Dhx36作為冠心病診斷標(biāo)志物的用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于冠心病診斷的分子標(biāo)志物，該分子標(biāo)志物是DHX36基因及其編碼蛋白。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明正常人和冠心病患者的血液中DHX36基因及其編碼蛋白的表達(dá)水平存在顯著差異，因此通過(guò)檢測(cè)受試者血液中DHX36基因及其編碼蛋白的表達(dá)水平即可判斷該受試者是否患有冠心病。本發(fā)明的分子標(biāo)志物還可以用于判斷冠心病患者的預(yù)后，從而為醫(yī)生定制個(gè)體化的治療方案提供參考。
【專利說(shuō)明】
DHX36作為冠心病診斷標(biāo)志物的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及冠心病診斷、預(yù)測(cè)預(yù)后領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及以檢測(cè)DHX36異常 為手段的冠心病診斷、預(yù)測(cè)預(yù)后方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的發(fā)展，心血管疾病尤其是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心??； Coronary Artery Disease;CAD)的發(fā)病率正在逐年上升。對(duì)于發(fā)達(dá)國(guó)家，還有大多數(shù)的發(fā) 展中國(guó)家來(lái)講，CAD已經(jīng)成為成年人發(fā)病和死亡的主要原因。近年來(lái)，對(duì)于CAD的流行趨勢(shì)以 及越來(lái)越嚴(yán)峻的不良預(yù)后的現(xiàn)狀，各國(guó)衛(wèi)生組織均給予了高度的關(guān)注。在中國(guó)，由于改革開(kāi) 放，物質(zhì)生活條件的提高，人均壽命逐漸延長(zhǎng)，相應(yīng)的，心血管疾病尤其是冠心病的發(fā)病率 逐年升高，有人預(yù)計(jì)，到本世紀(jì)的20年代，冠心病有可能會(huì)成為威脅人類健康的首位疾病。 近年來(lái)對(duì)冠心病的診斷方法和治療措施有了重大的突破，尤其是近年來(lái)抗血小板藥物、抗 凝藥物、溶栓藥物的更新?lián)Q代，以及經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)措施的日益普及，使大多 數(shù)的冠心病患者的臨床結(jié)局發(fā)生了巨大改善。
[0003] 自從上世紀(jì)60年代處Frmainghma的研究結(jié)果被首次公布以來(lái)，人們對(duì)冠心病的認(rèn) 識(shí)也有了很大的提高，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到冠心病不是一種單一的疾病，而是一種多因素疾病，由多 種危險(xiǎn)因素共同決定其流行趨勢(shì)及發(fā)病特點(diǎn)。當(dāng)然，在冠心病的發(fā)病機(jī)制當(dāng)中，傳統(tǒng)的危險(xiǎn) 因素如吸煙、不良飲食習(xí)慣、血壓升高、血糖升高等等起著舉足輕重的作用，近年認(rèn)為，個(gè)體 遺傳背景的差異也是導(dǎo)致冠心病發(fā)生的一種重要機(jī)制。因此從基因?qū)用嫔蠈ふ遗c冠心病的 發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子標(biāo)志物，有助于冠心病的預(yù)防、診斷和藥物的個(gè)性化治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種通過(guò)檢測(cè)DHX36基因或蛋白表達(dá)差異來(lái)診斷冠心 病的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種通過(guò)檢測(cè)DHX36基因或蛋白表達(dá)差異來(lái)預(yù)測(cè)冠心 病預(yù)后的方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了檢測(cè)DHX36基因或DHX36蛋白的產(chǎn)品在制備冠心病診斷工具中的用 途。
[0008] 本發(fā)明還提供了檢測(cè)DHX36基因或DHX36蛋白的產(chǎn)品在制備預(yù)測(cè)冠心病預(yù)后工具 中的用途。
[0009] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)DHX36基因或DHX36蛋白的產(chǎn)品包括檢測(cè)DHX36基因或DHX36蛋白 的表達(dá)水平的產(chǎn)品。所述產(chǎn)品包括能夠結(jié)合DHX36基因的核酸或者能夠結(jié)合DHX36蛋白的物 質(zhì)（例如抗體）。所述核酸能夠檢測(cè)DHX36基因的表達(dá)水平;所述物質(zhì)能夠檢測(cè)DHX36蛋白的 表達(dá)水平。
[0010]本發(fā)明的檢測(cè)DHX36基因的產(chǎn)品可基于使用核酸分子的已知方法來(lái)發(fā)揮其功能： 如PCR、如Southern雜交、Northern雜交、點(diǎn)雜交、焚光原位雜交(FISH)、DNA微陣列、ASO法、 高通量測(cè)序平臺(tái)等。使用該產(chǎn)品可以定性地、定量地、或半定量地實(shí)施分析。
[0011]包含在上述產(chǎn)品中的核酸可以通過(guò)化學(xué)合成來(lái)獲得，或通過(guò)從生物材料制備含有 期望核酸的基因，然后使用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增期望核酸的引物擴(kuò)增它來(lái)獲得。
