碳水化合物富集的重組微生物的制作方法
【專利摘要】本公開(kāi)涉及經(jīng)過(guò)改造而用于增強(qiáng)所需碳水化合物的生產(chǎn)的重組微生物，以及尤其可用作動(dòng)物飼料成分的相關(guān)生物質(zhì)和組合物。本公開(kāi)還提供相關(guān)方法。
【專利說(shuō)明】碳水化合物富集的重組微生物
[0001] 序列表參考
[0002] 與此同時(shí)根據(jù)37C.F.R.§1.821以計(jì)算機(jī)可讀形式(CRF)通過(guò)EFS-Web作為文件名 200206_416W0_SEQUENCE_LISTING.txt以電子方式提交的"序列表"以引用的方式并入本 文。序列表的電子副本創(chuàng)建于2015年1月16日，并且占用磁盤大小為277千字節(jié)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本公開(kāi)涉及新型重組&代謝微生物以及相關(guān)組合物和方法，該新型重組&代謝微 生物包含用于增強(qiáng)碳水化合物生產(chǎn)的經(jīng)過(guò)改造的代謝途徑。
[0004] 背景
[0005] 動(dòng)物飼料利用中效率的提高已在過(guò)去數(shù)十年中通過(guò)使用飼料添加劑得以實(shí)現(xiàn)。這 些添加的物質(zhì)增加動(dòng)物飼料組合物的營(yíng)養(yǎng)含量、能含量和/或抗病性質(zhì)。對(duì)商業(yè)動(dòng)物生產(chǎn)商 日益嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)是谷物成本的上漲。成本上漲部分歸因于對(duì)用于生物燃料和人類食品使用 的谷物的競(jìng)爭(zhēng)性需求。隨著谷物和蛋白組分成本上漲，加上可用于飼料生產(chǎn)的土地有限，具 有有益的營(yíng)養(yǎng)和抗病性質(zhì)的可替代的低成本動(dòng)物飼料產(chǎn)品將是非常理想的。 發(fā)明概要
[0006] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供一種重組心代謝微生物，其包含選自由以下組成 的組的外源性核酸:編碼碳水化合物生物合成酶的外源性核酸，和編碼可操作地連接至編 碼天然碳水化合物生物合成酶的核酸的表達(dá)控制序列的核酸，其中所述重組&代謝微生物 能夠?qū)⑻烊粴鈦?lái)源的碳原料轉(zhuǎn)化成所需碳水化合物。通常，天然氣來(lái)源的碳原料是天然氣 或甲烷。
[0007] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供一種來(lái)源于本公開(kāi)的重組&代謝微生物的生物 質(zhì)。
[0008] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供一種包含從本公開(kāi)的生物質(zhì)提取的碳水化合物 的碳水化合物組合物，其中所述組合物展現(xiàn)出小于-30%。的δ 13(：。
[0009] 在再一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供一種包含本公開(kāi)的生物質(zhì)的動(dòng)物飼料。
[0010] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供一種包含本公開(kāi)的生物質(zhì)或組合物的培養(yǎng)基或 發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0011] 本公開(kāi)還提供相關(guān)方法。
[0012] 詳述
[0013] 本公開(kāi)提供具有利用相對(duì)低成本的碳原料作為能源的能力的新型重組Q代謝微 生物以及相關(guān)生物質(zhì)、組合物和方法。本公開(kāi)的重組微生物經(jīng)過(guò)改造用于商業(yè)上可取的某 些碳水化合物的增強(qiáng)的生產(chǎn)。這些重組微生物以及來(lái)源于它們的生物質(zhì)和碳水化合物組合 物用作動(dòng)物(例如像，家畜、魚(yú)類、家禽等）以及培養(yǎng)微生物或發(fā)酵微生物的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供一種重組&代謝微生物，其中所述重組&代謝微生 物包含選自由以下組成的組的外源性核酸:編碼碳水化合物生物合成酶的外源性核酸，和 編碼可操作地連接至編碼天然碳水化合物生物合成酶的核酸的表達(dá)控制序列的核酸，其中 所述重組&代謝微生物能夠?qū)⑻烊粴馓荚限D(zhuǎn)化成碳水化合物。如本文所更加詳細(xì)地描述 的，當(dāng)這些重組微生物在天然氣來(lái)源的&基質(zhì)存在下培養(yǎng)時(shí)，它們通常展現(xiàn)出小于-30%。的 δ13(：，并且常常小于_40%〇。通產(chǎn)，重組微生物為非光合&代謝微生物。
[0015] 在這些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的重組微生物經(jīng)過(guò)改造以將天然氣來(lái)源的原料轉(zhuǎn)化成 更有價(jià)值的碳水化合物，與更昂貴的碳水化合物相比，天然氣來(lái)源的原料成本相對(duì)較低并 且資源豐富（例如，天然氣或&基質(zhì)，諸如來(lái)自天然氣的甲烷）。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"天然氣來(lái) 源的原料"是指天然氣或從天然氣分離的任何組分(包括Ci基質(zhì))或由天然氣轉(zhuǎn)化的任何組 分(即，合成氣）。
[0016] 術(shù)語(yǔ)"天然氣"在本文是指可通過(guò)常規(guī)方法(例如，多孔儲(chǔ)層的鉆孔和注水法)或非 常規(guī)方法(例如，具有低透氣性的地層的水力壓裂、水平鉆孔或定向鉆孔)獲得的天然存在 的氣體混合物。氣體混合物由甲烷和其他化合物(包括其他&化合物）以及其他低碳烷烴氣 體(例如像，乙烷、丙烷、丁烷、戊烷等）、二氧化碳、氮?dú)狻⒘蚧瘹涞燃捌浣M合組成。非常規(guī)天 然氣可獲自例如像以下的來(lái)源:致密砂巖氣，其形成于砂巖或碳酸鹽巖中；煤層甲烷，其形 成于煤藏中并吸附于煤炭顆粒中；頁(yè)巖氣，其形成于細(xì)粒度頁(yè)巖中并吸附于粘土顆粒中或 保留于小空隙或微裂縫內(nèi)；甲烷水合物，其是在低溫和高壓下在諸如海洋下和永久凍土的 地點(diǎn)中形成的天然氣和水的結(jié)晶組合。
[0017] 如本文使用，術(shù)語(yǔ)"&基質(zhì)"或化合物"是指缺少碳-碳鍵的任何含碳分子或組合 物。示例性(^基質(zhì)包括合成氣、甲烷、甲醇、甲醛、甲酸或其鹽、一氧化碳、二氧化碳、甲基化 胺類(例如，甲胺、二甲胺、三甲胺等）、甲基化硫醇類、甲基鹵素(例如，溴甲烷、氯甲烷、碘代 甲烷、二氯甲烷等）、氰化物或其任何組合。
[0018] 在本公開(kāi)的某些實(shí)施方案中，天然氣來(lái)源的原料可為天然氣、來(lái)自天然氣的(^基 質(zhì)或合成氣。通常，(^基質(zhì)為甲烷。已利用天然氣來(lái)源的碳基質(zhì)作為原料的示例性重組&代 謝微生物展現(xiàn)出不同的同位素碳標(biāo)記，這在本文中進(jìn)行了更加詳細(xì)的描述。這種顯著的同 位素碳標(biāo)記還通過(guò)此類重組微生物的組合物和產(chǎn)物(例如，生物質(zhì)、碳水化合物組合物等） 來(lái)展現(xiàn)。
[0019] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供一種包含編碼碳水化合物生物合成酶的外源性 核酸的重組&代謝微生物，其中所述&代謝微生物能夠?qū)⒓淄檗D(zhuǎn)化成碳水化合物。示例性碳 水化合物為葡聚糖。在一些實(shí)施方案中，碳水化合物為β_(1，3)_葡聚糖，并且可為支化或非 支化的或其組合。通常，&代謝微生物為非光合&代謝微生物。
[0020] 如本文使用，"(^代謝微生物"或代謝非光合微生物"是指具有使用(^基質(zhì)作為 能量來(lái)源或作為其主要的能量和生物質(zhì)來(lái)源的能力，并且可或可不使用其他碳基質(zhì)(諸如 糖和復(fù)雜碳水化合物)獲得能量和生物質(zhì)的任何微生物。例如，&代謝微生物可氧化&基質(zhì)， 諸如甲烷或甲醇。謝微生物包括細(xì)菌(諸如甲烷氧化菌和甲基營(yíng)養(yǎng)菌)和酵母。在某些 實(shí)施方案中，&代謝微生物不包括光合微生物，諸如藻類。在一些實(shí)施方案中，&代謝微生物 將為"專性Q代謝微生物"，意指其唯一的能量來(lái)源為Q基質(zhì)。在其他實(shí)施方案中，&代謝微 生物(例如，甲烷氧化菌)將在&基質(zhì)原料存在下培養(yǎng)(即，使用&基質(zhì)作為能量來(lái)源）。
