一種高純度姬松茸多糖的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高純度姬松茸多糖的制備方法，屬于多糖制備技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將姬松茸粉碎，用氫氧化鈉進(jìn)行預(yù)處理后，加入混合酶液，反應(yīng)后將反應(yīng)液滅菌滅酶，離心得姬松茸提取液，加入聚丙烯酰胺、硫酸亞鐵等除雜除色，再置于二氧化碳超臨界萃取儀中進(jìn)行萃取，得混合溶液，加入馬來酸反應(yīng)，過濾得到濾液，再加入四乙基氫氧化銨反應(yīng)，并用液氮使溶液降溫，經(jīng)過濾、減壓蒸餾、干燥得到高純度姬松茸多糖。實(shí)例證明，本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)條件溫和，整個(gè)制備過程中無任何有機(jī)溶劑的加入，使得最終制得的姬松茸多糖得率達(dá)到了90％以上，純度不低于95％，為姬松茸多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域和保健品行業(yè)中的工業(yè)化開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種高純度姬松茸多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明公開了一種高純度姬松茸多糖的制備方法，屬于多糖制備技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]姬松茸又名巴西蘑菇，是一種在我國(guó)待開發(fā)的藥食兼用菌，它原產(chǎn)于北美南部的巴西、秘魯?shù)鹊?。?00克姬松茸干菇中含有蛋白質(zhì)占40%?45%、糖類占38%?45%、粗脂肪占3%?4%、粗纖維6.73%及其豐富的維生素和微量元素，作為食品營(yíng)養(yǎng)豐富。姬松茸含有豐富的生物活性物質(zhì)，可以作為醫(yī)藥和保健品使用;主要生物活性物質(zhì)包括多糖類、甾醇類、核酸類、不飽和脂肪酸、食物纖維等，據(jù)日本報(bào)道，姬松茸的抗癌作用明顯優(yōu)于其他14種有抗癌作用的大型真菌，位居真菌抗癌首位。因此，藥用價(jià)值受到美食、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)界的極大關(guān)注。
[0003]姬松茸多糖是從姬松茸子實(shí)體中提取的有效活性成分，其氣味芳香，功效顯著，有對(duì)機(jī)體有增強(qiáng)精力的功效，并能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，具有抗腫瘤作用，在那些無法進(jìn)行手術(shù)也無法使用放射或化學(xué)療法的情況下，它也同樣有效，姬松茸及其提取物還可以迅速有效的減輕化學(xué)療法等傳統(tǒng)治療方法所帶來的副作用。另外，還具有降血糖、改善糖尿病、降膽固醇、延緩動(dòng)脈硬化的作用。
[0004]姬松茸多糖除可作為抗病毒性疾病、抗寄生蟲、抗排斥和防治腫瘤方面的治療藥劑外，還可作為免疫增強(qiáng)劑提高體液免疫水平，其萃取物能顯著促進(jìn)白細(xì)胞介素-6 (IL-6)和干擾素-y (IFN- γ )水平，減少體外和體內(nèi)IL-4水平，從而對(duì)免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。值得一提的是，姬松茸多糖能夠作為免疫佐劑顯著增強(qiáng)疫苗的效果，具有相當(dāng)廣闊的應(yīng)用前景。
[0005]目前，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上姬松茸多糖主要為含量10?50%的規(guī)格，提取方法多采用熱水浸提法提取(主要問題是提取效率低、穩(wěn)定性差)，而多糖純化方法通常采用乙醇沉淀法、Se vgag法，主要缺點(diǎn)是有機(jī)溶劑引入和殘留的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題:針對(duì)目前傳統(tǒng)方法在制備姬松茸多糖過程中，熱水浸提法提取效率低，穩(wěn)定性差，而乙醇沉淀法、Sevgag法使用大量的有機(jī)溶劑，使得產(chǎn)物中溶劑殘留量較大的現(xiàn)狀，提供了一種高純度姬松茸多糖的制備方法。