一種阿膠中驢、馬、牛和豬源性巢式熒光pcr檢測引物、探針、試劑盒、檢測方法及應用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種阿膠中驢、馬、牛和豬源性巢式熒光PCR檢測引物、探針、試劑盒、檢測方法及應用，涉及分子生物學技術領域，利用本發(fā)明的引物、探針組合物以及多重巢式熒光PCR檢測試劑盒可以快速鑒定出阿膠中驢、馬、牛和豬源成分。本發(fā)明針對阿膠中微量DNA或降解DNA，通過巢式PCR及小片段擴增技術，大大提高了引物及探針有效識別靶點的幾率，因此大大提高檢測準確性和靈敏度；兩步PCR擴增在同一體系進行，具有閉管操作、污染率低、檢測靈敏度高、特異性好、準確度高、通量大等有益效果。
【專利說明】
一種阿膠中驢、馬、牛和豬源性巢式熒光PCR檢測引物、探針、 試劑盒、檢測方法及應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種膠類中藥動物源性檢測技術領域，具體涉及一種阿膠中驢、馬、牛 和豬源性巢式熒光PCR檢測引物、探針、試劑盒、檢測方法及應用，屬于分子生物學技術領 域。
【背景技術】
[0002] 阿膠為馬科動物驢的皮，經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠，原產(chǎn)自山東省泛東阿區(qū)，始 載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，與人參、鹿茸并稱為"滋補三寶"，至今已有近三千年歷史。阿膠補血圣 藥，味甘平，入肺、肝、腎經(jīng)，具有補血止血、滋陰潤燥等功效，藥食兩用，長期服用可補血養(yǎng) 血、美白養(yǎng)顏、抗衰老、抗疲勞、提高免疫力，適用人群廣泛。李時珍著《本草綱目》載："阿膠 《本經(jīng)》上品。
[0003] 2015版《中國藥典》明確規(guī)定阿膠為馬科動物驢(Equus animusL.)的皮熬制而成 的阿膠為正品阿膠。然而隨著膠類市場的不斷發(fā)展，隨著熬膠原料供應緊張和價格上漲，由 于阿膠功效獨特，市場供不應求，摻假偽劣產(chǎn)品層出不窮，并不斷被媒體曝光。這些劣質阿 膠多采用牛、馬、騾子、豬、羊等動物皮、骨、結締組織熬制，用肉眼難以鑒別，《中國藥典》通 過驢的特征態(tài)測驢源成分，已不能滿足鑒別雜皮源的需求。偽劣阿膠在臨床使用后不僅達 不到治療效果，給消費者健康安全帶來巨大隱患。為了取締和預防假冒偽劣阿膠產(chǎn)品，需要 質量監(jiān)管部門加大執(zhí)法力度，而首要前提是具備科學可靠的檢測方法。
[0004] 傳統(tǒng)的巢式PCR反應由于有2次PCR擴增，從而降低了擴增多個靶點的可能性，增加 了檢測的敏感性和可靠性，主要應用于分子生物學領域和醫(yī)學檢測研究中。而檢測結果需 要電泳及凝膠成像系統(tǒng)才能看到結果，從PCR到檢測結果出來大約需要5h，而且存在交叉污 染的可能性。由于阿膠經(jīng)過多個工序的高溫煎煮，導致線性基因組DNA斷裂成小片段，甚至 降解掉，雖然環(huán)狀線粒體DNA對高溫的耐受力相對線性基因組DNA較強，但阿膠經(jīng)過深度加 工后都會對DNA不同程度的破壞，如何解決降解DNA成為基于DNA檢測技術來檢測阿膠真?zhèn)?的一大瓶頸。中國專利（CN 104988231. A)利用半巢式PCR技術鑒別阿膠真?zhèn)?，擴增片段 700bp左右，對于深度加工的膠類中藥來講，DNA已高度破壞，大片段擴增很難成功，加上需 要兩輪PCR擴增，不但耗時、開管操作極易造成交叉污染導致假陽性及結果的不準確性所以 不能滿足阿膠真?zhèn)螜z測的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種阿膠中驢、馬、牛和豬源性巢 式熒光PCR檢測引物、探針、試劑盒、檢測方法及應用，該試劑盒檢測靈敏度高、特異性好，可 以實現(xiàn)阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分快速定性檢測;該檢測方法快速簡便、準確度高。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過以下技術方案來實現(xiàn)：