[0012]進(jìn)一步，所述PCR方法為已知方法，例如，ARMS (Ampl if i cat ion Refractory Mutation System，擴(kuò)增不應(yīng)突變系統(tǒng))法、RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。擴(kuò)增 的核酸可以通過(guò)使用點(diǎn)印跡雜交法、表面等離子共振法(SPR法）、PCR-RFLP法、原位RT-PCR 法、PCR-SS0 (序列特異性寡核苷酸）法、PCR-SSP法、AMPFLP (可擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性）法、 MVR-PCR法、和PCR-SSCP (單鏈構(gòu)象多態(tài)性)法來(lái)檢測(cè)。
[0013] 上面所述的核酸包括擴(kuò)增DHX36基因的引物，產(chǎn)品中包括的引物可以通過(guò)通過(guò)化 學(xué)合成來(lái)制備，通過(guò)使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來(lái)適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)，并通過(guò) 化學(xué)合成來(lái)制備。
[0014] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述核酸為QPCR實(shí)驗(yàn)中使用的擴(kuò)增引物，所述引物 的序列如SEQ ID N0.1 (正向序列）和SEQ ID N0.2(反向序列）所示。
[0015] 上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備，通過(guò)使用本 領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來(lái)恰當(dāng)設(shè)計(jì)，并通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備，或者可以通 過(guò)從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增期望核酸序列的引物擴(kuò) 增它來(lái)制備。
[0016] 本發(fā)明的檢測(cè)DHX36蛋白的產(chǎn)品可基于使用抗體的已知方法來(lái)發(fā)揮其功能：例如， 可以包括ELI SA、放射免疫測(cè)定法、免疫組織化學(xué)法、Wes tern印跡等。
[0017] 本發(fā)明的檢測(cè)DHX36蛋白的產(chǎn)品包括特異性結(jié)合DHX36蛋白的抗體或其片段?？梢?使用任何結(jié)構(gòu)、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結(jié)合靶蛋白質(zhì)即可。 本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的?？贵w片段指保留抗 體對(duì)抗原的結(jié)合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽。抗體片段可以包括 F(at/ )2、Fat/、Fab、單鏈Fv(scFv)、二硫化物鍵合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V區(qū)（雙抗 體）、或含有CDR的肽。本發(fā)明的檢測(cè)DHX36蛋白的產(chǎn)品可以包括編碼抗體或編碼抗體片段的 氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細(xì)胞。
[0018] 抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來(lái)獲得。例如，制備保留整個(gè)或部分靶 蛋白質(zhì)的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體作為抗原。使用抗原免 疫動(dòng)物后，從經(jīng)過(guò)免疫的動(dòng)物獲得免疫細(xì)胞并融合骨髓瘤細(xì)胞以獲得雜交瘤。然后從雜交 瘤培養(yǎng)物收集抗體。最后可以通過(guò)使用被用作抗原的DHX36蛋白或其部分對(duì)獲得的抗體實(shí) 施抗原特異性純化來(lái)獲得針對(duì)DHX36蛋白的單克隆抗體。可以如下制備多克隆抗體:用與上 文相同的抗原免疫動(dòng)物，從經(jīng)過(guò)免疫的動(dòng)物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然后使用 上述抗原對(duì)血清實(shí)施抗原特異性純化?？梢酝ㄟ^(guò)用酶處理獲得的抗體或通過(guò)使用獲得的抗 體的序列信息來(lái)獲得抗體片段。
[0019] 標(biāo)記物與抗體或其片段的結(jié)合可以通過(guò)本領(lǐng)域普遍知道的方法來(lái)實(shí)施。