[0021] 本公開(kāi)的重組&代謝微生物經(jīng)過(guò)改造而用于所需碳水化合物的增強(qiáng)的生產(chǎn)，并且 在一個(gè)實(shí)施方案中，包含編碼碳水化合物生物合成(CB)酶的外源性核酸。術(shù)語(yǔ)"碳水化合物 生物合成酶"和"CB酶"在本文可互換地使用以指涉及通過(guò)重組宿主&代謝微生物進(jìn)行的碳 水化合物的生產(chǎn)的酶。
[0022] 編碼用于本公開(kāi)的實(shí)踐中的CB酶的外源性核酸通常經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化以在重組宿 主心代謝微生物中最佳表達(dá)，并且編碼原生自與所述宿主(^微生物異源的物種或者作為存 在于自然界中的酶的突變體(即，變體)的酶。
[0023] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"碳水化合物"是指單糖、二糖或多糖。用于本公開(kāi)的實(shí)踐中的適 合的外源性核酸包括編碼涉及單糖，例如像葡萄糖、果糖、核糖、甘油醛、半乳糖等;二糖，例 如像乳糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖(cellulobiose)等及其混合物;或多糖，包括例如非支化 或支化的葡聚糖等及其混合物的生產(chǎn)的酶的那些外源性核酸。實(shí)例性葡聚糖包括α-葡聚 糖，例如像右旋糖酐、糖原、支鏈淀粉、淀粉等以及葡聚糖，例如像β-l，4-葡聚糖（即，纖維 素）、β-1，3-葡聚糖、0-(1，3)(1，4)-葡聚糖、0-(1，3)(1，6)-葡聚糖等及其混合物。
[0024] 在具體實(shí)施方案中，CB酶是涉及非支化或支化的葡聚糖或其混合物的生產(chǎn)的酶。 已知葡聚糖具有有益的治療性質(zhì)，包括作為強(qiáng)力的免疫興奮劑以及良性和惡性腫瘤的強(qiáng) 力詰抗劑。還已知β -葡聚糖降低膽固醇和甘油三酸酯水平。參見(jiàn)，D.Akramieng等，Medicina (1?1111^)，2〇〇7;43(8):597。0-葡聚糖是由具有0-(1，3)和/或0-(1，4)和/或0-(1，6)鍵的0-D-吡喃葡萄糖基單位構(gòu)成的葡萄糖聚合物的異質(zhì)組。它們已從數(shù)個(gè)來(lái)源中分離，所述來(lái)源 包括植物(燕麥、大麥、麩皮、海藻、玉米、大豆等）、細(xì)菌（例如，卡氏肺孢菌(Pneumocyst is carinii)、新型隱球菌（Cryptococcus neoformans)、煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus)、 莢膜組織胞楽菌（Histoplasma capsulatum)、白色念珠菌（Candida albicans)等）以及真 菌（即，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)和蘑燕，例如像香燕（shiitake)(香燕 (Lentinus edodes))、灰樹(shù)花(maitake)(灰樹(shù)花(Grifola frondosa))、裂裥菌素(裂裙菌 (Schizophillum commune)和SSG(核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum))。自 1980年以來(lái)在 日本來(lái)自香菇和裂褶菌的β-葡聚糖提取物已用于治療癌癥。同上。
[0025] 適用于本公開(kāi)的實(shí)踐中的外源性核酸包括編碼涉及糖異生、糖原生成、α-或β-葡 聚糖生物合成和已知產(chǎn)生碳水化合物的其他代謝途徑的酶的那些外源性核酸。
[0026] 適合的外源性核酸包括編碼選自由以下組成的組的糖異生酶的那些外源性核酸： 丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘 油醛-3-磷酸脫氫酶、Α型醛縮酶、果糖1，6_二磷酸酶、磷酸果糖激酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶、己糖 激酶、葡糖-6-磷酸等。
[0027] 其他適合的外源性核酸包括編碼選自由以下組成的組的糖原生成酶的那些外源 性核酸:葡糖-1-磷酸腺苷?；D(zhuǎn)移酶、糖原合成酶等。
[0028] 上述酶類可見(jiàn)于數(shù)個(gè)異源性物種中，包括微生物(例如像細(xì)菌和酵母，包括例如大 腸桿菌(E.coli)、谷氨酸棒桿菌(C.glutamicum)、釀酒酵母等）以及高級(jí)真菌(諸如，蘑燕 等）以及藻類和植物。
[0029] 適合的外源性核酸包括編碼葡聚糖生物合成酶(例如像葡聚糖合酶）的那些外源 性核酸。示例性葡聚糖合酶為β-1，3_葡聚糖合酶。所述外源性核酸可編碼來(lái)自以下物種的 葡聚糖生物合成酶(例如，葡聚糖合酶(例如像β-l，3-葡聚糖合酶））：植物(燕麥、大麥、麩 皮、海藻、玉米、大豆等）、細(xì)菌(例如，卡氏肺孢菌、新型隱球菌、煙曲霉菌、莢膜組織胞漿菌、 白色念珠菌等)或真菌（即，釀酒酵母和蘑燕，例如像香燕(香燕(Lentinus edodes))、灰樹(shù) 花(灰樹(shù)花(Grifola frondosa))、裂裥菌素(裂裙菌(Schizophillum commune)和SSG(核盤 菌(Sclerotinia sclerotiorum))。數(shù)個(gè)β-(1,3)-葡聚糖合酶的氨基酸和核酸序列是已知 的。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利號(hào)5，194,600、W099/49047和EP 0 724 644 B1，這些專利均以引 用方式并入本文。在某些具體實(shí)施方案中，外源性核酸編碼具有在下文表Α中示出的以下任 何SEQ NO的氨基酸序列的碳水化合物生物合成酶：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、 26、28、30、32、34、36或38。如上所述，外源性核酸通常經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化以在重組&微生物中 最佳表達(dá)。表A還提供了編碼這些CB酶的示例性核酸序列。這些核酸序列已經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化 以在莢膜甲基球菌(]^1：1171〇(30(^118〇&口8111&1：118)1^1：11中表達(dá)。
[0030] 表A:示例性碳水化合物生物合成酶
[0031]
[0032] 用于本公開(kāi)的實(shí)踐中的適合的外源性核酸包括編碼變體CB酶序列的那些外源性 核酸，所述變體CB酶序列與參照或親本野生型多肽序列（例如像，對(duì)應(yīng)于以下SEQ ID N0中 的任何一個(gè)的參照序列：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36或38)至 少90 %、至少91 %、至少92 %、至少93 %、至少94%、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少 98%或至少99%相同，條件是所述變體保留目標(biāo)碳水化合物生物合成酶活力。在某些實(shí)施 方案中，CB酶變體多肽將包括在預(yù)定位點(diǎn)處相對(duì)于參照或親本野生型CB酶的至少一個(gè)氨基 酸置換(例如，1、2、3、5、6、7、8、9或10或更多或多達(dá)20、25或30個(gè)置換），條件是變體保留目 標(biāo)CB酶活力。CB酶變體多肽還可包含一個(gè)或多個(gè)保守置換。"保守置換"在本領(lǐng)域公認(rèn)為一 個(gè)氨基酸對(duì)具有相似性質(zhì)的另一個(gè)氨基酸的置換。示例性保守置換為本領(lǐng)域所熟知(參見(jiàn)， 例如，WO 97/09433，第10頁(yè)；Lehninger,Biochemistry，第2版；Worth Publishers，Inc ·ΝΥ: ΝΥ(1975)，第71-77頁(yè)；Lewin，Genes IV，0xford University Press,NY and Cell Press, Cambridge，MA(1990)，第8頁(yè)，這些文獻(xiàn)均以引用方式并入本文）。用于產(chǎn)生編碼此類變體酶 的適合的外源性核酸的方法在本文進(jìn)行了更加詳細(xì)的描述。