[0007] -種同時鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分的多重巢式熒光PCR檢測引物、探針 組合物，包括：
[0008] (1)多重巢式熒光PCR檢測驢、馬、牛和豬源性通用外側引物，該引物擴增片段為 202bp，其核苷酸序列如下：
[0009] 正向引物序列：5'CCTGTATCAACACATAGAAGCAATA 3'，如SEQ N0.1 所示；
[0010]反向引物序列：5，TCCTTTTACTTCTTTTAATCTTTCC3，，如SEQN0·2所示 ；
[0011] (2)多重巢式熒光PCR檢測驢、馬、牛和豬源性通用內(nèi)側引物，該內(nèi)側引物擴增片段 為143bp，其核苷酸序列如下：
[0012] 正向引物序列：5 'TATGAGTAACAAGAATTATTTCTCC 3 '，如SEQ N0· 3所示；
[0013] 反向引物序列：5'AGCCTGTGTTGGGTTAACAA3'，如SEQN0·4所示 ；
[0014] (3)驢特異性探針，其核苷酸序列如下：
[0015] 5，CAACAAAATAGACACAACCCAAAAACT 3，，如SEQ N0 · 5所示；
[0016] (4)馬特異性探針，其核苷酸序列如下：
[0017] 5 ' CAAGATAGGGATAATCCAAAAACTGTTG 3 '，如SEQ N0 · 6所示；
[0018] (5)牛特異性探針，其核苷酸序列如下：
[0019] 5，TTCTCCTTGCATAAGTCTAAGTCAGTGC 3，，如SEQ N0 · 7所示；
[0020] (6)豬特異性探針，其核苷酸序列如下：
[0021 ] 5，CCTCGCACACGCTTACATCAGTA 3，，如SEQ N0 · 8所示；
[0022]其中，所述驢、馬、牛和豬特異性探針的5'端修飾有報告基團，3'端修飾有淬滅基 團，所述報告基團為?41、冊乂、了411^、1?(^工￥5中的任一種，所述淬滅基團為0&1^71、8即1、 BHQ2中的任一種。
[0023]本發(fā)明還可以具有以下附加技術特征：
[0024]優(yōu)選的，各探針修飾的報告基團和猝滅基團為：
[0025]驢特異探針序列為：
[0026] 5，J0E-CAACAAAATAGACACAACCCAAAAACT-BHQ2 3，JnSEQN0.5K*;
[0027] 馬特異探針序列為：
[0028] 5，R0X-CAAGATAGGGATAATCCAAAAACTGTTG-BHQ2 3，JnSEQN0.6K*;
[0029] 牛特異探針序列為：
[0030] 5 'FAM-TTCTCCTTGCATAAGTCTAAGTCAGTGC-BHQ13，，如SEQ N0 · 7所示；
[0031]豬特異探針序列為：
[0032] 5，CY3-CCTCGCACACGCTTACATCAGTA-BHQ2 3，JnSEQN0.8K*。
[0033] 優(yōu)選的，還包括內(nèi)標質控體系，構建含有陽性擴增內(nèi)標DNA的重組質粒，所述內(nèi)標 質控體系包括質控體系引物、質控體系探針和質控體系序列，各核苷酸序列如下：
[0034] (1)質控體系引物：
[0035]與驢、馬、牛和豬源性成分共用一對外側引物，上游引物序列如SEQ NO. 1所示，下 游引物如SEQ N0.2所示；
[0036] (2)質控體系探針：
[0037] CntP: 5，TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT 3，，如SEQ N0 · 9所示；
[0038] (3)質控體系序列：
[0039] CCTGTATCAACACATAGAAGCAATAATGGAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT GGTGACCTC GGAAAGATTAAAAGAAGTAAAAGGA，如 SEQ NO · 10所示；