例如，可 以如下熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)或肽：用磷酸鹽緩沖液清洗蛋白質(zhì)或肽，添加用DMS0、緩沖劑、等準(zhǔn) 備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標(biāo)記可使用商品化的標(biāo)記試劑盒，諸 如生物素標(biāo)記試劑盒，如生物素標(biāo)記試劑盒-NH2、生物素標(biāo)記試劑盒-SH (DojindoLaboratories);堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒諸如堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒-NH2、堿性磷 酸酶標(biāo)記試劑盒-SH(Dojindo Laboratories);過(guò)氧化物酶標(biāo)記試劑盒諸如過(guò)氧化物酶標(biāo) 記試劑盒-NH2、過(guò)氧化物酶標(biāo)記試劑盒-NH2(Dojindo Laboratories);藻膽蛋白標(biāo)記試劑 盒諸如藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-NH2、藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-SH、B-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-NH2， B-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-SH、R-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-NH2、R-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒SH (DojindoLaboratories);焚光標(biāo)記試劑盒諸如焚光素標(biāo)記試劑盒-NH2、HiLyte Fluor(TM) 555標(biāo)記試劑盒_NH2、HiLyte Fluor(TM)647標(biāo)記試劑盒_NH2(Dojindo Laboratories);及 DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗體 標(biāo)記試劑盒、Qdot(TM)抗體標(biāo)記試劑盒（Invitrogen Corporation)和EZ-標(biāo)記物蛋白質(zhì)標(biāo) 記試劑盒(Funakoshi Corporation)。為了正確標(biāo)記，可以使用適宜的儀器來(lái)檢測(cè)經(jīng)過(guò)標(biāo)記 的抗體或其片段。
[0020] 在本發(fā)明中，"預(yù)后"是指冠心病患者在通過(guò)手術(shù)處理等抑制或緩解冠心病后的過(guò) 程或結(jié)果。在本說(shuō)明書中，預(yù)后可以是通過(guò)手術(shù)處理抑制或緩解冠心病后1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、15、20年或更久時(shí)的生機(jī)狀態(tài)。預(yù)后可以通過(guò)檢查生物標(biāo)志物即0!?36蛋白或編碼 DHX36蛋白的基因來(lái)預(yù)測(cè)。預(yù)后預(yù)測(cè)可以這樣進(jìn)行:根據(jù)生物標(biāo)志物的有或無(wú)，或者升高或 降低，確定患者的預(yù)后是良好還是不良，或者確定良好預(yù)后或不良預(yù)后的概率。
[0021] 在本發(fā)明中，"預(yù)后良好"是指在通過(guò)手術(shù)處理等為患者抑制或緩解冠心病之后， 患者長(zhǎng)時(shí)期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更長(zhǎng))沒(méi)有危急狀況。預(yù)后良好最優(yōu)選的狀態(tài) 是長(zhǎng)期無(wú)疾病的存活。
[0022]在本發(fā)明中，"預(yù)后不良"是指患者在通過(guò)手術(shù)處理等抑制或緩解冠心病后的短時(shí) 期(例如1、2、3、4、5年或更短）內(nèi)發(fā)生致命狀況。
[0023]預(yù)測(cè)預(yù)后是指預(yù)測(cè)患者狀況的過(guò)程或結(jié)果，并不意味著能以100%的準(zhǔn)確度預(yù)測(cè) 患者狀況的過(guò)程或結(jié)果。預(yù)測(cè)預(yù)后是指確定某些過(guò)程或結(jié)果的可能性是否增加，而并不意 味著通過(guò)與某些過(guò)程或結(jié)果不發(fā)生的情況比較來(lái)確定發(fā)生某些過(guò)程或結(jié)果的可能性。如本 發(fā)明而言，本發(fā)明中DHX36基因或DHX36蛋白的水平升高或降低的患者中，與不顯示該特征 的患者相比，更有可能觀察到特定過(guò)程或結(jié)果。
[0024] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)DHX36基因或DHX36蛋白的產(chǎn)品可以是檢測(cè)DHX36基因或DHX36蛋 白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通 量測(cè)序平臺(tái)。
[0025]利用前面所述的檢測(cè)產(chǎn)品檢測(cè)受試者樣本中的DHX36基因或DHX36蛋白的表達(dá)水 平，與正常人相比，受試者樣本中的DHX36基因或DHX36蛋白的表達(dá)水平升高，則診斷該受試 者為冠心病患者或該受試者的預(yù)后差。
[0026] 作為依照本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)品的樣本，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品 或流體。樣本不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測(cè)定;例如，它可以包括組織、血液、血漿、 血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級(jí)分或經(jīng)過(guò)處理的材 料。
[0027] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述樣本來(lái)自受試者的血液。