[0033] 兩個(gè)或更多個(gè)核酸或氨基酸序列之間的"同一性百分比"是序列共有的相同位點(diǎn) 的數(shù)量的函數(shù)（即，同一性％=相同位點(diǎn)的數(shù)量/位點(diǎn)的總數(shù)X 1〇〇)，考慮了為優(yōu)化兩個(gè)或 更多個(gè)序列的比對(duì)而需要引入的缺口數(shù)和各缺口的長(zhǎng)度。兩個(gè)或更多個(gè)序列之間的序列比 較和同一性百分比的測(cè)定可使用數(shù)學(xué)算法諸如默認(rèn)參數(shù)的BLAST和Gapped BLAST程序來(lái)完 成（例如，Altschul等，J.Mol .Biol.215:403, 199 0;還參見(jiàn)，BLASTN 于萬(wàn)維網(wǎng) ncbi . nlm. nih. gov/BLAST，這些文獻(xiàn)均以引用方式并入本文）。
[0034] 如上所指出，編碼用于本公開(kāi)的實(shí)踐中的CB酶的外源性核酸可經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化以 在心代謝微生物中表達(dá)。原始宿主之外的重組蛋白的表達(dá)可能較為困難。例如，已在不同種 類的細(xì)菌之間觀察到密碼子使用偏好性的變化(Sharp等，Nucl. Acids. Res. 33:1141,2005， 其以引用方式并入本文）。甚至天然宿主之內(nèi)的重組蛋白的過(guò)表達(dá)也可能較為困難。在某些 實(shí)施方案中，將要引入至如本文所述的宿主中的核酸可在引入宿主細(xì)胞中之前進(jìn)行密碼子 優(yōu)化以確保蛋白質(zhì)表達(dá)有效或增強(qiáng)。密碼子優(yōu)化是指在轉(zhuǎn)化之前改變基因或核酸的編碼區(qū) 中的密碼子以反映宿主的代表性密碼子使用，而沒(méi)有改變由非天然DNA分子編碼的多肽。用 于異源宿主中最適基因表達(dá)的密碼子優(yōu)化方法先前已有所描述(參見(jiàn)，例如，Welch等，PLoS One 4: e7002，2009 ;Gustafs son 等，Trends Bio techno 1 · 22: 346，2004 ;Wu 等，Nucl .Acids Res .35:D76,2007; Villalobos等，BMC Bioinformatics 7 :285,2006;美國(guó)專利公布號(hào) 2011/0111413和2008/0292918;這些文獻(xiàn)方法的公開(kāi)以引用方式整體并入本文）。編碼適用 于本公開(kāi)的實(shí)踐中的CB酶的外源性核酸包括具有與選自由以下SEQ ID N0組成的組的核酸 參照序列至少約85 %相同的核酸序列的那些外源性核酸：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、 23、25、27、29、31、33、35和37。在一些實(shí)施方案中，編碼08酶的外源性核酸具有與選自由以 下SEQ ID N0組成的組的核酸參照序列至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、 至少約89%、至少約90%、至少約91 %、至少約92 %、至少約93%、至少約94%、至少約95 %、 至少約96%、至少約97%、至少約98%以及至少約99%序列相同的核酸序列：1、3、5、7、9、 11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35和37。編碼適用于本發(fā)明實(shí)踐中的08酶的例證 性外源性核酸包括已經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化以在莢膜甲基球菌Bath中最佳表達(dá)的序列，例如像以 下SEQ ID N0中的任何一個(gè)：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35和37。
[0035] 類似地，編碼多肽變體的本公開(kāi)的外源性核酸分子可使用以上提到的參考文獻(xiàn)中 描述的基于系統(tǒng)發(fā)育的方法來(lái)設(shè)計(jì)（美國(guó)專利號(hào)8，005，620 ;Gustaf sson等；Welch等； Villalobos等;Minshull等，這些文獻(xiàn)均以引用方式并入本文）。
[0036] 編碼碳水化合物生物合成酶的外源性核酸包括了編碼具有或保留相應(yīng)碳水化合 物生物合成酶活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的多核苷酸。通過(guò)計(jì)算多肽將底物轉(zhuǎn)化 成產(chǎn)物的能力來(lái)確定多肽是否具有特定活性的方法是本領(lǐng)域已知的。
[0037] 在一些實(shí)施方案中，外源性核酸編碼可操作地連接至編碼天然碳水化合物生物合 成酶的核酸的表達(dá)控制序列。通常，表達(dá)控制序列是導(dǎo)致天然碳水化合物生物合成酶的過(guò) 表達(dá)的一種序列。如本文所用，當(dāng)提及基因或蛋白質(zhì)時(shí)"過(guò)表達(dá)的"和"過(guò)表達(dá)"意指基因或 蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性的增加。增加的表達(dá)或活性包括經(jīng)過(guò)增加而高于野生型（天然的或非 基因工程改造的）對(duì)照或參照微生物的水平的基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性。如果在微生物 中表達(dá)或活性是非正常表達(dá)或是活躍的，則基因或蛋白質(zhì)是過(guò)表達(dá)的。如果在重組微生物 中比在野生型對(duì)照或參照微生物中表達(dá)或活性延長(zhǎng)或存在更久，則基因或蛋白質(zhì)是過(guò)表達(dá) 的。
[0038] 除上文描述的外源性核酸之外，本公開(kāi)的重組&代謝微生物還可包含增強(qiáng)所需碳 水化合物生產(chǎn)的其他遺傳修飾。例如，當(dāng)外源性核酸編碼碳水化合物生物合成酶時(shí)，重組Ci 代謝微生物還可包含可操作地連接至編碼碳水化合物生物合成酶的外源性核酸以增強(qiáng)所 需碳水化合物生產(chǎn)的外源性表達(dá)控制序列。適用于本公開(kāi)的實(shí)踐中的表達(dá)控制序列在本文 進(jìn)行了更加詳細(xì)的描述。
[0039] 另選地或另外，本公開(kāi)的重組心代謝微生物還可包含可操作地連接至編碼內(nèi)源酶 的內(nèi)源性核酸的外源性表達(dá)控制序列，內(nèi)源酶利用碳水化合物生物合成酶利用的相同底物 中的一種或多種或者利用所需碳水化合物作為底物（即，"競(jìng)爭(zhēng)性"內(nèi)源酶）。這可用來(lái)下調(diào) 競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源酶。
[0040] 在一些實(shí)施方案中，期望通過(guò)使競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源酶突變來(lái)減少或抑制所述競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源 酶活性以使其活性缺失或減弱。如本文所用的"抑制"或"抑制的"是指靶基因表達(dá)或相對(duì)于 對(duì)照、內(nèi)源性或參照分子的靶分子活性的直接或間接的改變、減少、下調(diào)、廢除或缺失，其中 該改變、減少、下調(diào)或廢除是統(tǒng)計(jì)學(xué)上、生物學(xué)上、工業(yè)上或臨床上顯著的。