該方法將姬松茸粉碎，用氫氧化鈉進(jìn)行預(yù)處理后，加入混合酶液，反應(yīng)后將反應(yīng)液滅菌滅酶，離心得姬松茸提取液，加入聚丙烯酰胺、硫酸亞鐵等除雜除色，再置于二氧化碳超臨界萃取儀中進(jìn)行萃取，得混合溶液，加入馬來酸反應(yīng)，過濾得到濾液，再加入四乙基氫氧化銨反應(yīng)，并用液氮使溶液降溫，經(jīng)過濾、減壓蒸餾、干燥得到高純度姬松茸多糖。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)條件溫和，整個(gè)制備過程中無任何有機(jī)溶劑的加入，使得最終制得的姬松茸多糖得率達(dá)到了90%以上，純度不低于95%，為姬松茸多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域和保健品行業(yè)中的工業(yè)化開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
[0007 ]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
(I)依次稱取10?15g蔗糖、2?4g硝酸鈉、I?3gMgS04.7^0、I?3gKCl、0.8?1.0gFeSO4.7H20、10?20g瓊脂加入到培養(yǎng)皿中，再加入800?100mL去離子水，攪拌10?20min，制成培養(yǎng)基，培養(yǎng)菌種；
(2)依次接種2?4株木霉、2?4株黑曲霉、2?4株芽孢桿菌到培養(yǎng)基上，在38?40°C，用搖床振蕩培養(yǎng)12?14h，將培養(yǎng)液在7000?9000r/min下離心30?40min，棄去上清液，得到混合菌種；
(3)移取10?20%上述混合菌種加入到發(fā)酵罐中，再依次加入5?1g葡萄糖、I?3g牛肉膏、200?300mLpH為6.8?7.0磷酸鹽緩沖溶液，攪拌10?2011^11，在50?60°(:下，用搖床振蕩培養(yǎng)48?50h，將培養(yǎng)液在6000?8000r/min下離心20?30min，棄去下層雜質(zhì)，得到混合酶液；
(4)稱取10?20g干姬松茸，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，然后將姬松茸粉末加入到燒杯中，將燒杯置于水浴鍋中，控制溫度在45?55°C，向燒杯中加入200?300mL0.01mol/L氫氧化鈉溶液，攪拌I?2h，再加入上述混合酶液，攪拌反應(yīng)3?4h，將溫度升高至90?100 0C，攪拌10?20min，過濾，得到濾液，即姬松茸提取液；
(5 )向上述姬松鸞提取液中依次加入I?3g聚丙稀酰胺、I?3g硫酸亞鐵、I?3g活性炭，攪拌10?20min，過濾，得到濾液，將濾液置于二氧化碳超臨界萃取儀中，控制萃取壓力為20?30MPa，萃取溫度為45?55°C，CO2的流量為25?35kg/h，萃取20?30min，得到混合溶液；
(6)將上述混合溶液加入到燒杯中，將燒杯置于冰水浴中，控制溫度在O?5°C，向上述混合溶液中加入I?3g馬來酸，攪拌反應(yīng)I?2h，過濾，得到濾液，向?yàn)V液中加入2?4g四乙基氫氧化銨，攪拌反應(yīng)I?2h，將0.1?0.3L液氮噴淋到燒杯上，使燒杯溫度降至-30?-20 °C，攪拌10?20min，過濾，得濾液，即姬松茸多糖溶液，將姬松茸多糖溶液進(jìn)行減壓蒸餾得到白色固體，將白色固體置于95?105 °C烘箱內(nèi)干燥2?3h，得到白色粉末，即一種高純度姬松茸多糖。
[0008]本發(fā)明的應(yīng)用方法是:將本發(fā)明制得的高純度姬松茸多糖通過醫(yī)用制囊機(jī)制成姬松茸多糖膠囊，其中每個(gè)膠囊中姬松茸多糖中含量為0.1?0.15g，食用時(shí)，配以溫水口服即可，建議每日早晚食用，每次食用I?3粒，連續(xù)食用7?14天，可以對(duì)人體免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，尤其是癌癥患者，抗癌效果極其顯著，可降低75%以上癌癥復(fù)發(fā)率。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)條件溫和，在整個(gè)制備過程中無任何有機(jī)溶劑的加入，使得最終制得的姬松茸多糖得率達(dá)到了90%以上，純度不低于95%;
(2)本發(fā)明制得的姬松茸多糖質(zhì)量達(dá)標(biāo)，為姬松茸多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域和保健品行業(yè)中的工業(yè)化開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0010]首先依次稱取10?15g蔗糖、2?4g硝酸鈉、I?3gMgS04.7H20、I?3gKCl、0.8?