[0028]本發(fā)明還提供了一種診斷冠心病的工具，所述工具能夠檢測(cè)受試者樣本中DHX36 基因或DHX36蛋白的表達(dá)水平。所述工具包括能夠結(jié)合DHX36基因的核酸或者能夠結(jié)合 DHX36蛋白的物質(zhì)（例如抗體）。所述核酸能夠檢測(cè)DHX36基因的表達(dá)水平;所述物質(zhì)能夠檢 測(cè)DHX36蛋白的表達(dá)水平。
[0029] 進(jìn)一步，所述核酸和所述物質(zhì)的性質(zhì)同前面所述。
[0030] 進(jìn)一步，所述診斷冠心病的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序 平臺(tái)；高通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷冠心病的工具，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)一 個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過(guò)對(duì)比疾病患者和正常人群的基因表 達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知DHX36基因的異 常與冠心病相關(guān)也屬于DHX36基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0031] 本發(fā)明還提供了一種預(yù)測(cè)冠心病預(yù)后的工具，所述工具能夠檢測(cè)受試者樣本中 DHX36基因或DHX36蛋白的表達(dá)水平，所述預(yù)測(cè)冠心病預(yù)后工具包括能夠結(jié)合DHX36基因的 核酸或者能夠結(jié)合DHX36蛋白的物質(zhì)（例如抗體）。所述核酸能夠檢測(cè)DHX36基因的mRNA水 平;所述物質(zhì)能夠檢測(cè)DHX36蛋白的表達(dá)水平。
[0032]進(jìn)一步，所述核酸和所述物質(zhì)的性質(zhì)同前面所述。
[0033] 進(jìn)一步，所述預(yù)測(cè)冠心病預(yù)后的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量 測(cè)序平臺(tái)；高通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷冠心病的工具，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展， 對(duì)一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過(guò)對(duì)比疾病患者和正常人群的基 因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知DHX36基因 的異常與冠心病相關(guān)也屬于DHX36基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0034] 本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)品、診斷工具中使用的抗DHX36抗體或其片段所識(shí)別的氨基酸的 數(shù)目沒(méi)有特別限制，只要抗體能夠結(jié)合DHX36即可。當(dāng)抗體作為治療藥物時(shí)，優(yōu)選的是它能 夠識(shí)別盡可能多的氨基酸，只要它能抑制DHX36功能。抗體或其片段識(shí)別的氨基酸的數(shù)目是 至少一個(gè)，更優(yōu)選至少三個(gè)?？贵w的免疫球蛋白類別不受限制，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、 IgD或IgY。
[0035] 本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)品、診斷工具中使用的抗DHX36抗體的其他性質(zhì)同前面所述。
[0036] 進(jìn)一步，所述受試者樣本可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣 本不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測(cè)定;例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴 液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級(jí)分或經(jīng)過(guò)處理的材料。在本發(fā)明 的具體實(shí)施方案中，所述樣本來(lái)自受試者的血液。
[0037] 本發(fā)明還提供了一種診斷冠心病或預(yù)測(cè)冠心病預(yù)后的方法，所述方法包括如下步 驟：
[0038] (1)獲取冠心病受試者的樣品；
[0039] (2)檢測(cè)受試者樣品中DHX36基因或蛋白的表達(dá)水平；
[0040] (3)將測(cè)得的DHX36基因或蛋白的表達(dá)水平與受試者的患病與否關(guān)聯(lián)起來(lái)。
[00411 (4)與對(duì)照相比，DHX36基因或蛋白的表達(dá)水平升高，則該受試者被診斷為冠心病， 或該受試者被確定為預(yù)后不良。
[0042]在本發(fā)明的上下文中，"診斷冠心病"既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有冠心病、也 包括判斷受試者是否存在患有冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。
[0043]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0044]本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)了 一種診斷冠心病的分子標(biāo)志物，使用該分子標(biāo)志物可以在冠心病 發(fā)生的早期即可作為判斷，提供了患者的生存率。
