bǔ)加以下成份，使?jié)舛葹椋浩狡郊? (PerogolO, 15個(gè)單位的氧乙稀與油醇的縮合物）19-20g/L，木糖45-50g/L、鹿糖25-28g/L， 121°C高壓滅菌30分鐘;冷卻至35-37 °C時(shí)，攪拌乳化，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為46-49 小時(shí)；反應(yīng)開始時(shí)，立即流加濃度為4.5 %的NaHC03水溶液，同時(shí)流加濃度為0.9 %的鹽酸水 溶液，調(diào)節(jié)NaHC03與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.6-6.8，所加入的物料均經(jīng)過滅菌處 理;通氣比為0.7-0.75V/V·分鐘，即每分鐘通氣量為0.7-0.75倍反應(yīng)液體積，反應(yīng)結(jié)束后， 破乳，用ο. 2倍反應(yīng)液體積乙酸乙酯萃取反應(yīng)液萃取3次，合并有機(jī)相，有機(jī)相蒸出乙酸乙 酯，得到產(chǎn)物2_(5，6，7- 3羥基-4-氧代-4H-色烯-2-基)-苯酸，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率98.2-99.6 %，產(chǎn) 品收率96.2-97.8%。
[0016] 實(shí)施例1 培養(yǎng)液成份:蛋白胨1.1-1.5 g/L，酵母浸膏6-8 g/L，葡萄糖22-25 g/L，麥芽浸膏15-20g，硫酸銨0 · 2-0 · 25g/L，硫酸鎂0 · 3-0 · 4g/L，磷酸二氧鉀 1 · 8-2 · 3g/L; pH6 · 5。
[0017] 微生物發(fā)酵液制備。釀酒酵母DSM-3797經(jīng)斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液;發(fā) 酵罐加入培養(yǎng)液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至27-28Γ，將釀酒酵母種子液接種至發(fā)酵 罐，接種比例為6-6.5 %，通氣比為0.5-0.7VAV·分鐘），27-28°C培養(yǎng)40-44小時(shí)，發(fā)酵液中 濕酵母細(xì)胞濃度為96-99g/L，此發(fā)酵液用作生物催化反應(yīng)催化劑。
[0018] 生物催化反應(yīng)：15L發(fā)酵罐，即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底物 5，6，7- 3羥基-2-苯基-色烯-4-酮，使?jié)舛葹?0-95g/L，補(bǔ)加以下成份，使?jié)舛葹?平平加 0 (PerogolO, 15個(gè)單位的氧乙稀與油醇的縮合物）19-20g/L，木糖45-50g/L、鹿糖25-28g/L， 121°C高壓滅菌30分鐘;冷卻至35-37 °C時(shí)，攪拌乳化，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為46-49 小時(shí)；反應(yīng)開始時(shí)，立即流加濃度為4.5 %的NaHC03水溶液，同時(shí)流加濃度為0.9 %的鹽酸水 溶液，調(diào)節(jié)NaHC03與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.6-6.8，所加入的物料均經(jīng)過滅菌處 理;通氣比為0.7-0.75V/V·分鐘，即每分鐘通氣量為0.7-0.75倍反應(yīng)液體積，反應(yīng)結(jié)束后， 破乳，用0.2倍反應(yīng)液體積乙酸乙酯萃取反應(yīng)液萃取3次，合并有機(jī)相，有機(jī)相蒸出乙酸乙 酯，得到產(chǎn)物2_(5，6，7- 3羥基-4-氧代-4H-色烯-2-基)-苯酸，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率98.2-99.6 %，產(chǎn) 品收率96.2-97.8%。
[0019] 實(shí)施例2 培養(yǎng)液成份及微生物發(fā)酵液制備同實(shí)施例1。
[0020] 生物催化反應(yīng):150L發(fā)酵罐，即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底物 5，6，7- 3羥基-2-苯基-色烯-4-酮，使?jié)舛葹?0-95g/L，補(bǔ)加以下成份，使?jié)舛葹?平平加0 (PerogolO, 15個(gè)單位的氧乙稀與油醇的縮合物）19-20g/L，木糖45-50g/L、鹿糖25-28g/L， 121°C高壓滅菌30分鐘;冷卻至35-37 °C時(shí)，攪拌乳化，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為46-49 小時(shí)；反應(yīng)開始時(shí)，立即流加濃度為4.5 %的NaHC03水溶液，同時(shí)流加濃度為0.9 %的鹽酸水 溶液，調(diào)節(jié)NaHC03與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.6-6.8，所加入的物料均經(jīng)過滅菌處 理;通氣比為0.7-0.75V/V·分鐘，即每分鐘通氣量為0.7-0.75倍反應(yīng)液體積，反應(yīng)結(jié)束后， 破乳，分別用0.2倍、0.15倍、0.1倍反應(yīng)液體積的乙酸乙酯萃取反應(yīng)液各萃取1次，合并有機(jī) 相，蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物2-( 5，6，7- 3羥基-4-氧代-4H-色烯-2-基)-苯酸，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率 98.2%，產(chǎn)品收率96.2%。
[0021] 實(shí)施例3 培養(yǎng)液成份及微生物發(fā)酵液制備同實(shí)施例1。