1.0gFeSO4.7H20、10?20g瓊脂加入到培養(yǎng)皿中，再加入800?100mL去離子水，攪拌10?20min，制成培養(yǎng)基，培養(yǎng)菌種;然后依次接種2?4株木霉、2?4株黑曲霉、2?4株芽孢桿菌到培養(yǎng)基上，在38?40°C，用搖床振蕩培養(yǎng)12?14h，將培養(yǎng)液在7000?9000r/min下離心30?40min，棄去上清液，得到混合菌種;接下來移取10?20%上述混合菌種加入到發(fā)酵罐中，再依次加入5?1g葡萄糖、I?3g牛肉膏、200?300mLpH為6.8?7.0磷酸鹽緩沖溶液，攪拌10?20min，在50?60°C下，用搖床振蕩培養(yǎng)48?50h，將培養(yǎng)液在6000?8000r/min下離心20?30min，棄去下層雜質(zhì)，得到混合酶液;然后稱取10?20g干姬松茸，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，然后將姬松茸粉末加入到燒杯中，將燒杯置于水浴鍋中，控制溫度在45?55°C，向燒杯中加入200?300mL0.01mol/L氫氧化鈉溶液，攪拌I?2h，再加入上述混合酶液，攪拌反應(yīng)3?4h，將溫度升高至90?100°C，攪拌10?20min，過濾，得到濾液，即姬松茸提取液;之后向上述姬松鸞提取液中依次加入I?3g聚丙稀酰胺、I?3g硫酸亞鐵、I?3g活性炭，攪拌10?20min，過濾，得到濾液，將濾液置于二氧化碳超臨界萃取儀中，控制萃取壓力為20?30MPa，萃取溫度為45?55°C，C02的流量為25?35kg/h，萃取20?30min，得到混合溶液；最后將上述混合溶液加入到燒杯中，將燒杯置于冰水浴中，控制溫度在O?5°C，向上述混合溶液中加入I?3g馬來酸，攪拌反應(yīng)I?2h，過濾，得到濾液，向?yàn)V液中加入2?4g四乙基氫氧化銨，攪拌反應(yīng)I?2h，將0.1?0.3L液氮噴淋到燒杯上，使燒杯溫度降至-30?-20 °C，攪拌10?20min，過濾，得濾液，即姬松茸多糖溶液，將姬松茸多糖溶液進(jìn)行減壓蒸餾得到白色固體，將白色固體置于95?105 °C烘箱內(nèi)干燥2?3h，得到白色粉末，即一種高純度姬松茸多糖。
[0011]實(shí)例I
首先依次稱取1g蔗糖、2g硝酸鈉、IgMgSO4.7H20、IgKCl、0.8gFeS04.7H20、10g瓊脂加入到培養(yǎng)皿中，再加入800mL去離子水，攪拌1min，制成培養(yǎng)基，培養(yǎng)菌種;然后依次接種2株木霉、2株黑曲霉、2株芽孢桿菌到培養(yǎng)基上，在38 °C，用搖床振蕩培養(yǎng)12h，將培養(yǎng)液在7000r/min下離心30min，棄去上清液，得到混合菌種;接下來移取10%上述混合菌種加入到發(fā)酵罐中，再依次加入5g葡萄糖、Ig牛肉膏、200mLpH為6.8磷酸鹽緩沖溶液，攪拌10?20min，在50°C下，用搖床振蕩培養(yǎng)48h，將培養(yǎng)液在6000r/min下離心20min，棄去下層雜質(zhì)，得到混合酶液;然后稱取1g干姬松茸，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，然后將姬松茸粉末加入到燒杯中，將燒杯置于水浴鍋中，控制溫度在45°C，向燒杯中加入200mL0.01mol/L氫氧化鈉溶液，攪拌lh，再加入上述混合酶液，攪拌反應(yīng)3h，將溫度升高至90°C，攪拌lOmin，過濾，得到濾液，即姬松茸提取液;之后向上述姬松茸提取液中依次加入Ig聚丙烯酰胺、Ig硫酸亞鐵、Ig活性炭，攪拌lOmin，過濾，得到濾液，將濾液置于二氧化碳超臨界萃取儀中，控制萃取壓力為20MPa，萃取溫度為45 V，⑶2的流量為25kg/h，萃取20min，得到混合溶液;最后將上述混合溶液加入到燒杯中，將燒杯置于冰水浴中，控制溫度在0°C，向上述混合溶液中加入Ig馬來酸，攪拌反應(yīng)lh，過濾，得到濾液，向?yàn)V液中加入2g四乙基氫氧化銨，攪拌反應(yīng)lh，將0.1L液氮噴淋到燒杯上，使燒杯溫度降至-300C，攪拌1min，過濾，得濾液，即姬松茸多糖溶液，將姬松茸多糖溶液進(jìn)行減壓蒸餾得到白色固體，將白色固體置于95°C烘箱內(nèi)干燥2h，得到白色粉末，即一種高純度姬松茸多糖。
