基因pparg檢測(cè)豬肌肉中甘油三酯含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基因PPARG檢測(cè)豬肌肉中甘油三酯含量的方法，利用基因PPARG在脂肪組織中的表達(dá)水平來(lái)檢測(cè)豬肌肉中甘油三酯含量。該法具有快速準(zhǔn)確、操作方便且不影響豬正常生長(zhǎng)的特點(diǎn)，適用于在豬養(yǎng)殖過(guò)程中動(dòng)態(tài)監(jiān)控豬肌肉中甘油三酯含量情況以便于隨時(shí)掌握豬生長(zhǎng)狀況，對(duì)豬肌肉中脂肪的含量有一個(gè)相對(duì)精確的了解，進(jìn)而對(duì)豬的日糧進(jìn)行調(diào)整。
【專利說(shuō)明】
基因 PPARG檢測(cè)豬肌肉中甘油三酯含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于豬肌肉中甘油三酯含量檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是涉及一種基因 PPARG檢測(cè)豬 肌肉中甘油三酯含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬是我國(guó)主要的肉用動(dòng)物，豬肉產(chǎn)量已占肉類總產(chǎn)量的60%以上。多年來(lái)的育種 工作使豬瘦肉率水平有很大提高、脂肪性狀得以顯著改良。然而，在瘦肉率上升的同時(shí)，豬 肉品質(zhì)卻在急劇下降。
[0003] 豬肌肉中脂肪通常稱為肌內(nèi)脂肪aMF)，豬的肌內(nèi)脂肪含量是其重要經(jīng)濟(jì)性狀，也 是影響肉質(zhì)的一個(gè)極其重要的指標(biāo)，對(duì)肌肉的風(fēng)味、嫩度和多汁性等食用品質(zhì)有重要影響。 脂肪組織能大量?jī)?chǔ)存甘油三酯，豬的肌內(nèi)脂肪主要成分為甘油三酯，通過(guò)對(duì)甘油三酯的測(cè) 定可以了解豬肌肉中脂肪的積累情況。因此，可以通過(guò)動(dòng)態(tài)監(jiān)控肌肉中甘油三酯的含量來(lái) 動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)豬肉品質(zhì)，進(jìn)而對(duì)日糧進(jìn)行調(diào)整，得到品質(zhì)更好的豬肉。多年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)豬 肌內(nèi)脂肪含量做了相當(dāng)多的研究，其研究結(jié)果對(duì)豬品種的選育、肉品的加工利用等均有重 要的參考價(jià)值。
[0004] 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPARG)在脂肪細(xì)胞中高表達(dá)，多種參與脂肪酸 轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的基因在轉(zhuǎn)錄水平受PPARG調(diào)控，如脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白（AFABP)、脂肪酸 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（FATP)、脂蛋白脂酶(LPL)等，可以增加脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶的表達(dá)， 刺激細(xì)胞對(duì)脂肪酸的攝取和向脂酰輔酶A的轉(zhuǎn)化。PPARG還能選擇性誘導(dǎo)LPL基因在脂肪組 織的表達(dá)，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減緩脂解速度，從而降低游離脂肪酸的量?？傊?， PPARG在脂肪細(xì)胞的高表達(dá)可使脂肪細(xì)胞中三酰甘油的合成增加，脂肪細(xì)胞的體積增大而 引起肥胖。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種快速準(zhǔn)確、操作方便且不影響豬正常生長(zhǎng)的 基因 PPARG檢測(cè)豬肌肉中甘油三酯含量的方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:基因 PPARG檢測(cè)豬肌肉中甘油三 酯含量的方法，利用基因 PPARG在脂肪組織中的表達(dá)水平來(lái)檢測(cè)豬肌肉中甘油三酯含量。
[0007] 上述基因 PPARG檢測(cè)豬肌肉中甘油三酯含量的方法，通過(guò)定量PCR來(lái)檢測(cè)基因 PPARG在脂肪組織里mRNA的表達(dá)量，用于定量PCR基因 PPARG特異片段的引物對(duì)分別具有以 下堿基序列：
[0008] Forward primer：ATAAAGCCTCGGGGTTCCAC,
[0009] Reverse primer:ACCTGATGGCGTTATGAGACA〇
[0010] 上述基因 PPARG檢測(cè)豬肌肉中甘油三酯含量的方法，包括以下步驟：
[0011] (1)從被檢測(cè)的豬組織中抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA樣品；