[0022] 生物催化反應(yīng)：1000L發(fā)酵罐，即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底 物5，6，7- 3羥基-2-苯基-色烯-4-酮，使?jié)舛葹?0-95g/L，補(bǔ)加以下成份，使?jié)舛葹?平平加 0(Perogol0,15個(gè)單位的氧乙稀與油醇的縮合物）19-20g/L，木糖45-50g/L、鹿糖25-28g/L， 121°C高壓滅菌30分鐘;冷卻至35-37 °C時(shí)，攪拌乳化，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為46-49 小時(shí)；反應(yīng)開始時(shí)，立即流加濃度為4.5 %的NaHC03水溶液，同時(shí)流加濃度為0.9 %的鹽酸水 溶液，調(diào)節(jié)NaHC03與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.6-6.8，所加入的物料均經(jīng)過滅菌處 理;通氣比為0.7-0.75V/V·分鐘，即每分鐘通氣量為0.7-0.75倍反應(yīng)液體積，反應(yīng)結(jié)束后， 破乳，分別用0.2倍、0.15倍、0.1倍反應(yīng)液體積的乙酸乙酯萃取反應(yīng)液各萃取1次，合并有機(jī) 相，蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物2-( 5，6，7- 3羥基-4-氧代-4H-色烯-2-基)-苯酸，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率 98.9%，產(chǎn)品收率97.2%。
[0023] 實(shí)施例4 培養(yǎng)液成份及微生物發(fā)酵液制備同實(shí)施例1。
[0024] 生物催化反應(yīng):15000L發(fā)酵罐，即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底 物5，6，7- 3羥基-2-苯基-色烯-4-酮，使?jié)舛葹?0-95g/L，補(bǔ)加以下成份，使?jié)舛葹?平平加 0(Perogol0,15個(gè)單位的氧乙稀與油醇的縮合物）19-20g/L，木糖45-50g/L、鹿糖25-28g/L， 121°C高壓滅菌30分鐘;冷卻至35-37 °C時(shí)，攪拌乳化，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為46-49 小時(shí)；反應(yīng)開始時(shí)，立即流加濃度為4.5 %的NaHC03水溶液，同時(shí)流加濃度為0.9 %的鹽酸水 溶液，調(diào)節(jié)NaHC03與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.6-6.8，所加入的物料均經(jīng)過滅菌處 理;通氣比為0.7-0.75V/V·分鐘，即每分鐘通氣量為0.7-0.75倍反應(yīng)液體積，反應(yīng)結(jié)束后， 破乳，用逆流萃取機(jī)萃取，萃取液為乙酸乙酯，蒸出有機(jī)相的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到 產(chǎn)物2-(5，6，7- 3羥基-4-氧代-4H-色烯-2-基）-苯酸，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率99.6 %，產(chǎn)品收率 97.8%〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種釀酒酵母生物催化制備2-(5，6,7- 3羥基-4-氧代-4H-色烯-2-基)-苯酸的方 法，其特征在于釀酒酵母發(fā)酵液中加入底物5，6，7- 3羥基-2-苯基-色烯-4-酮，使?jié)舛葹?85-90g/L，補(bǔ)加以下成份，使?jié)舛葹?支鏈化13碳格爾伯特醇聚氧乙烯醚25-28g/L，葡萄糖 22-24g/L、麥芽糖22-25g/L，121°C高壓滅菌30分鐘;冷卻至33-35 °C時(shí)，攪拌乳化，進(jìn)行生物 催化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為45-49小時(shí)；反應(yīng)開始時(shí)，立即流加濃度為4.5 %的NaHCO3水溶液，同 時(shí)流加濃度為0.9 %的鹽酸水溶液，調(diào)節(jié)NaHCO3與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.4-6.6， 所加入的物料均經(jīng)過滅菌處理;通氣比為0.6-0.65V/V·分鐘，即每分鐘通氣量為0.6-0.65 倍反應(yīng)液體積，反應(yīng)結(jié)束后，破乳，用乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，有機(jī)相蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物 2-(5，6，7- 3羥基-4-氧代-4H-色烯-2-基)-苯酸，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率98.1 -99.4%，產(chǎn)品收率96.0_ 97.5 % ;所述發(fā)酵液由培養(yǎng)液發(fā)酵微生物得到。2. 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于釀酒酵母發(fā)酵液制備過程如下：釀酒酵母經(jīng)斜 面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液;發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至24-25°C，將釀酒酵母種子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為6-6.5%，通氣比為0.5-0.7V/(V·分 鐘），24-25°C培養(yǎng)46-50小時(shí)，發(fā)酵液中濕酵母細(xì)胞濃度為93-97g/L，此發(fā)酵液用作生物催 化反應(yīng)催化劑;培養(yǎng)液成份:蛋白胨1.5-2 g/L，酵母浸膏8-10 g/L，葡萄糖18-22 g/L，麥芽 浸膏25-30 g，硫酸銨0 · 2-0 · 25g/L，硫酸鎂0 · 3-0 · 4g/L，磷酸二氧鉀 1 · 8-2 · 3g/L; pH6 · 8。
【文檔編號(hào)】C12P17/06GK105907809SQ201610464858
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年6月24日
【發(fā)明人】孫青華, 張媛媛, 劉均洪
【申請(qǐng)人】青島科技大學(xué)