[0041] 用于使(^代謝微生物中的內(nèi)源性基因功能下調(diào)、失活、敲除或缺失的各種方法是 本領(lǐng)域已知的。例如，靶向的基因破壞是用于基因下調(diào)的有效方法，其中將外源性多核苷酸 插入至結(jié)構(gòu)基因中以破壞轉(zhuǎn)錄。包含側(cè)接具有與將破壞的靶宿主基因的一部分高度同源性 的序列的外源性插入DNA(例如，遺傳標(biāo)記）的基因盒被引入至宿主Ci代謝微生物中。外源性 DNA通過(guò)天然DNA復(fù)制機(jī)制破壞靶宿主基因。等位基因交換構(gòu)建Q代謝微生物(包括甲烷氧 化菌）的缺失/插入突變株已在例如Toyama 和 Li dstrom, Microbio 1 · 144:183，1998; Stoylar 等，Microbiol · 145: 1235,1999; Ali等，Microbiol · 152:2931,2006; Van Dien等， Microbiol · 149:601，2003 ;Martin和Murrell，F(xiàn)EMS Microbiol · Lett · 127:243，2006中有所 描述，這些文獻(xiàn)均以引用方式并入本文。
[0042] 例如，在本公開(kāi)的一些實(shí)施方案中，重組(^代謝微生物還可包含內(nèi)源性糖原合成 酶活性和/或內(nèi)源性葡糖磷酸變位酶活性的缺失。還可靶向下調(diào)涉及其他途徑諸如氨基酸 合成途徑的酶以使宿主微生物的代謝活性集中于碳水化合物生物合成上。
[0043] 重組(^代謝微生物因此可經(jīng)過(guò)改造以具有生產(chǎn)提高的水平的所需碳水化合物的 能力。在這些實(shí)施方案中的一些中，當(dāng)在天然氣來(lái)源的原料(例如，天然氣、甲烷等)存在下 在至少一組培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)重組α代謝微生物產(chǎn)生大于天然α代謝微生物所產(chǎn)生 的水平至少約10%并且多達(dá)天然Ci代謝微生物所產(chǎn)生的水平約2倍至約3倍、4倍、5倍、10 倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍以及多達(dá)約500倍或約1000倍的水 平的所需碳水化合物。在其他實(shí)施方案中，當(dāng)在天然氣來(lái)源的原料存在下在至少一組培養(yǎng) 條件下培養(yǎng)時(shí)，重組&代謝微生物產(chǎn)生大于天然&代謝微生物所產(chǎn)生的水平至少約15%、至 少約20%、至少約25 %、至少約30 %、至少約35%、至少約40%、至少約45 %、至少約50 %、至 少55 %、至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少 約90%或至少約95%并且多達(dá)天然Q代謝微生物所產(chǎn)生的水平約2倍至約3倍、4倍、5倍、10 倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍至約500倍或約1000倍的水平的所 需碳水化合物。通常，當(dāng)在天然氣來(lái)源的原料存在下在至少一組培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時(shí)，本發(fā)明 的重組&代謝微生物所產(chǎn)生的所需碳水化合物產(chǎn)品的提高的水平是天然&代謝微生物所產(chǎn) 生的水平的至少約2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍 或100倍。
[0044] 用于外源性核酸在微生物生物體中表達(dá)的重組方法是本領(lǐng)域所熟知的。此類方法 可見(jiàn)于例如Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(2001);以及Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，Baltimore，MD( 1999)中有所描述，這些文獻(xiàn)均以引用方式并 入本文。編碼酶或其功能片段的核酸分子的遺傳修飾可向從天然存在狀態(tài)改變的重組細(xì)胞 賦予生化或代謝能力。
[0045] 如本文所用，當(dāng)提及核酸、多肽(諸如酶）、化合物或活性時(shí)術(shù)語(yǔ)"內(nèi)源性"和"天然" 是指正常存在于宿主細(xì)胞中的核酸、多肽、化合物或活性。術(shù)語(yǔ)"同源的"或"同系物"是指來(lái) 自分子或活性與存在于或來(lái)源于宿主細(xì)胞(種或品系）的分子或活性相同或相似的外源性 (非天然)來(lái)源的分子或活性。
[0046] 如本文使用，當(dāng)提及核酸分子、構(gòu)建體或序列時(shí)術(shù)語(yǔ)"外源性"是指并非原生自細(xì) 胞的核酸分子或核酸分子序列的一部分(所述核酸分子或核酸分子序列的一部分在所述細(xì) 胞中表達(dá)）、原生自已改變或突變的宿主細(xì)胞的核酸分子或核酸分子的一部分或與相似條 件下的天然表達(dá)水平相比具有改變的表達(dá)的核酸分子。例如，外源控制序列(例如，啟動(dòng)子、 增強(qiáng)子)可用來(lái)以不同于在自然界或培養(yǎng)物中正常表達(dá)的基因或核酸分子的方式調(diào)控基因 或核酸分子的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，外源性核酸分子可與天然宿主細(xì)胞基因同源，但可 具有改變的表達(dá)水平或具有不同的序列或兩者。在其他實(shí)施方案中，外源性核酸分子對(duì)于 宿主細(xì)胞或宿主基因組來(lái)說(shuō)可能不是內(nèi)源的，但反而可能已通過(guò)接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔 等添加至宿主細(xì)胞中，其中添加的分子可整合至宿主基因組中或可作為染色體外遺傳物質(zhì) (例如，質(zhì)粒或其他自主復(fù)制型載體)而存在。
[0047] 在某些實(shí)施方案中，多于一種的外源性核酸分子可引入至宿主細(xì)胞中作為單獨(dú)核 酸分子、作為多順?lè)醋雍怂岱肿印⒆鳛榫幋a融合蛋白的單一核酸分子或其任何組合，并且仍 視為多于一種的外源性核酸。例如，可修飾(^代謝微生物以表達(dá)兩種或更多種外源性核酸 分子，所述外源性核酸分子可能相同或不同，編碼一種或多種如本文所公開(kāi)的碳水化合物 生物合成酶。在某些實(shí)施方案中，編碼碳水化合物生物合成酶的多核苷酸分子的多個(gè)拷貝 被引入至宿主細(xì)胞中，所述多個(gè)拷貝可以是編碼相同碳水化合物生物合成酶或不同碳水化 合物生物合成酶的多核苷酸的兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)或更多 個(gè)拷貝。
[0048] 宿主細(xì)胞以及轉(zhuǎn)化方法
[0049] 在實(shí)施本發(fā)明的實(shí)踐的過(guò)程中，上文描述的外源性核酸被轉(zhuǎn)化至宿主細(xì)胞中，該 宿主細(xì)胞為Ci代謝微生物。使用的&代謝微生物可以是天然適應(yīng)菌株(例如，進(jìn)行發(fā)酵以選 擇與親本菌株相比具有提高的生長(zhǎng)速率和增加的總生物質(zhì)產(chǎn)量的菌株)或者被重組修飾以 產(chǎn)生或過(guò)表達(dá)目標(biāo)碳水化合物生物合成酶和/或具有增加的生長(zhǎng)速率。通常，&代謝微生物 是非光合&微生物(例如，并非藻類或植物）。
[0050] 在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)使用Q代謝微生物，該Q代謝微生物為原核生物或細(xì) 菌，諸如甲基單胞菌屬（Methy lomonas)、甲基細(xì)菌屬（Methylobacter)、甲基球菌屬 (Methylococcus)、甲基彎曲菌屬(Methylosinus)、甲基抱囊菌屬(Methylocystis)、甲基微 菌屬(Methylomicrobium)、甲燒單胞菌屬(Methanomonas)、嗜甲基菌屬(Methylophilus)、 甲基菌屬（Methylobacillus)、甲基桿菌屬（Methylobacterium)、生絲微菌屬 (Hyphomicrobium)、黃色桿菌屬（Xanthobacter)、芽抱桿菌屬（Baci 1 lus)、副球菌屬 (Paracoccus)、諾卡氏菌屬（Nocardia)、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter)、紅假單胞菌屬 (Rhodopseudomonas)或假單胞菌屬（Pseudomonas) 〇