[0040] 其中，質控體系探針的5'端修飾有報告基團，3'端修飾有淬滅基團，所述報告基團 為卩厶1、冊乂、了六11^、1?(^、0￥5中的任一種，所述淬滅基團為〇31^71、8即1、8即2中的任一種。 [0041 ]進一步的，質控體系探針修飾為：5 ' CY5-TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT-BHQ23'JnSEQN0.9K*。
[0042] 本發(fā)明還提供一種同時鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分的多重巢式熒光PCR檢 測試劑盒，包括上述的同時鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分的多重巢式熒光PCR檢測引 物、探針組合物，以及阿膠DNA提取液和多重巢式熒光PCR反應所需試劑。
[0043] 優(yōu)選的，還包括驢、馬、牛和豬陽性標準品、陰性對照品和空白對照品。
[0044] 優(yōu)選的，所述多重巢式熒光PCR反應所需試劑包括:多重巢式熒光PCR反應緩沖液2 X qPCRMaster Mix，Taq熱啟動酶，鎂離子濃度2. OmM，4種dNTP的終濃度各為200μΜ，Tris-H2S04pH 9.0終濃度各為300mM，終濃度為600mM的KC1，終濃度為5M/L的甜菜堿和超純水;所 述試劑盒優(yōu)先選用20μ1的PCR擴增體系，2XqPCRMaster Mix 10μ1，外側引物對ΙΟμΜ取ΙμL， 內(nèi)側引物對1〇μΜ取ΙμL，探針用量Ρ1 (驢）、Ρ3(牛)和Ρ4(馬）終濃度0.25uM，P2豬探針終濃度 為0.5-luM，DNA用量l-50ngAU取2μ1，用雙蒸水補足20μ1。
[0045] 優(yōu)選的，所述試劑盒的PCR擴增步驟為兩步:第一步反應優(yōu)先擴增外側引物，反應 條件為95°C lOmin; 95°C 10s，70°C，35s，在此收集熒光信號，10個循環(huán);第二步反應優(yōu)先擴增 內(nèi)側引物，反應條件為95 °C 10s，60 °C，35s，在此收集熒光信號，40個循環(huán)。
[0046] 本發(fā)明另提供一種鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分多重巢式實時熒光定量PCR 檢測方法，包括以下步驟：
[0047] (1)提取待測樣品DNA;
[0048] (2)使用上述引物、探針組合物或試劑盒進行兩步PCR擴增:第一步反應驢、馬、牛 和豬源性通用外側引物優(yōu)先擴增，反應條件為95°C lOmin; 95°C 10s，70°C，35s，在此收集熒 光信號，10個循環(huán);第二步反應驢、馬、牛和豬源性通用內(nèi)側引物優(yōu)先擴增，反應條件為95 °C 10s，60°C，35s，在此收集熒光信號，40個循環(huán)；
[0049 ] (3)設立陽性對照、陰性對照及空白對照；
[0050] (4)根據(jù)不同探針熒光信號及擴增曲線Ct值來判定阿膠中是否含有驢、馬、牛和豬 源性成分。
[0051] 優(yōu)選的，所述多重巢式實時熒光定量PCR檢測是將多重巢式熒光PCR檢測驢、馬、牛 和豬源性通用內(nèi)、外側引物以及驢、馬、牛和豬特異性探針放入同一反應體系中共同擴增， 無需開管。
[0052]優(yōu)選的，所述PCR擴增為擴增階段反應需在至少5通道型號的熒光定量PCR儀上進 行，根據(jù)不同型號的定量PCR儀的不同要求可以對標記熒光素進行相應的調整。
[0053]本發(fā)明再提供上述引物、探針組合物或試劑盒在鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成 分中的應用。
[0054]本發(fā)明多重巢式實時熒光定量PCR檢測方法，具體包括以下步驟：
[0055] (1)阿膠中核酸提取利用專利CN. 201410317118阿膠DNA提取技術提取核酸DNA，在 此不再贅述。
[0056] (2)靶基因的選擇與引物設計：相比基因組而言，線粒體在組織中拷貝數(shù)高，而且 阿膠經(jīng)過深度加工后破壞程度相對小，所以優(yōu)先選用線粒體16SrDNA基因。設計驢和豬通用 外側引物及內(nèi)側引物。見表1.