[0012]本實(shí)例操作簡(jiǎn)便，使用時(shí)，將本發(fā)明制得的高純度姬松茸多糖通過醫(yī)用制囊機(jī)制成姬松茸多糖膠囊，其中每個(gè)膠囊中姬松茸多糖中含量為0.lg，食用時(shí)，配以溫水口服即可，建議每日早晚食用，每次食用I粒，連續(xù)食用7天，可以對(duì)人體免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，尤其是癌癥患者，抗癌效果極其顯著，可降低75%癌癥復(fù)發(fā)率。
[0013]實(shí)例2
首先依次稱取 13g蔗糖、3g硝酸鈉、2gMgS04.7H20、2gKCl、0.9gFeS04.7H20、15g瓊脂加入到培養(yǎng)皿中，再加入900mL去離子水，攪拌15min，制成培養(yǎng)基，培養(yǎng)菌種;然后依次接種3株木霉、3株黑曲霉、3株芽孢桿菌到培養(yǎng)基上，在39 °C，用搖床振蕩培養(yǎng)13h，將培養(yǎng)液在8000r/min下離心35min，棄去上清液，得到混合菌種;接下來移取15%上述混合菌種加入到發(fā)酵罐中，再依次加入8g葡萄糖、2g牛肉膏、250mLpH為6.9磷酸鹽緩沖溶液，攪拌15min，在55°C下，用搖床振蕩培養(yǎng)49h，將培養(yǎng)液在7000r/min下離心25min，棄去下層雜質(zhì)，得到混合酶液;然后稱取15g干姬松茸，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，然后將姬松茸粉末加入到燒杯中，將燒杯置于水浴鍋中，控制溫度在50°C，向燒杯中加入250mL0.01mol/L氫氧化鈉溶液，攪拌1.5h，再加入上述混合酶液，攪拌反應(yīng)3.5h，將溫度升高至95°C，攪拌15min，過濾，得到濾液，即姬松茸提取液;之后向上述姬松茸提取液中依次加入2g聚丙烯酰胺、2g硫酸亞鐵、2g活性炭，攪拌15min，過濾，得到濾液，將濾液置于二氧化碳超臨界萃取儀中，控制萃取壓力為25MPa，萃取溫度為50°C，⑶2的流量為30kg/h，萃取25min，得到混合溶液;最后將上述混合溶液加入到燒杯中，將燒杯置于冰水浴中，控制溫度在3°C，向上述混合溶液中加入2g馬來酸，攪拌反應(yīng)1.5h，過濾，得到濾液，向?yàn)V液中加入3g四乙基氫氧化銨，攪拌反應(yīng)1.5h，將0.2L液氮噴淋到燒杯上，使燒杯溫度降至_25°C，攪拌15min，過濾，得濾液，即姬松茸多糖溶液，將姬松茸多糖溶液進(jìn)行減壓蒸餾得到白色固體，將白色固體置于100°C烘箱內(nèi)干燥2.5h，得到白色粉末，即一種高純度姬松茸多糖。
[0014]本實(shí)例操作簡(jiǎn)便，使用時(shí)，將本發(fā)明制得的高純度姬松茸多糖通過醫(yī)用制囊機(jī)制成姬松茸多糖膠囊，其中每個(gè)膠囊中姬松茸多糖中含量為0.13g，食用時(shí)，配以溫水口服即可，建議每日早晚食用，每次食用2粒，連續(xù)食用10天，可以對(duì)人體免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，尤其是癌癥患者，抗癌效果極其顯著，可降低78%癌癥復(fù)發(fā)率。
[0015]實(shí)例3
首先依次稱取 15g蔗糖、4g硝酸鈉、3gMgS04.7H20、3gKCl、l.0gFeSO4.7H20、20g瓊脂加入到培養(yǎng)皿中，再加入100mL去離子水，攪拌20min，制成培養(yǎng)基，培養(yǎng)菌種;然后依次接種4株木霉、4株黑曲霉、4株芽孢桿菌到培養(yǎng)基上，在40 0C，用搖床振蕩培養(yǎng)14h，將培養(yǎng)液在9000r/min下離心40min，棄去上清液，得到混合菌種;接下來移取20%上述混合菌種加入到發(fā)酵罐中，再依次加入1g葡萄糖、3g牛肉膏、300mLpH為7.0磷酸鹽緩沖溶液，攪拌20min，在60°C下，用搖床振蕩培養(yǎng)50h，將培養(yǎng)液在8000r/min下離心30min，棄去下層雜質(zhì)，得到混合酶液;然后稱取20g干姬松茸，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，然后將姬松茸粉末加入到燒杯中，將燒杯置于水浴鍋中，控制溫度在55°C，向燒杯中加入300mL0.0Imo 