[0051] 在其他實(shí)施方案中，使用的(^代謝細(xì)菌為甲烷氧化菌或甲基營(yíng)養(yǎng)菌。示例性甲烷 氧化菌包括甲基單胞菌屬、甲基細(xì)菌屬、甲基球菌屬、甲基彎曲菌屬、甲基孢囊菌屬、甲基微 菌屬、甲烷單胞菌屬、甲基胞菌屬(Methylocella)或其組合。示例性甲基營(yíng)養(yǎng)菌包括扭脫甲 基桿菌（Me thy lobacterium extorquens)、耐福射甲基桿菌（Methylobacterium ^(1；[01：016^118)、楊樹(shù)甲基桿菌（]\161：1171〇匕&(^61'；[11111卩0卩111；0、氯甲燒甲基桿菌 (Methylobacterium chloromethanicum)、結(jié)瘤甲基桿菌（Methylobacterium nodulans)或 其組合。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"甲基營(yíng)養(yǎng)菌"是指能夠氧化含有至少一個(gè)碳并且不含碳-碳鍵的 任何形式(例如，固體、液體、氣體)的任何化合物的任何細(xì)菌。在某些實(shí)施方案中，甲基營(yíng)養(yǎng) 菌可為甲烷氧化菌。例如，"甲烷氧化菌"是指具有氧化甲烷作為碳和能量來(lái)源(其可能是主 要的碳和能量來(lái)源)的能力的任何甲基營(yíng)養(yǎng)菌。示例性甲烷氧化菌包括甲基單胞菌屬、甲基 細(xì)菌屬、甲基球菌屬、甲基彎曲菌屬、甲基孢囊菌屬、甲基微菌屬或甲烷單胞菌屬。
[0052]甲烷氧化菌基于它們的碳同化途徑和內(nèi)膜結(jié)構(gòu)而分為三組：1型（γ變形菌門）、11 型(α變形菌門）和X型（γ變形菌門）。1型甲烷氧化菌利用核酮糖單磷酸(RuMP)途徑進(jìn)行碳 同化，而II型甲烷氧化菌利用絲氨酸途徑。X型甲烷氧化菌利用RuMP途徑，但還表達(dá)低水平 的絲氨酸途徑的酶。用于本發(fā)明的實(shí)踐中的甲烷氧化菌包括專性甲烷氧化菌，其只可利用 Ci基質(zhì)作為碳和能量來(lái)源；以及兼性甲烷氧化菌，其天然具有利用一些多碳基質(zhì)作為碳和 能量來(lái)源的能力。
[0053]用于本發(fā)明的實(shí)踐中的示例性兼性甲烷氧化菌包括甲基胞菌屬、甲基孢囊菌屬和 甲基莢膜菌屬（Methylocapsa)的一些種（例如，森林甲基胞菌（Methylocella silvestris)、沼澤甲基胞菌（Methylocella palustris)、凍原甲基胞菌（Methylocella tundrae)、道氏甲基抱囊菌菌株SB2(Methylocystis daltona strain SB2)、苔蘚甲基抱囊 菌(Methylocystis bryophila)和金色甲基莢膜菌KYG(Methylocapsa aurea KYG))、嗜有 機(jī)甲基桿菌（Methylobacterium organophilum) (ATCC 27,886)、嗜油甲基菌（Methylibium petroleiphilum)或其高生長(zhǎng)變體。用于本發(fā)明的實(shí)踐中的示例性專性甲烷氧化菌包括莢 膜甲基球菌Bath(NCIMB 11132)、甲基單胞菌屬 16a(Methylomonas sp.l6a)(ATCC PTA 2402)、發(fā)抱甲基彎曲菌0B3b(Methylosinus trichosporium 0B3b)(NRRL B_ll，196)、生抱 甲基彎曲菌（Methylosinus sporium) (NRRL B_11，197)、小甲基抱囊菌（Methylocystis parvus)(NRRL B_ll，198)、甲焼甲基單胞菌（Methylomonas methanica)(NRRL B_ll，199)、 白色甲基單胞菌(]^七1171〇111〇11&8 3113118)(順此8-11，200)、莢膜甲基細(xì)菌￥(]^也71〇匕&(^6『 capsulatus Y)(NRRL B_ll，201)、鞭毛甲基單胞菌屬AJ_3670(Methylomonas flagellata sp·AJ-3670)(FERMP-2400)、極端嗜酸甲烷氧化菌（Methylacidiphiluminfernorum)、 Methylacidiphilum fumariolicum^B^^EPS^^CMethylomicrobium alcaliphilum) > Methyloacida kamchatkensis或其高生長(zhǎng)變體。
[0054] 用于本發(fā)明的實(shí)踐中的適合的心代謝微生物包括合成氣代謝細(xì)菌，例如像梭菌屬 (Clostridium)、穆?tīng)柺暇鷮伲∕oorella)、火球菌屬（Pyrococcus)、真桿菌屬 (Eubacterium)、脫硫桿菌屬（Desulfobacterium)、一氧化碳嗜熱菌屬 (0&!'13〇17(1〇丨1161'111118)、產(chǎn)醋菌屬(八〇6丨〇8611；!_11111)、醋酸桿菌屬（八〇6丨(^3(^61'；!_11111)、厭氧醋菌 屬（Acetoanaerobium)、丁酸桿菌屬（Butyribaceterium)、消化鏈球菌屬 (Pep to streptococcus)等。示例性合成氣代謝細(xì)菌包括自產(chǎn)乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum)、楊氏梭菌（Clostridium 1 jungdahli )、拉氏梭菌（Clostridium ragsdalei)、嗜駿基梭菌（Clostridium carboxydivorans)、食甲基丁 酸桿菌 (Butyribacteriummethylotrophicum)、伍氏梭菌（Clostridium woodii )、新產(chǎn)丙醇梭菌 (Clostridium neopropanologen)^〇
[0055] 用于本發(fā)明的實(shí)踐中的其他適合的Q代謝微生物包括真核生物，例如像酵母，包 括假絲酵母屬(Candida)、亞羅酵母屬(Yarrowia)、漢遜酵母屬(Hansenula)、畢赤酵母屬 (Pichia)、球擬酵母屬（Torulopsis)、紅酵母屬(Rhodotorula)等。
[0056] 用可幫助生長(zhǎng)的異源生物體，本公開(kāi)的每種微生物均可作為分離培養(yǎng)物而生長(zhǎng)， 或者這些微生物中的一種或多種可組合以產(chǎn)生混合培養(yǎng)物。當(dāng)提及微生物時(shí)術(shù)語(yǔ)"異源的" 是指與宿主細(xì)胞不同的種類。在其他實(shí)施方案中，本公開(kāi)的&代謝非光合微生物為專性&代 謝非光合微生物，諸如專性甲烷氧化菌或甲基營(yíng)養(yǎng)菌。
[0057]前述心代謝微生物中的任何一種均可用作親本或參照宿主細(xì)胞以制備本公開(kāi)的 重組G代謝微生物。如本文使用，術(shù)語(yǔ)"重組體"是指具有至少一種遺傳改變或已通過(guò)引入 外源性核酸分子來(lái)修飾的非天然存在的生物體、微生物、細(xì)胞、核酸分子或載體，或者是指 已被改變以使得內(nèi)源性核酸分子或基因的表達(dá)可受控制的細(xì)胞。重組體還指從具有一種或 多種此類修飾的細(xì)胞衍生或者作為具有一種或多種此類修飾的細(xì)胞的子代的細(xì)胞。遺傳改 變包括例如引入編碼蛋白質(zhì)或酶的可表達(dá)的核酸分子的修飾或其他核酸分子添加、缺失、 置換或細(xì)胞遺傳物質(zhì)的其他功能的改變。例如，重組細(xì)胞可表達(dá)并非以相同形式存在于天 然細(xì)胞（即，未修飾或野生型細(xì)胞）中的基因或其他核酸分子，或者可提供改變的表達(dá)模式 的內(nèi)源性基因，即否則可過(guò)表達(dá)、欠表達(dá)、最低限度地表達(dá)或根本不表達(dá)的此類基因。
[0058] 本文描述的任何重組Q代謝微生物或甲烷氧化菌均可轉(zhuǎn)化以包含至少一種外源 性核酸來(lái)提供具有新的或增強(qiáng)的活性(例如，酶活性）的宿主，或者可使用本領(lǐng)域已知的任 何各種方法進(jìn)行遺傳修飾以移除或基本減少內(nèi)源性基因功能。
[0059] 轉(zhuǎn)化是指將核酸分子(例如，外源性核酸分子）引入至宿主細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì) 胞可以染色體外的方式攜帶外源性核酸分子或者整合至染色體中。整合至宿主細(xì)胞基因組 和自主復(fù)制型載體通常引起所轉(zhuǎn)化的核酸分子的遺傳學(xué)上穩(wěn)定的遺傳。含有轉(zhuǎn)化的核酸分 子的宿主細(xì)胞被稱為"非天然存在的"或"基因工程改造的"或"重組的"或"轉(zhuǎn)化的"或"轉(zhuǎn)基 因的"細(xì)胞(例如，細(xì)菌）。