[0057] (3)設計構建含有陽性擴增內(nèi)標DNA的重組質粒，并設計相應的TaqMan探針(如SEQ ID N0.9所示），其方法為:使用DNA隨機生成軟件產(chǎn)生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后 沒有出現(xiàn)與之同源的DNA片段，在這段隨機DNA序列上游5 '端連接上驢、馬、牛和豬源性通用 外側上游引物（如SEQ ID NO. 1所示），下游3'端驢、馬、牛和豬源性通用外側下游引物序列 (如SEQIDN0.2所示），從而形成lllbp的陽性擴增內(nèi)標DNA序列（如SEQIDN0.10所示），將 這段擴增內(nèi)標序列委托人工基因合成，合成片段連接載體PMD18-T，轉化感受態(tài)DH5a，質粒 提取，并測序驗證，得到能與驢、馬、牛和豬源性共用一對特異性引物(如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示），從而構建陽性內(nèi)標DNA的重組質粒。
[0058] 表1.引物探針序列
[0059]
[0060] (3)使用上述試劑盒進行巢式實時熒光PCR檢測，是將內(nèi)外側引物及探針放入同一 反應體系中共同擴增，無需開管，避免污染。PCR反應體系見表2。
[0061] 表2多重巢式熒光PCR反應體系
[0062]
[0063] (4)PCR擴增條件為兩步法:95°C lOmin;95°C 10s，70°C，35s，在此收集熒光信號，10 個循環(huán);95 °C 10s，60 °C，35s，在此收集熒光信號，40個循環(huán)。
[0064] (5)結果分析:每次試驗設立陽性對照、陰性對照及空白對照，試驗結束后打開分 析軟件，分析實驗結果，給出A Rn(第η個循環(huán)時的熒光增加值)與擴增曲線Ct值，根據(jù)不同 探針熒光信號及擴增曲線Ct值來判定阿膠中是否含有驢、馬、牛和豬源性成分。
[0065] 本發(fā)明與現(xiàn)有的檢測技術相比其有益效果在于：
[0066] 迷你巢式實時熒光多重PCR(Mini-NEST_Multiple qPCR)檢測技術原理:是一種改 良后的巢式PCR技術結合TaqMan探針法的多重實時熒光PCR檢測技術，是在一段200_250bp 左右的待擴增靶序列上設計外側、內(nèi)側兩對引物，在內(nèi)側靶序列上設計TaqMan探針，然后內(nèi) 外側引物及探針同時放入熒光定量PCR反應液中，在熒光定量PCR儀上進行熱循環(huán)反應，使 內(nèi)外側引物同時引導新鏈合成，獲得由外-外，內(nèi)-內(nèi)，內(nèi)-外，外-內(nèi)組合的聚合酶鏈式反應 產(chǎn)物，大大提高擴增效率，結合物種特異性TaqMan熒光探針，實現(xiàn)了熒光信號的放大積累與 PCR產(chǎn)物形成完全同步檢測。該技術整合了巢式PCR與熒光定量PCR的優(yōu)勢特點，不僅大大提 高了檢測靈敏度，閉管操作降低污染，提高了準確性和結果的真實可靠性。特別適用于深度 加工制品導致DNA降解及痕量DNA檢材領域研究。本發(fā)明提供了一種巢式多重熒光PCR (Multiple nested fluorescence PCR)檢測技術同時鑒別阿膠中是否含有驢源、豬源性動 物源性成分，該方法有以下優(yōu)點：
[0067] (1)鑒于阿膠為深度加工制品，DNA破壞性程度大、本發(fā)明在靶基因選擇上優(yōu)先選 用線粒體基因其原因在于拷貝數(shù)相對基因組高，環(huán)狀結構相對線性基因組更穩(wěn)定的特點， 因此大大提尚檢測靈敏度；
[0068] (2)本發(fā)明針對阿膠中微量DNA或降解DNA，采用mini -NEST-qPCR技術，通過巢式 PCR及小片段擴增技術，大大提高了引物及探針有效識別靶點的幾率，因此大大提高檢測準 確性和靈敏度。
[0069] (3)本發(fā)明采用mini-NEST-qPCR，閉管操作、污染率低、檢測靈敏度高、特異性好、 準確度高、通量大等有益效果。