[0012] (2)用引物對(duì)Forward primer和Reverse primer對(duì)步驟（1)中的cDNA樣品進(jìn)行定 量 PCR〇
[0013]步驟（1)中的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和條件為:在20μ1反轉(zhuǎn)錄體系中，加入4μ1總RNA，2μ1 01ig(dT)，4yl DEPC水，先置于70°C溫育lOmin，再置于冰上急速冷卻2min;然后加入：1μ1 dNTP Mix，0.5yl M-MLV，4yl Buffer，0.5yl RRI，4yl DEPC水，依次置于42°Clh，9(rC 1〇11^11，2〇1€2111丨11;最后-20°(：保存。
[0014] 步驟(2)中定量PCR擴(kuò)增步驟的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為：
[0015] 反應(yīng)體系：在20μ1定量PCR反應(yīng)體系中，含有ΙμL cDNA模板，lOySYBR Premix Ex Ta定量II 2Χ，0·4μ1 ROX Reference Dyell 50Χ，1μΜ的ΙμL引物Forward primer，lyM的 1 μL引物Reverse primer，6 · 6μ1無(wú)菌去離子水；
[0016] 反應(yīng)條件：951€308;951€58,60 1€308,40個(gè)循環(huán)；95°(：158,60°(：1111丨11，951€308,60 °C15s〇
[0017] 針對(duì)目前豬養(yǎng)殖和生產(chǎn)中缺乏有效監(jiān)測(cè)其肌內(nèi)脂肪含量狀況的措施，發(fā)明人研究 發(fā)現(xiàn)，PPARG基因的表達(dá)量與豬肌肉中甘油三酯含量成正相關(guān)，而肌內(nèi)脂肪含量的高低可由 豬肌肉中甘油三酯含量的情況體現(xiàn)出來(lái)，豬肌肉中甘油三酯含量又可以通過(guò)PPARG基因的 表達(dá)量確定，因此，PPARG在脂肪組織中的相對(duì)表達(dá)量可以用來(lái)反應(yīng)豬肌內(nèi)脂肪含量狀況。 據(jù)此，發(fā)明人建立了一種基因 PPARG檢測(cè)豬肌肉中甘油三酯含量的方法，利用基因 PPARG在 脂肪組織中的表達(dá)水平來(lái)檢測(cè)豬肌肉中甘油三酯含量。該法具有快速準(zhǔn)確、操作方便且不 影響豬正常生長(zhǎng)的特點(diǎn)，適用于在豬養(yǎng)殖過(guò)程中動(dòng)態(tài)監(jiān)控豬肌肉中甘油三酯含量情況以便 于隨時(shí)掌握豬生長(zhǎng)狀況，對(duì)豬肌肉中脂肪的含量有一個(gè)相對(duì)精確的了解，進(jìn)而對(duì)豬的日糧 進(jìn)行調(diào)整。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1是5月齡、8月齡、11月齡豬肌肉甘油三酯的相對(duì)含量圖。
[0019]圖2是5月齡、8月齡、11月齡豬脂肪組織中的PPARG相對(duì)表達(dá)量及肌肉甘油三酯的 相對(duì)含量對(duì)照?qǐng)D，圖中：左為PPARG相對(duì)表達(dá)量圖，右為PPARG相對(duì)表達(dá)量與肌肉甘油三酯相 對(duì)含量的相關(guān)性圖。
[0020] 圖3是5月齡、8月齡、11月齡豬脂肪組織中的SCAP相對(duì)表達(dá)量及肌肉甘油三酯的相 對(duì)含量對(duì)照?qǐng)D，圖中：左為SCAP相對(duì)表達(dá)量圖，右為SCAP相對(duì)表達(dá)量與肌肉甘油三酯相對(duì)含 量的相關(guān)性圖。
[0021] 圖4是5月齡、8月齡、11月齡豬脂肪組織中的MFGE8相對(duì)表達(dá)量及肌肉甘油三酯的 相對(duì)含量對(duì)照?qǐng)D，圖中：左為MFGE8相對(duì)表達(dá)量圖，右為MFGE8相對(duì)表達(dá)量與肌肉甘油三酯相 對(duì)含量的相關(guān)性圖。
【具體實(shí)施方式】 [0022] 一、研究設(shè)計(jì)
[0023] 以巴馬香豬為研究對(duì)象，正常喂食處理，在5月齡、8月齡、11月齡檢測(cè)PPARG、SCAP 和MFGE8的表達(dá)水平，考察相關(guān)基因的表達(dá)量與豬肌肉甘油三酯含量的關(guān)系。
[0024] 利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中公開(kāi)發(fā)表的豬（sus scrofa)的PPARG序列（序列登錄號(hào)：GI: 47523813;參見(jiàn)網(wǎng)址：NCBI數(shù)據(jù)http: //www .ncbi .nlm. nih · gov/)，SCAP(序列登錄號(hào)：GI: 927199368)，MFGE8序列(序列登錄號(hào):GI: 172072652)，設(shè)計(jì)特異性定量引物，以便檢測(cè)在豬 的基因組中該基因的相對(duì)表達(dá)量。豬（sus scrofa)的PPARG特異片段，序列全長(zhǎng)為1758bp; 豬（sus scrofa)的SCAP特異片段，序列全長(zhǎng)為4284bp;豬（sus scrofa)的MFGE8特異片段， 序列全長(zhǎng)為1344bp;豬的看家基因甘油醛-3-脫氫酶基因 GAPDH特異片段，序列全長(zhǎng)為 1341bp〇