[0060] 用于外源性核酸在α代謝微生物(例如，甲烷氧化菌）中的表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá) 載體是已知的。
[0061 ] Ci代謝細(xì)菌的電穿孔在本文有所描述，并且先前已在例如Toyama等，F(xiàn)EMS Microbiol·Lett·166:1，1998;Kim和Wood，Appl.Microbiol·Biotechnol·48:105，1997; Yoshida等，Biotechnol · Lett · 23:787，2001 以及美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2008/0026005中有所 描述。
[0062] 細(xì)菌接合，是指涉及供體細(xì)胞和受體細(xì)胞的直接接觸的特定類型的轉(zhuǎn)化，更加常 用于將核酸分子轉(zhuǎn)移至&代謝細(xì)菌中。細(xì)菌接合涉及將"供體"細(xì)胞和"受體"細(xì)胞以彼此緊 密接觸的方式混合在一起。接合通過(guò)形成供體細(xì)菌與受體細(xì)菌之間的胞質(zhì)聯(lián)絲，隨著新合 成的供體核酸分子單向轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞中而發(fā)生。接合反應(yīng)中的受體是可通過(guò)水平轉(zhuǎn)移從 供體細(xì)菌接受核酸的任何細(xì)胞。接合反應(yīng)中的供體是含有接合質(zhì)粒、接合轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)移質(zhì) 粒(mobilized plasmid)的細(xì)菌。供體質(zhì)粒的物理轉(zhuǎn)移可通過(guò)自主轉(zhuǎn)移質(zhì)?；蚪柚?輔 助"質(zhì)粒而發(fā)生。涉及G代謝細(xì)菌的接合在本文有所描述，并且先前已在Stolyar等， Mikrobiologiya 64:686,1995;Motoyama等，Appl.Micro.Biotech.42:67,1994;Lloyd等， Arch .Microbiol · 171:364,1999; PCT 公布號(hào) W0 02/18617;以及 Ali等，Microbiol. 152: 2931,2006中有所描述。
[0063] 適用于本發(fā)明的實(shí)踐中的表達(dá)控制序列包括例如啟動(dòng)子、終止子、增強(qiáng)子、阻遏 物、誘導(dǎo)物等。適用于本發(fā)明的實(shí)踐中的啟動(dòng)子可為組成型、滲漏型（leaky)或誘導(dǎo)型，并且 原生自或非原生自所用的宿主細(xì)胞。示例性啟動(dòng)子包括丙酮酸脫羧酶(PDC)啟動(dòng)子、磷酸脫 氧木酮糖合成酶啟動(dòng)子、甲醇脫氫酶啟動(dòng)子(MDH)(例如像，來(lái)自莢膜甲基球菌Bath(登錄號(hào) MCA0779)的mxaF基因的上游基因間區(qū)中的啟動(dòng)子或來(lái)自M.extorquens的MDH啟動(dòng)子(參見(jiàn)， Springer等，F(xiàn)EMS Microbiol. Lett. 160:119(1998))、6_磷酸己酮糖合成酶啟動(dòng)子、核糖體 蛋白S16啟動(dòng)子、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子、絲氨酸乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子、磷酸烯醇 丙酮酸羧化酶啟動(dòng)子、T5啟動(dòng)子、Trc啟動(dòng)子、用于PHA合成的啟動(dòng)子（Foe liner等， Appl .Microbiol .Biotechnol .40: 284,1993)、丙酮酸脫駿酶啟動(dòng)子（Tokuhiro等， Appl · Biochem. Biotechnol · 131: 795，2006)、乳糖操縱子P lac 啟動(dòng)子（Toyama等， Microbiol · 143:595，1997)、雜合啟動(dòng)子諸如Ptrc(Brosius等，Gene27 :161，1984)、從甲基 營(yíng)養(yǎng)菌(EP 296484)、甲烷氧化菌中的天然質(zhì)粒鑒定出的啟動(dòng)子等。
[0064] 此外，可利用用于外源性核酸分子的高表達(dá)的適合的同源性或異源性啟動(dòng)子。例 如，美國(guó)專利號(hào)7,098,005描述了用于在甲烷或甲醇存在下Q代謝細(xì)菌中的異源性編碼核 酸的高表達(dá)的啟動(dòng)子的使用。
[0065] 在某些實(shí)施方案中，期望使編碼碳水化合物生物合成酶的外源性核酸的調(diào)控型表 達(dá)優(yōu)化非天然存在的Ci代謝微生物的生長(zhǎng)速率并且可在各種碳源條件下改善細(xì)菌生長(zhǎng)。這 可通過(guò)使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0066] 在某些實(shí)施方案中，編碼CB酶的核酸可操作地連接至誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。用于本發(fā)明 的實(shí)踐中的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)包括本領(lǐng)域已知的那些，并且包括四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系 統(tǒng)；IPTG/lac操縱子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)、熱休克誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng);金屬應(yīng)答啟動(dòng)子系統(tǒng)； 硝酸鹽誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng);光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng);蛻皮激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)、所描述的用 于甲基營(yíng)養(yǎng)菌和甲烷氧化菌的誘導(dǎo)型/調(diào)控型系統(tǒng)(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)朥S 2010/ 0221813,其以引用方式并入本文)等。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，非天然存在的(^代謝微生 物(例如，甲烷氧化菌、甲基營(yíng)養(yǎng)菌)包含：（1)編碼CB酶，可操作地連接至側(cè)接lacO操縱子序 列的操縱子的外源性核酸；以及(2)編碼lacl阻遏蛋白，可操作地連接至組成型啟動(dòng)子(例 如，6-磷酸己酮糖合成酶啟動(dòng)子)的外源性核酸。誘導(dǎo)在LacI阻遏蛋白結(jié)合至側(cè)接LDH或其 他啟動(dòng)子的lacO操縱子序列時(shí)啟動(dòng)，阻止轉(zhuǎn)錄。IPTG結(jié)合lacl阻遏物并將其從lacO序列中 釋放，允許轉(zhuǎn)錄。通過(guò)使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)，可通過(guò)添加誘導(dǎo)物來(lái)控制乳酸鹽合成。
[0067] 用于本發(fā)明的實(shí)踐中的表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)載體任選地含有遺傳因子，例如像一個(gè)或 多個(gè)用于翻譯起始的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)、多腺苷酸化信號(hào)、限制性內(nèi)切酶位 點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、其他編碼段等。在某些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子和/或密碼子優(yōu)化(上文進(jìn)行了 詳細(xì)描述)用于編碼一種或多種碳水化合物生物合成酶的外源性多核苷酸在宿主甲烷氧化 菌中的高組成型表達(dá)。還可利用外源性核酸在宿主甲烷氧化菌中的調(diào)控型表達(dá)。例如，可使 用如例如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?010/0221813中所述的甲基營(yíng)養(yǎng)菌和甲烷氧化菌中的重組蛋白 表達(dá)的誘導(dǎo)型/調(diào)控型系統(tǒng)。