【附圖說明】
[0070] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可 以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0071] 圖l，J〇E熒光修飾驢源性特異探針有擴增曲線時，說明待檢樣本檢出驢源性成分； [0072]圖2，F(xiàn)AM熒光修飾牛源性特異探針有擴增曲線時，說明待檢樣本檢出牛源性成分； [0073]圖3，CY3熒光修飾豬特異探針有擴增曲線時，說明待檢樣本檢出豬源性成分；圖4， R0X熒光修飾馬特異探針有擴增曲線時，說明待檢樣本檢出馬源性成分；
[0074]圖5, J0E熒光修飾驢源性、FAM熒光修飾牛源性特異探針和CY3熒光修飾豬特異探 針同時有擴增曲線時，說明樣本同時檢出驢、牛和豬源性成分；
[0075]圖6，J0E熒光修飾驢源性、FAM熒光修飾牛源性特異探針同時有擴增曲線時，說明 為樣本同時檢出驢和馬源性成分；
[0076]圖7，F(xiàn)AM熒光修飾牛源性特異探針和CY3熒光修飾豬特異探針同時有擴增曲線時， 說明為樣本同時檢出牛和豬源性成分；
[0077]圖8,為試劑盒驢源性檢測靈敏度擴增曲線圖，檢測限為O.lpg;
[0078] 圖9,為試劑盒豬源性檢測靈敏度擴增曲線圖，檢測限為O.lpg;
[0079] 圖10,為試劑盒馬源性檢測靈敏度擴增曲線圖，檢測限為o.lpg;
[0080] 圖11，為試劑盒牛源性檢測靈敏度擴增曲線圖，檢測限為o.lpg。
【具體實施方式】
[0081] 以下結合具體實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應該理解為對本發(fā)明的限 制。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換， 均屬于本發(fā)明的范圍。除非特別說明，本發(fā)明采用的除引物、探針之外的試劑、方法和設備 為本領域常規(guī)試劑、方法和設備。除非特別說明，本發(fā)明使用的試劑和試劑盒均為市購。
[0082] 1.下列實施例中，所用實驗材料、試劑與儀器如下：
[0083] 實驗材料：
[0084] 牛、豬、馬、驢、駱駝、牦牛、山羊、綿羊、兔、魚、雞、鴨、狗、水貂及狐貍等動物皮張或 新鮮組織，阿膠不同廠家不同生產(chǎn)批次20份，均為濟南市購。
[0085]所用試劑：
[0086] 動物組織提取試劑盒為OMEGA品牌。DNA分子量MakerDLlOOO、電泳上樣緩沖液等 PCR反應試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。引物與探針由生工生物工程(上海)有限公 司負責合成。2 XTaqMan Master Mix為DBI Bioscience品牌。DNA測序由山東省農(nóng)業(yè)科學院 生物技術中心測序中心完成。
[0087] 所用儀器:ABI 7500熒光定量PCR儀為ABI公司產(chǎn)品，Takara PCR儀為寶生物工程 (大連)有限公司產(chǎn)品。5424D型高速離心機為Eppendorf公司產(chǎn)品。
[0088] 實施例1
[0089] 基于阿膠樣品DNA提取:采用專利201410317118.7(-種從阿膠中快速提取DNA的 試劑盒及其提取方法）中公開的方法進行提取，步驟不再贅述，提取的基因組DNA經(jīng)紫外分 光光度計測定其純度和濃度。測定0D260/0D280值均為1.8-1.9左右，濃度在lOng/μΙ以上， 說明DNA純度較高，濃度適中，符合PCR擴增要求。
[0090] 1、靶基因的選擇與引物設計:相比基因組而言，線粒體在組織中拷貝數(shù)高，而且阿 膠經(jīng)過深度加工后破壞程度相對小，所以優(yōu)先選用線粒體16SrDNA基因。設計驢和豬通用外 側引物及內(nèi)側引物，擴增片段小，使引物與靶點更容易結合。引物探針序列見表1.