[0045]另外，通過(guò)預(yù)測(cè)患者的預(yù)后，本發(fā)明能夠提供有意義的信息來(lái)為患者決定治療方 案策略。
【附圖說(shuō)明】
[0046]圖1顯示利用基因芯片檢測(cè)DHX36基因在冠心病患者與正常人中的表達(dá)情況；
[0047]圖2顯示利用QPCR檢測(cè)DHX36基因在冠心病患者與正常人中的表達(dá)情況；
[0048] 圖3顯示利用Western blot檢測(cè)DHX36蛋白在冠心病患者與正常人中的表達(dá)情況。
[0049]具體的實(shí)施方式
[0050]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0051 ] 實(shí)施例1 DHX36基因的差異表達(dá) [0052] 1、研究對(duì)象：
[0053]收集冠心病患者5例，正常人5例。
[0054]冠心病組的納入標(biāo)準(zhǔn)：按照世界衛(wèi)生組織制定的缺血性心臟病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，選擇 經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)有一支或多支血管狹窄程度多50%的冠心病患者。對(duì)照組的入選標(biāo)準(zhǔn) 為：1)在流行病學(xué)調(diào)查時(shí)篩選年齡、性別、民族均與CAD組相匹配，經(jīng)過(guò)問(wèn)卷調(diào)查、體格檢查、 心臟超聲檢查及心電圖檢查及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查沒(méi)有冠心病的臨床表現(xiàn)及主要危險(xiǎn)因素的 體檢者；2)住院行健康體檢并行冠狀動(dòng)脈造影檢查排除冠心病并年齡、性別、民族與CAD組 匹配者;符合以上任何一條者入選為對(duì)照組。兩組在納入研究前簽署知情同意書。
[0055]剔除標(biāo)準(zhǔn):CAD組-臨床資料不全者及同時(shí)合并以下疾病之一者予以剔除。（如：先 天性心臟病者、主動(dòng)脈夾層、多臟器功能衰竭、風(fēng)濕性心臟病以及具有精神障礙不能配合 者）。對(duì)照組:有精神障礙者或經(jīng)多普勒檢查證實(shí)有頸動(dòng)脈斑塊或狹窄者，予以剔除。
[0056] 2、血液中總RNA的提取
[0057] (1)勾衆(zhòng)處理（Homogenization)
[0058] 要求研究對(duì)象空腹至少12h，于次日清晨7:00~8:00室溫下，抽取10ml靜脈血于乙 二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，加入3倍體積紅細(xì)胞裂解液，混勻后室溫放置10分鐘，10，OOOrpm 離心1分鐘。徹底吸棄上清，收集白細(xì)胞沉淀。每100-200μ1血液收集的白細(xì)胞沉淀加入lml TRIzol〇
[0059] (2)分層（Phase Separation)
[0060] a.樣品加入TRI zo 1后，室溫放置5min，使樣品充分裂解。
[00611 b.每lml TRIzol加入200μ1氯仿，劇烈振蕩混勻后室溫放置3-5min使其自然分相。 [0062] (3)RNA沉淀（RNA Precipitation)
[0063] a. 4°C12,000rpm離心10_15min。樣品會(huì)分成三層:黃色的有機(jī)相，中間層和無(wú)色 的水相，RNA主要在水相中，把水相(通?？晌?50μ1)轉(zhuǎn)移到新管中。
[0064] b ·在上清中加入等體積冰冷的異丙醇，室溫放置lOjOminj-C 12，000rpm離心 10min，棄上清，RNA沉淀于管底。
[0065] (4)RNA漂洗（RNA Wash)
[0066] a. RNA沉淀中加入lml 75%乙醇（用RNase-free水配制），溫和振蕩離心管，懸浮 沉淀。每lml TRIzol加入lml 75%乙醇。
[0067] b. 41€5,000-8,000印111離心卜21^11，棄上清;短暫快速離心，用移液器小心吸棄上 清，室溫放置1-2分鐘晾干沉淀。
[0068] (5)溶解RNA(Redissolving the RNA)
[0069] 沉淀中加入50-100μ1 RNase-f ree水，輕彈管壁，以充分溶解RNA，-70 °C保存。
[0070] 3、RNA質(zhì)量和純度檢測(cè)
[0071] RNA質(zhì)量:通過(guò)RNA完整性來(lái)表示，可用普通瓊脂糖凝膠電泳（電泳條件：1.2 %膠； 0.5 X TBE電泳緩沖液;150v，15分鐘)檢測(cè)完整性。
[0072] RNA純度：0D260/0D280比值是衡量RNA樣品中蛋白質(zhì)污染程度的指標(biāo)。高質(zhì)量的 RNA樣品，0D260/0D280值（1 OmM Tri s，pH7 · 5)在2 · 0左右。
[0073] 4、測(cè)序:將上述RNA送交上海伯豪生物技術(shù)有限公司采用Solexa測(cè)序技術(shù)對(duì)樣品 進(jìn)行測(cè)序。
[0074] 5、數(shù)據(jù)分析
[0075] 5.1原始數(shù)據(jù)處理