1/L氫氧化鈉溶液，攪拌2h，再加入上述混合酶液，攪拌反應(yīng)4h，將溫度升高至100°C，攪拌20min，過濾，得到濾液，即姬松茸提取液;之后向上述姬松茸提取液中依次加入3g聚丙烯酰胺、3g硫酸亞鐵、3g活性炭，攪拌20min，過濾，得到濾液，將濾液置于二氧化碳超臨界萃取儀中，控制萃取壓力為30MPa，萃取溫度為55°C，⑶2的流量為35kg/h，萃取30min，得到混合溶液;最后將上述混合溶液加入到燒杯中，將燒杯置于冰水浴中，控制溫度在5°C，向上述混合溶液中加入3g馬來酸，攪拌反應(yīng)2h，過濾，得到濾液，向?yàn)V液中加入4g四乙基氫氧化銨，攪拌反應(yīng)2h，將0.3L液氮噴淋到燒杯上，使燒杯溫度降至_20°C，攪拌20min，過濾，得濾液，即姬松茸多糖溶液，將姬松茸多糖溶液進(jìn)行減壓蒸餾得到白色固體，將白色固體置于105°C烘箱內(nèi)干燥3h，得到白色粉末，SP一種高純度姬松茸多糖。
[0016]本實(shí)例操作簡(jiǎn)便，使用時(shí)，將本發(fā)明制得的高純度姬松茸多糖通過醫(yī)用制囊機(jī)制成姬松茸多糖膠囊，其中每個(gè)膠囊中姬松茸多糖中含量為0.15g，食用時(shí)，配以溫水口服即可，建議每日早晚食用，每次食用3粒，連續(xù)食用14天，可以對(duì)人體免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，尤其是癌癥患者，抗癌效果極其顯著，可降低80%癌癥復(fù)發(fā)率。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種高純度姬松茸多糖的制備方法，其特征在于具體制備步驟為: (1)依次稱取10?15g蔗糖、2?4g硝酸鈉、I?3gMgS04.7H20、I?3gKCl、0.8?1.0gFeSO4.7H20、10?20g瓊脂加入到培養(yǎng)皿中，再加入800?100mL去離子水，攪拌10?20min，制成培養(yǎng)基，培養(yǎng)菌種； (2)依次接種2?4株木霉、2?4株黑曲霉、2?4株芽孢桿菌到培養(yǎng)基上，在38?40°C，用搖床振蕩培養(yǎng)12?14h，將培養(yǎng)液在7000?9000r/min下離心30?40min，棄去上清液，得到混合菌種； (3)移取10?20%上述混合菌種加入到發(fā)酵罐中，再依次加入5?1g葡萄糖、I?3g牛肉膏、200?300mLpH為6.8?7.0磷酸鹽緩沖溶液，攪拌10?2011^11，在50?60°(:下，用搖床振蕩培養(yǎng)48?50h，將培養(yǎng)液在6000?8000r/min下離心20?30min，棄去下層雜質(zhì)，得到混合酶液； (4)稱取10?20g干姬松茸，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，然后將姬松茸粉末加入到燒杯中，將燒杯置于水浴鍋中，控制溫度在45?55°C，向燒杯中加入200?300mL0.01mol/L氫氧化鈉溶液，攪拌I?2h，再加入上述混合酶液，攪拌反應(yīng)3?4h，將溫度升高至90?100 0C，攪拌10?20min，過濾，得到濾液，即姬松茸提取液； (5)向上述姬松鸞提取液中依次加入I?3g聚丙稀酰胺、I?3g硫酸亞鐵、I?3g活性炭，攪拌10?20min，過濾，得到濾液，將濾液置于二氧化碳超臨界萃取儀中，控制萃取壓力為20?30MPa，萃取溫度為45?55°C，CO2的流量為25?35kg/h，萃取20?30min，得到混合溶液； (6)將上述混合溶液加入到燒杯中，將燒杯置于冰水浴中，控制溫度在O?5°C，向上述混合溶液中加入I?3g馬來酸，攪拌反應(yīng)I?2h，過濾，得到濾液，向?yàn)V液中加入2?4g四乙基氫氧化銨，攪拌反應(yīng)I?2h，將0.1?0.3L液氮噴淋到燒杯上，使燒杯溫度降至-30?-20 °C，攪拌10?20min，過濾，得濾液，即姬松茸多糖溶液，將姬松茸多糖溶液進(jìn)行減壓蒸餾得到白色固體，將白色固體置于95?105 °C烘箱內(nèi)干燥2?3h，得到白色粉末，即一種高純度姬松茸多糖。
【文檔編號(hào)】C12R1/885GK105907831SQ201610484563
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年6月28日
【發(fā)明人】郭迎慶, 張明, 孟浩影
【申請(qǐng)人】郭迎慶