[0091] 2、多重巢式熒光檢測試劑盒的設計:該試劑盒包括上述驢和豬通用外側引物及內(nèi) 側引物組合物，驢和豬特異探針混合物，2 X qPCRMaster Mix(由Taq熱啟動酶、鎂離子濃度 2.5禮、4種(1犯13的終濃度各為25(^1、1^8-!12304?!19.0、甜菜堿3%和超純水組成），此外還 包括驢和豬陽性標準品、陰性對照品（其他源性DNA)和空白對照(雙蒸水）。
[0092] 使用上述試劑盒進行多重巢式實時熒光PCR檢測，是將內(nèi)外側引物及探針放入同 一反應體系中共同擴增，無需開管，避免污染。PCR反應體系20yL見表2。
[0093] 3、PCR擴增條件為兩步法:95°C lOmin; 95°C 10s，70°C，35s，在此收集熒光信號，10 個循環(huán);95 °C 10s，60 °C，35s，在此收集熒光信號，40個循環(huán)。
[0094] 4、結果分析:每次試驗設立陽性對照、陰性對照及空白對照，試驗結束后打開分析 軟件，分析實驗結果，給出A Rn(第η個循環(huán)時的熒光增加值)與擴增曲線Ct值，根據(jù)不同探 針熒光信號及擴增曲線Ct值來判定阿膠中是否含有驢、馬、豬和牛源性成分。結果見附圖1， JOE熒光修飾驢源性特異探針有擴增曲線時，說明待檢樣本檢出驢源性成分，圖2，F(xiàn)AM熒光 修飾牛源性特異探針有擴增曲線時，說明待檢樣本檢出牛源性成分，圖3，CY3熒光修飾豬特 異探針有擴增曲線時，說明待檢樣本檢出豬源性成分;圖4，R0X熒光修飾馬特異探針有擴增 曲線時，說明待檢樣本檢出馬源性成分;圖5，J0E熒光修飾驢源性、FAM熒光修飾牛源性特異 探針和CY3熒光修飾豬特異探針同時有擴增曲線時，說明樣本同時檢出驢、牛和豬源性成 分；圖6，J0E熒光修飾驢源性、FAM熒光修飾牛源性特異探針同時有擴增曲線時，說明為樣本 同時檢出驢和馬源性成分；圖7，F(xiàn)AM熒光修飾牛源性特異探針和CY3熒光修飾豬特異探針同 時有擴增曲線時，說明為樣本同時檢出牛和豬源性成分。
[0095]實施例2試劑盒特異性驗證
[0096]利用本發(fā)明提供的檢測試劑盒，分別以牛、豬、馬、驢、駱駝、牦牛、山羊、綿羊、兔、 魚、雞、鴨、水貂及狐貍等動物皮張或新鮮組織提取基因組DNA為模板，按照上述方法進行多 重巢式實時熒光PCR檢測，驗證本試劑盒的特異性。檢測結果見表5,只有驢、豬、馬和牛的基 因組DNA被檢出，其余動物源性均未檢出，說明本試劑盒檢測方法具有很好的特異性。
[0097] 表3特異性驗證
[0098]
[0099]
[0100] 實施例3靈敏度實驗
[0101] 將驢、豬、馬和?；蚪MDNA分別定量到5X10-2ng/yl，5pgAU和0.5pgAU，(h05pg/ μL，0.005pgAU每個PCR反應分別加入驢、馬、牛和豬不同濃度的DNA為模板，加量為2μ1，即 DNA含量分別為0 · lng，0 · Olng，lpg，0 · lpg，0 · Olpg，按照上述PCR體系及檢測方法進行擴增， 結果見圖8至圖11，從圖中可以看出，本發(fā)明檢測限為O.lpg，檢測靈敏度到皮克級，相對普 通巢式PCR擴增檢測靈敏度提高了 1000倍。
[0102] 實施例4實際樣品檢測應用
[0103] 市售樣本40份，不同品牌廠家及不同生產(chǎn)批次樣本，按照本發(fā)明提供的檢測方法， 提取DNA，進行多重巢式實時熒光PCR檢測，見表6，其中18份樣本檢出驢源性成分，11份樣本 同時檢出驢和馬源性成分，6份樣本同時檢出驢和豬源性成分，5份樣本未檢出驢、馬、牛和 豬源性成分，說明本發(fā)明提供的檢測方法具有很好的應用價值。
[0104] 表4實際樣品檢測
[0105]
[0106] 上述雖然結合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】進行了描述，但并非對本發(fā)明保護 范圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發(fā)明的技術方案的基礎上，本領域技術人員 不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內(nèi)。