[0068] 生產(chǎn)所需碳水化合物的方法
[0069] 本公開(kāi)提供一種通過(guò)在甲烷(來(lái)自任何來(lái)源)或天然氣來(lái)源的碳原料存在下在足 以產(chǎn)碳水化合物的條件下培養(yǎng)本公開(kāi)的重組&代謝微生物來(lái)生產(chǎn)碳水化合物的方法。在具 體實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供一種通過(guò)在天然氣來(lái)源的碳原料存在下在足以產(chǎn)生碳水化合物 的條件下培養(yǎng)重組&代謝微生物來(lái)生產(chǎn)碳水化合物的方法，其中所述&代謝微生物包含編 碼碳水化合物生物合成酶的外源性核酸。通常，天然氣來(lái)源的碳原料是天然氣、甲烷或合成 氣。實(shí)施例1闡明了用于培養(yǎng)示例性&代謝微生物的條件。
[0070] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供一種生產(chǎn)碳水化合物的方法，所述方法包括在 甲烷存在下在足以產(chǎn)生碳水化合物的條件下培養(yǎng)重組Q代謝微生物，其中所述&代謝微生 物包含編碼碳水化合物生物合成酶的外源性核酸。在此實(shí)施方案中，來(lái)自任何來(lái)源的甲烷 適用于本發(fā)明的實(shí)踐中，包括天然氣、生物甲烷等。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"生物甲燒"是指由有 機(jī)物例如像糞肥、廢水泥漿、城市固體廢物等在缺氧情況下的發(fā)酵產(chǎn)生的甲烷。
[0071] 各種培養(yǎng)方法可用于本文描述的微生物。例如，(^代謝微生物(諸如甲烷氧化菌或 甲基營(yíng)養(yǎng)菌)可通過(guò)分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)方法來(lái)生長(zhǎng)。在某些實(shí)施方案中，培養(yǎng)物生長(zhǎng)于受 控培養(yǎng)裝置諸如發(fā)酵罐、生物反應(yīng)器、中空纖維小室等中。一般對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng)常負(fù)責(zé) 在一些系統(tǒng)中大量生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物或中間物，而靜止期或指數(shù)期后生產(chǎn)可在其他系統(tǒng)中獲 得。
[0072] 經(jīng)典分批培養(yǎng)方法是將培養(yǎng)基組成在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)設(shè)定并且在培養(yǎng)過(guò)程期間不改 變的封閉系統(tǒng)。也就是說(shuō)，將培養(yǎng)基在培養(yǎng)過(guò)程開(kāi)始時(shí)用選擇的一種或多種微生物接種，然 后使其生長(zhǎng)而不向系統(tǒng)中添加任何東西。如本文使用，"分批"培養(yǎng)涉及不改變初始添加的 具體碳源的量，而可在培養(yǎng)期間監(jiān)測(cè)并改變因素如pH和氧濃度的控制。在分批系統(tǒng)中，系統(tǒng) 的代謝物和生物質(zhì)組成不斷地變化直至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)。在分批培養(yǎng)物內(nèi)，細(xì)胞(例如，細(xì)菌如 甲基營(yíng)養(yǎng)菌)一般從靜態(tài)遲緩期移至高生長(zhǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期直至生長(zhǎng)速率降低或停止的靜止期 (并且如果條件不變化，則將最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡）。
[0073] 補(bǔ)料分批系統(tǒng)是隨著培養(yǎng)進(jìn)行而以增量添加目標(biāo)碳基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)分批系統(tǒng)的變型。 當(dāng)細(xì)胞代謝可能受降解物阻遏抑制時(shí)并且當(dāng)期望在培養(yǎng)基中具有有限量的基質(zhì)時(shí)，補(bǔ)料分 批系統(tǒng)是適用的。由于很難測(cè)量補(bǔ)料分批系統(tǒng)中的實(shí)際基質(zhì)濃度，因此基于可測(cè)量因素諸 如PH、溶解氧和廢氣分壓的變化來(lái)進(jìn)行估計(jì)。分批和補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法在本領(lǐng)域中是常見(jiàn) 的并且是已知的（參見(jiàn)，例如，Thomas D.Brock，Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology，第2版（1989)Sinauer Associates , Inc ., Sunderland,MA； Deshpande，Appl.Biochem.Biotechno1·36:227，1992)〇
[0074] 向生物反應(yīng)器中連續(xù)添加界定的培養(yǎng)基，同時(shí)將等量的用過(guò)的（"受制約的"）培養(yǎng) 基同時(shí)移除以進(jìn)行加工，就此意義上而言連續(xù)培養(yǎng)是"開(kāi)放的"系統(tǒng)。連續(xù)培養(yǎng)通常使細(xì)胞 維持在恒定較高的液相密度下，其中細(xì)胞主要處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。另選地，連續(xù)培養(yǎng)可用固定 化細(xì)胞(例如，生物膜)來(lái)實(shí)施，其中連續(xù)地添加碳和營(yíng)養(yǎng)物并且從細(xì)胞團(tuán)塊中連續(xù)地移除 有價(jià)值的產(chǎn)物、副產(chǎn)物和廢棄產(chǎn)物。細(xì)胞固定化可使用由天然材料、合成材料或其組合構(gòu)成 的各種固體支持物來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0075] 連續(xù)或半連續(xù)培養(yǎng)允許調(diào)節(jié)一種或多種影響細(xì)胞生長(zhǎng)或最終產(chǎn)物濃度的因素。例 如，一種方法可使有限營(yíng)養(yǎng)物維持在固定比率(例如，碳源、氮)并且允許所有其他參數(shù)隨著 時(shí)間的推移而變化。在其他實(shí)施方案中，可連續(xù)地改變影響生長(zhǎng)的多種因素，同時(shí)使如通過(guò) 培養(yǎng)基渾濁度測(cè)量的細(xì)胞濃度維持恒定。連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)的目標(biāo)是維持穩(wěn)態(tài)生長(zhǎng)條件，同時(shí) 將由于培養(yǎng)基抽取而導(dǎo)致的細(xì)胞損失相對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)速率而加以平衡。調(diào)節(jié)用于連續(xù)培養(yǎng) 過(guò)程的營(yíng)養(yǎng)物和生長(zhǎng)因素的方法和使產(chǎn)物形成速率最大化的技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知 的（參見(jiàn)，Brock, 1992)。
[0076] 液相生物反應(yīng)器(例如，攪拌釜式、填充床式、一液相式、雙液相式、中空纖維膜式） 是本領(lǐng)域所熟知的，并且可用于非天然存在的微生物的生長(zhǎng)和生物催化。