[0025] 用于定量PCR上述PPARG特異片段的引物對(duì)，其堿基序列為：
[0026] Forward primer(Pl)：ATAAAGCCTCGGGGTTCCAC；
[0027] Reverse primer(P2):ACCTGATGGCGTTATGAGACA〇
[0028] 用于定量PCR上述SCAP特異片段的引物對(duì)，其堿基序列為：
[0029] Forward primer(P3)：GCCCTCGTCTTTCTGGACAA；
[0030] Reverse primer(P4)：TGGGTCAGGTGACAAACCAC〇
[0031] 用于定量PCR上述MFGE8特異片段的引物對(duì)，其堿基序列為：
[0032] Forward primer(P5)：6AGTGGCTGCAGATTGACCT；
[0033] Reverse primer(P6):GATGTGGCCAAAATCTCGGG。
[0034] 用于定量PCR豬的看家基因甘油醛-3-脫氫酶GATOH特異片段的引物，其堿基序列 為：
[0035] Forward primer(P7)：CGTGTCGGTTGTGGATCTGA；
[0036] Reverse primer(P8):TGACGAAGTGGTCGTTGAGG〇
[0037] 二、研究方法
[0038] (1)動(dòng)物和樣品的獲得
[0039] 實(shí)驗(yàn)用豬在廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院巴馬香豬飼養(yǎng)基地喂養(yǎng)，不同月齡的豬分 欄飼養(yǎng)，每欄最多不超過(guò)4頭，按體重的3%進(jìn)行飼喂。在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)（5月齡、8月齡、11月 齡），空腹16小時(shí)后，稱體重、手術(shù)采集豬背部皮下脂肪，將采集的豬背部皮下脂肪樣品立即 用液氮冷凍，然后放置于_80°C超低溫冰箱凍存以待分析。采集豬背最長(zhǎng)肌，生理鹽水清洗 后用組織細(xì)胞甘油三酯酶法測(cè)定試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司）測(cè)定背最長(zhǎng)肌甘 油三酯含量。
[0040] (2)總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄
[00411 從_80°C冰箱中取出O.lg的豬皮下脂肪組織樣放入2ml離心管中，加入lml Trizol 試劑(ambion)，用高通量研磨儀(大連愛(ài)科儀器開(kāi)發(fā)有限公司）研磨2min，后靜置5min，讓組 織充分裂解；向離心管中加入0.2ml的氯仿，用力搖晃30s，靜置5min，后4°C 12000rpm離心 10min;取上清至另一 1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min，后4 。(:12000rpm離心10min，棄上清;在離心管中加入70%的用DEPC水配制的乙醇，4°C12000rpm 離心3min，洗滌兩次;沉淀自然揮發(fā)干，加入20μ1 DEPC水，-80°C保存。
[0042]通過(guò)酶標(biāo)儀(TECAN infinite M200 PRO)測(cè)定總RNA濃度。
[0043] 在經(jīng)過(guò)無(wú) RNA酶處理的PCR管(AXYGEN)中配制20μ1反轉(zhuǎn)錄體系，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA樣品。在20μ1反轉(zhuǎn)錄體系中，加入4μ1總RNA，2yl 01ig(dT)，4yl DEPC水，先置于70°C溫 育lOmin，再置于冰上急速冷卻2min;然后加入：1μ1 dNTP Mix(Solarbio dNTP Μ?χ)，0·5μ1 M-MLV(TaKaRa Reverse Transcriptase M-MLV),4yl Buffer(TaKaRa 5XReverse Transcriptase M-MLV Buffer)，0·5μ1 RRI(TaKaRa)，4yl DEPC水，依次置于42°Clh，9(rC 1〇11^11，2〇1€2111丨11;最后-20°(：保存。
[0044] (3)定量 PCR
[0045] 分別用基因 PPARG、SCAP和MFGE8的特異性引物對(duì)(P1和P2、P3和P4、P5和P6)對(duì)步驟 (2)所述的cDNA樣品進(jìn)行定量PCR。用引物對(duì)P7和P8，對(duì)看家基因甘油醛-3-脫氫酶GATOH進(jìn) 行定量PCR。對(duì)定量PCR的結(jié)果進(jìn)行分析計(jì)算，得到其相對(duì)表達(dá)量。
[0046] 在8連管(AXYGEN)中配制20μ1定量PCR體系，進(jìn)行定量PCR。