【主權項】
1. 一種同時鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分的多重巢式熒光PCR檢測引物、探針組 合物，其特征在于，包括： (1) 多重巢式熒光PCR檢測驢、馬、牛和豬源性通用外側引物，其核苷酸序列如下： 正向引物序列：5'CCTGTATCAACACATAGAAGCAATA 3'，如SEQ N0.1 所示； 反向引物序列：5'TCCTTTTACTTCTTTTAATCTTTCC3'，如SEQN0·2所示； (2) 多重巢式熒光PCR檢測驢、馬、牛和豬源性通用內(nèi)側引物，其核苷酸序列如下： 正向引物序列：5'TATGAGTAACAAGAATTATTTCTCC3'，如SEQN0.3所示 ； 反向引物序列：5'AGCCTGTGTTGGGTTAACAA3'，如SEQN0·4所示； (3) 驢特異性探針，其核苷酸序列如下： 5'CAACAAAATAGACACAACCCAAAAACT3'JnSEQN0.5K* ; (4) 馬特異性探針，其核苷酸序列如下： 5'CAAGATAGGGATAATCCAAAAACTGTTG3'JnSEQN0.6K* ; (5) 牛特異性探針，其核苷酸序列如下： 5'TTCTCCTTGCATAAGTCTAAGTCAGTGC3'JnSEQN0.7K* ; (6) 豬特異性探針，其核苷酸序列如下： 5'CCTCGCACACGCTTACATCAGTA3'JnSEQN0.8K*; 其中，所述驢、馬、牛和豬特異性探針的5 '端修飾有報告基團，3 '端修飾有淬滅基團，所 述報告基團為?41、冊父、了六11^、1?(^、0￥5中的任一種，所述淬滅基團為〇31^71、8闕1、8即2中 的任一種。2. 根據(jù)權利要求1所述的同時鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分的多重巢式熒光PCR 檢測引物、探針組合物，其特征在于，還包括內(nèi)標質控體系，所述內(nèi)標質控體系包括質控體 系引物、質控體系探針和質控體系序列，各核苷酸序列如下： (1) 質控體系引物： 上游引物序列如SEQ NO. 1所示，下游引物如SEQ NO.2所示； (2) 質控體系探針： CntP: 5 ' TGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTCCATT 3 '，如SEQ NO · 9所示； (3) 質控體系序列： CCTGTATCAACACATAGAAGCAATAATGGAGCACGCCGTAAGCTTAACCTGACGCTAGTAGGCAAGTACGCTC CATTGGTGACCTC GGAAAGATTAAAAGAAGTAAAAGGA，如 SEQ NO · 10所示； 其中，質控體系探針的5'端修飾有報告基團，3'端修飾有淬滅基團，所述報告基團為 卩八1、冊乂、了六11^、1?(^、0￥5中的任一種，所述淬滅基團為〇31^71、8即1、8即2中的任一種。3. -種同時鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分的多重巢式熒光PCR檢測試劑盒，其特 征在于，包括權利要求1或2所述的同時鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分的多重巢式熒光 PCR檢測引物、探針組合物，以及阿膠DNA提取液和多重巢式熒光PCR反應所需試劑。4. 根據(jù)權利要求3所述的同時鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分的多重巢式熒光PCR 檢測試劑盒，其特征在于，還包括驢、馬、牛和豬陽性標準品、陰性對照品和空白對照品。