[0076]測(cè)序儀產(chǎn)生的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)Base Calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，我們稱之為原始序 列數(shù)據(jù)，結(jié)果以FASTQ文件格式存儲(chǔ)。由于原始序列數(shù)據(jù)可能包含低質(zhì)量序列、接頭序列等 雜質(zhì)序列數(shù)據(jù)，不能直接用于生物信息分析，所以原始序列數(shù)據(jù)必需經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)處理轉(zhuǎn)換為 高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)，利用Tophat(version:2.0.6)軟件的spliced mapping算法對(duì)高質(zhì)量序列 數(shù)據(jù)進(jìn)行基因組比對(duì)，采用基因組版本為SscrofalO.2。
[0077] 5.2差異基因的篩選
[0078] 基因表達(dá)量的計(jì)算使FPKM法。根據(jù)基因的表達(dá)量(FPKM值)計(jì)算該基因在不同樣本 間的差異表達(dá)倍數(shù)。差異表達(dá)基因定義為FDRS0.01且倍數(shù)差異在2倍及以上的基因。
[0079] 6、結(jié)果
[0080] 結(jié)果顯示（如圖1所示），與正常人相比，冠心病患者血液中DHX36基因的mRNA水平 顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇. 05)。
[0081 ]實(shí)施例2 QPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證冠心病患者和正常人中差異表達(dá)的基因 [0082] 1、研究對(duì)象：
[0083] 篩選標(biāo)準(zhǔn)同實(shí)施例1，冠心病患者和正常人各50例。
[0084] 2、血液中總RNA的提取
[0085] 步驟同實(shí)施例1。
[0086] 3、逆轉(zhuǎn)錄
[0087]用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對(duì)lyg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用25μ1反應(yīng)體系，每個(gè)樣品 取1 yg總RNA作為模板RNA，在PCR管中分別加入以下組分：DEPC水，5 X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液， 10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30ymmol/l Oligo (1Τ，20〇υ/μ1 M-MLV，模板尺祖。42。(：孵育 lh，72°C10min，短暫離心。
[0088] 4、QPCR
[0089] (1)引物設(shè)計(jì)
[0090] 根據(jù)Genbank中DHX36基因和GAroH基因的編碼序列設(shè)計(jì)QPCR擴(kuò)增引物，由上海生 工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。具體引物序列如下：
[0091] DHX36 基因：
[0092] 正向引物為5'-GGCTTATCTATCACCTAA-3'（SEQ ID N0.3);
[0093] 反向引物為5'-AATACAATCCACTCATCT-3'（SEQ ID N0.4),
[0094] GATOH 基因：
[0095] 正向引物為5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3'（SEQ ID N0.5);
[0096] 反向引物為5'-CATGGGTGGAATCATATTGGAA-3'（SEQ ID N0.6)。
[0097] (2)按照表1配制PCR反應(yīng)體系：
[0098] 其中，SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系購(gòu)自Invitrogen公司。
[0099] 表1 PCR反應(yīng)體系
[0100]
[0101] (3汗0?反應(yīng)條件：95°(：1〇11^11，（95°(：158,6〇1€4〇8)*45個(gè)循環(huán)。以5￥81?6代611作為 熒光標(biāo)記物，在Light Cycler熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過(guò)融解曲線分析和電泳確 定目的條帶，△△ CT法進(jìn)行相對(duì)定量。
[0102] 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0103]結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng) 計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P〈0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0104] 6、結(jié)果
[0105] 結(jié)果如圖2所示，與正常人相比，冠心病患者血液中DHX36基因的mRNA水平顯著增 加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇.05)，結(jié)果同基因芯片實(shí)驗(yàn)。
[0106] 實(shí)施例3 DHX36蛋白差異表達(dá)檢測(cè) [0107] 1、研究對(duì)象
[0108] 同實(shí)施例2。
[0109] 2、單核細(xì)胞分離