[0047] 在20μ1定量PCR反應(yīng)體系中，含有ΙμL cDNA模板，lOySYBR Premix Ex Ta定量II 2 X(TaKaRaSYBR?Premix Ex Ta定量? II(Tli RNaseH Plus)試劑盒），0·4μ1 ROX Reference Dyell 50 X(TaKaRaSYBRsPremix Ex Ta定量? II(Tli RNaseH Plus)試劑 盒），ΙμΜ的ΙμL 引物Forward primer，ΙμΜ的ΙμL 引物Reverse primer，6 · 6μ1 無(wú)菌去離子水；
[0048] 在定量PCR儀(Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System)中進(jìn)行表達(dá)量 檢測(cè)，反應(yīng)條件：951€308;95 1€58,601€308,40個(gè)循環(huán)；95°(：158,60°(：1111丨11，95 1€308,601€ 15s〇
[0049] (4)統(tǒng)計(jì)分析
[0050] 結(jié)果用平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差產(chǎn)方式表示。通過(guò)SPSS19.0軟件(德國(guó)）用One-WayANOVA 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<〇.05可確定為具有統(tǒng)計(jì)差異。
[0051] 表1 5月齡、8月齡、11月齡豬的體重表格和背膘厚度
[0052]
[0053] 三、研究結(jié)論
[0054] 表1和圖1-4結(jié)果表明，基因 PPARG的表達(dá)量與肌肉甘油三酯正相關(guān)，而SCAP和 MFGE8的表達(dá)量與肌肉甘油三酯相關(guān)性較差。因此，以基因 PPARG在豬脂肪組織中的mRNA相 對(duì)表達(dá)量可以用來(lái)反應(yīng)豬的肌肉甘油三酯含量狀況。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基因 PPARG檢測(cè)豬肌肉中甘油三酯含量的方法，其特征在于利用基因 PPARG在脂 肪組織中的表達(dá)水平來(lái)檢測(cè)豬肌肉中甘油三酯含量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因 PPARG檢測(cè)豬肌肉中甘油三酯含量的方法，其特征在于通 過(guò)定量PCR來(lái)檢測(cè)基因 PPARG在脂肪組織里mRNA的表達(dá)量，用于定量PCR基因 PPARG特異片段 的引物對(duì)分別具有以下喊基序列： Forward primer：ATAAAGCCTCGGGGTTCCAC, Reverse primer:ACCTGATGGCGTTATGAGACA。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因 PPARG檢測(cè)豬肌肉中甘油三酯含量的方法，其特征在于包 括以下步驟： (1) 從被檢測(cè)的豬組織中抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到相應(yīng)的cDNA樣品； (2) 用引物對(duì)Forward primer和Reverse primer對(duì)步驟（1)中的cDNA樣品進(jìn)行定量 PCR04. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因 PPARG檢測(cè)豬肌肉中甘油三酯含量的方法，其特征在于步 驟（1)中的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和條件為:在20μ1反轉(zhuǎn)錄體系中，加入4μ1總RNA，2μ1 Olig(dT)， 4μ1 DEPC水，先置于70°C溫育lOmin，再置于冰上急速冷卻2min;然后加入：1μ1 dNTP Mix， 0·5μ1 M-MLV，4yl Buffcr，0.5yl RRI，4yl DEPC水，依次置于42°Clh，9(TC10min，2(rC 2min;最后_20°C保存。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因 PPARG檢測(cè)豬肌肉中甘油三酯含量的方法，其特征在于步 驟(2)中定量PCR擴(kuò)增步驟的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為： 反應(yīng)體系：在20μ1定量PCR反應(yīng)體系中，含有ΙμL cDNA模板，10μ SYBR Premix Ex Ta定 量ΙΙ2Χ，0·4μ1 ROX Reference DyeII50X，lyM的ΙμL引物Forward primer，lyM的ΙμL引物 Reverse primer，6.6yl無(wú)菌去離子水； 反應(yīng)條件：95°C 30s; 95°C 5s，60°C 30s，40個(gè)循環(huán)；95°C 15s，60°C Imin，95°C 30s， 60°C 15s〇
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105907868SQ201610377314
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年5月31日
【發(fā)明人】周磊, 鄧洛娜, 褚毅, 李星, 李一星
【申請(qǐng)人】廣西大學(xué)