5. 根據(jù)權利要求3或4所述的同時鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分的多重巢式熒光 PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述多重巢式熒光PCR反應所需試劑包括:多重巢式熒光PCR 反應緩沖液2 X qPCRMaster Mix，Taq熱啟動酶，鎂離子濃度2. OmM，4種dNTP的終濃度各為 200μΜ，Tris-H2S04pH 9.0，終濃度為600mM的KCl，終濃度為5M/L的甜菜堿和超純水;所述試 劑盒為20ylPCR反應擴增體系：2XqPCRMaster Mix ΙΟμΙ，外側引物對ΙΟμΜ取ΙμL，內(nèi)側引物 對ΙΟμΜ取ΙμL，探針用量驢、牛和馬終濃度各0.25uM，P2豬探針終濃度為0.5-luM，DNA用量1-50ngAU取2μ1，用雙蒸水補足20μ1。6. 根據(jù)權利要求5所述的同時鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分的多重巢式熒光PCR 檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的PCR擴增步驟為兩步:第一步反應優(yōu)先擴增外側引 物，反應條件為95°C IOmin; 95°C IOs，70°C，35s，在此收集熒光信號，10個循環(huán);第二步反應 優(yōu)先擴增內(nèi)側引物，反應條件為95 °C IOs，60 °C，35s，在此收集熒光信號，40個循環(huán)。7. -種鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分多重巢式實時熒光定量PCR檢測方法，其特 征在于，包括以下步驟： (1) 提取待測樣品DNA; (2) 使用權利要求1或2所述引物、探針組合物或權利要求3-6任一項所述試劑盒進行兩 步PCR擴增:第一步反應驢、馬、牛和豬源性通用外側引物優(yōu)先擴增，反應條件為95 °C IOmin; 95°C IOs，70°C，35s，在此收集熒光信號，10個循環(huán);第二步反應驢、馬、牛和豬源性通用內(nèi)側 引物優(yōu)先擴增，反應條件為95 °C IOs，60 °C，35s，在此收集熒光信號，40個循環(huán)； (3) 設立陽性對照、陰性對照及空白對照； (4) 根據(jù)不同探針熒光信號及擴增曲線Ct值來判定阿膠中是否含有驢、馬、牛和豬源性 成分。8. 根據(jù)權利要求7所述鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分多重巢式實時熒光定量PCR 檢測方法，其特征在于，所述多重巢式實時熒光定量PCR檢測是將多重巢式熒光PCR檢測驢、 馬、牛和豬源性通用內(nèi)、外側引物以及驢、馬、牛和豬特異性探針放入同一反應體系中共同 擴增，無需開管。9. 根據(jù)權利要求7或8所述鑒別阿膠中驢、馬、牛和豬源性成分多重巢式實時熒光定量 PCR檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增為擴增階段反應需在至少5通道型號的熒光定量 PCR儀上進行。10. 權利要求1或2所述引物、探針組合物或權利要求3-6任一項所述試劑盒在鑒別阿膠 中驢、馬、牛和豬源性成分中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK105907852SQ201610272771
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】張全芳, 劉艷艷, 范陽陽, 步迅
【申請人】山東省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心