[0110]無(wú)菌采集靜脈血l〇ml，注入盛肝素的無(wú)菌小瓶中，加蓋后立即輕輕搖勻。用無(wú)菌吸 管加入等體積的HBSS(NaCl 8.0g，Na2HP〇4 0.132g，KH2P〇4 0.06g，KCl 0.4g，酚紅lml， NaHC03 0.35g，D-葡萄糖1.0g，溶于1000ml雙蒸水），以降低紅細(xì)胞的凝聚。吸取8ml淋巴細(xì) 胞分層液置50ml離心管中，將稀釋血液沿管壁緩慢加入，保持界面清楚，勿使兩者相混，在 20°C2 000r/min離心30min，小心吸取分層液與血衆(zhòng)交接部位混池的灰白色層，即淋巴細(xì)胞 層，加入另一支離心管中，用5倍體積的HBSS洗滌2次，依次以2 000r/min、l 500r/min在室 溫下離心10min，以便去除大部分混雜的血小板，用10ml雙蒸水與細(xì)胞團(tuán)塊混合lmin，使殘 余紅細(xì)胞裂解，然后迅速加入等量1.8%NaCl溶液，2 000r/min離心，去上清，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后 用HBSS溶液調(diào)整細(xì)胞至1 X 106個(gè)/ml備用。
[0111] 3、單核細(xì)胞總蛋白質(zhì)提取
[0112] 將上述實(shí)驗(yàn)所得細(xì)胞懸液(濃度為1X106個(gè)/ml)室溫1 OOOr/min離心10min，棄上 清后加入1〇〇μ1裂解緩沖液，4°C震蕩lh，用超聲波儀破碎細(xì)胞，每次10s，共10次，于4°C12 OOOr/min離心lh;取上清用Brandford法定量蛋白，分裝成2.5yg/yl，-80°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0113] 4、Western blot檢測(cè)
[0114] 將提取的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯 色。
[0115] 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0116] 將蛋白條帶的灰度值使用Image J軟件進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，將目的白條 帶的灰度值進(jìn)行歸一化處理。結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P〈0.05時(shí)具有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義。
[0117] 6、結(jié)果
[0118]結(jié)果如圖3所示，與正常人相比，冠心病患者血液中DHX36蛋白含量高，差異具有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義(P〈〇.〇5)。
[0119]上述實(shí)施例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn) 和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測(cè)DHX36基因或DHX36蛋白的產(chǎn)品在制備診斷冠心病或預(yù)測(cè)冠心病預(yù)后的工具中 的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測(cè)DHX36基因或DHX36蛋白的產(chǎn)品包 括檢測(cè)DHX36基因或DHX36蛋白的表達(dá)水平的產(chǎn)品。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，利用所述產(chǎn)品檢測(cè)受試者樣本中的DHX36 基因或DHX36蛋白的表達(dá)水平，與正常人相比，受試者樣本中的DHX36基因或DHX36蛋白的表 達(dá)水平升高，則診斷該受試者為冠心病患者或該受試者的預(yù)后差。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述受試者樣本的來(lái)源是血液。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括能夠結(jié)合DHX36 基因的核酸或者能夠結(jié)合DHX36蛋白的物質(zhì);所述核酸能夠檢測(cè)DHX36基因的表達(dá)水平;所 述物質(zhì)能夠檢測(cè)DHX36蛋白的表達(dá)水平。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述核酸是實(shí)時(shí)定量PCR中使用的特異擴(kuò) 增DHX36基因的引物如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示。7. -種診斷冠心病或預(yù)測(cè)冠心病預(yù)后的工具，其特征在于，所述工具包括能夠檢測(cè)受 試者樣本中的DHX36基因或DHX36蛋白的表達(dá)水平的工具。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的工具，其特征在于，所述工具包括能夠結(jié)合DHX36基因的核酸 或者能夠結(jié)合DHX36蛋白的物質(zhì);所述核酸能夠檢測(cè)DHX36基因的表達(dá)水平;所述物質(zhì)能夠 檢測(cè)DHX36蛋白的表達(dá)水平。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的工具，其特征在于，所述核酸是實(shí)時(shí)定量PCR中使用的特異擴(kuò) 增DHX36基因的引物如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示。10. 根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)所述的工具，其特征在于，所述受試者樣本的來(lái)源是血 液。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105907870SQ201610382158
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年6月1日
【發(fā)明人】肖武, 任建廷, 楊承剛
【申請(qǐng)人】北京泱深生物信息技術(shù)有限公司