[0077] 通過(guò)使用氣相生物反應(yīng)器，通過(guò)非天然存在的微生物、細(xì)胞裂解物或其無(wú)細(xì)胞部 分來(lái)從氣體而不是從液體中吸收用于生物生產(chǎn)的基質(zhì)。氣相生物反應(yīng)器與微生物的使用是 本領(lǐng)域已知的（例如，美國(guó)專利號(hào)2，793，096 ; 4，999，302 ; 5，585，266 ; 5，079，168;以及6， 143,556;美國(guó)依法注冊(cè)的發(fā)明H1430;美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2003/0032170 ;Emerging Technologies in Hazardous Waste Management III，1993，Tedder和Pohland編，第411_ 428頁(yè)）。示例性氣相生物反應(yīng)器包括單程系統(tǒng)、閉環(huán)栗送系統(tǒng)和流化床反應(yīng)器。通過(guò)利用氣 相生物反應(yīng)器，甲烷或其他氣態(tài)基質(zhì)可很容易地用于通過(guò)具有例如單加氧酶活性的多肽進(jìn) 行的轉(zhuǎn)化。在某些實(shí)施方案中，用于將氣體轉(zhuǎn)化成碳水化合物的方法在氣相生物反應(yīng)器中 進(jìn)行。在其他實(shí)施方案中，用于將氣體轉(zhuǎn)化成碳水化合物的方法在流化床反應(yīng)器中進(jìn)行。在 流化床反應(yīng)器中，流體（即，氣體或液體）向上穿過(guò)顆粒床載劑(通常為沙子、粒狀活性炭或 硅藻土），微生物可在其上附著并生長(zhǎng)。流體速度使顆粒床載劑和所附著的微生物懸浮(即， 床流化）。附著至顆粒床載劑的微生物在流體中自由地循環(huán)，允許流體中基質(zhì)至微生物和增 加的微生物生長(zhǎng)的有效傳質(zhì)。實(shí)例性流化床反應(yīng)器包括栓塞流反應(yīng)器和完全混合反應(yīng)器。 流化床反應(yīng)器與微生物生物膜的使用是本領(lǐng)域已知的（例如，Pfluger等，Bioresource Technol.102:9919,2011;Fennell等，Biotechnol，Bioengin.40:1218,1992;Ruggeri等， Water Sci.Technol. 29:347,1994;美國(guó)專利號(hào)4,032,407 ;4,009,098;4,009,105;以及3， 846,289)。
[0078] 本公開(kāi)描述的重組&代謝微生物可作為分離純培養(yǎng)物而生長(zhǎng)，其中可幫助生長(zhǎng)或 幫助&代謝微生物中的一種或多種不同菌株或種的異源非&代謝微生物可組合以產(chǎn)生混合 培養(yǎng)物。
[0079] 在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的碳水化合物在特定細(xì)胞生長(zhǎng)期（例如，遲緩期、對(duì)數(shù) 期、靜止期或死亡期)期間產(chǎn)生。期望來(lái)自原料的碳轉(zhuǎn)化成碳水化合物而不是轉(zhuǎn)化成&代謝 微生物的生長(zhǎng)和維持。在一些實(shí)施方案中，將如本文所提供的非天然存在的Q代謝微生物 (例如，甲烷氧化菌、甲基營(yíng)養(yǎng)菌)培養(yǎng)成低至中等細(xì)胞密度(OD600)，然后啟動(dòng)碳水化合物生 產(chǎn)。在一些實(shí)施方案中，碳水化合物在甲烷氧化菌不再分裂或分裂很慢時(shí)產(chǎn)生。在一些實(shí)施 方案中，碳水化合物只在靜止期期間產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，碳水化合物在對(duì)數(shù)期和靜止 期期間產(chǎn)生。
[0080] 包含由本文提供的重組心代謝微生物（例如，甲烷氧化菌、甲基營(yíng)養(yǎng)菌）產(chǎn)生的碳 水化合物的發(fā)酵罐組合物還可包含與生物發(fā)酵過(guò)程相關(guān)的其他有機(jī)化合物。例如，發(fā)酵的 生物副產(chǎn)物可包括一種或多種醇、環(huán)氧化物、醛、酮、酯或其組合。在某些實(shí)施方案中，發(fā)酵 罐組成可含有一種或多種以下醇：甲醇、乙醇、丁醇或丙醇。其他化合物，諸如H 20、C0、C02、C0 n2、h2、〇2和未利用的碳原料(諸如甲烷、乙烷、丙烷和丁烷)也可存在于發(fā)酵罐廢氣中。
[0081] 在某些實(shí)施方案中，本文提供的重組Q代謝微生物（例如，甲烷氧化菌、甲基營(yíng)養(yǎng) 菌)產(chǎn)生約〇.〇〇lg/L培養(yǎng)物至約500g/L培養(yǎng)物的本發(fā)明的碳水化合物。在一些實(shí)施方案中， 所產(chǎn)生的碳水化合物的量為約lg/L培養(yǎng)物至約100g/L培養(yǎng)物。在一些實(shí)施方案中，所產(chǎn)生 的碳水化合物的量為約0 · 001g/L、0 · 01g/L、0 · 025g/L、0 · 05g/L、0 · lg/L、0 · 15g/L、0 · 2g/L、 0·25g/L、0·3g/L、0·4g/L、0·5g/L、0·6g/L、0·7g/L、0·8g/L、0·9g/L、lg/L、2·5g/L、5g/L、 7 · 5g/L、10g/L、12·5g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、60g/L、 70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、125g/L、150g/L、175g/L、200g/L、225g/L、250g/L、275g/L、 300g/L、325g/L、350g/L、375g/L、400g/L、425g/L、450g/L、475g/LS500g/L。
[0082] 產(chǎn)物
[0083] 除本文描述的重組&代謝細(xì)胞之外本公開(kāi)還提供其他有用的產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方 案中，本公開(kāi)提供一種包含如本文所述的重組Ci代謝微生物的生物質(zhì)。在具體實(shí)施方案中， 本公開(kāi)提供一種包含重組&代謝微生物的生物質(zhì)，其中重組&代謝微生物包含編碼碳水化 合物生物合成酶的外源性核酸，并且其中重組&代謝微生物能夠?qū)⑻烊粴鈦?lái)源的原料轉(zhuǎn)化 成所需碳水化合物。在具體實(shí)施方案中，外源性核酸編碼β-葡聚糖生物合成酶，例如β-( 1， 3)_葡聚糖合酶。在一些實(shí)施方案中，生物質(zhì)包含重組(^代謝微生物和所需碳水化合物，其 中所需碳水化合物為β-葡聚糖，并且重組&代謝微生物包含編碼β-葡聚糖生物合成酶的外 源性核酸，并且其中重組(^代謝微生物能夠?qū)⑻烊粴鈦?lái)源的原料轉(zhuǎn)化成β-葡聚糖。示例性 葡聚糖包括 β-(1，3)_ 葡聚糖、β-(l，3)(l，6)-葡聚糖、β-(l，3)(1.4)-葡聚糖和β-(l，4)-葡聚糖。在某些實(shí)施方案中，所需碳水化合物選自β-(l，3)-葡聚糖、β-(l，3)(l，6)-葡聚糖 或β-( 1，3) (1.4)-葡聚糖。在其他實(shí)施方案中，所需碳水化合物為β-( 1，3)-葡聚糖。
[0084] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供一種包含重組Q代謝微生物的生物質(zhì)，其中重 組心代謝微生物包含編碼碳水化合物生物合成酶的外源性核酸，并且其中重組&代謝微生 物能夠?qū)⒓淄檗D(zhuǎn)化成所需碳水化合物。在具體實(shí)施方案中，外源性核酸編碼β-葡聚糖生物 合成酶，例如β-(1，3)_葡聚糖合酶，并且重組&代謝微生物能夠?qū)⒓淄檗D(zhuǎn)化成β-葡聚糖。通 常β-葡聚糖選自由以下組成的組:β-葡聚糖，例如像β-(1，3)-葡聚糖、β-(1，3) (1，6)-葡聚 糖、β-α，3) a，4)-葡聚糖和β-α，4)-葡聚糖。在某些實(shí)施方案中，所需碳水化合物選自由 以下組成的組:β-(1，3)_葡聚糖、0-(1，3)(1，6)-葡聚糖、0-(1，3)(1，4)-葡聚糖。在其他實(shí) 施方案中，所需碳水化合物為β_( 1，3)-葡聚糖。
[0085] 如本文所用，"生物質(zhì)"是指具有生物學(xué)來(lái)源的有機(jī)物，其可包括一種或多種全細(xì) 胞、裂解細(xì)胞、細(xì)胞外物質(zhì)等。例如，從培養(yǎng)的微生物(例如，細(xì)菌或酵母培養(yǎng)物)收獲的物質(zhì) 被認(rèn)為是生物質(zhì)，其可包括細(xì)胞、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)含體、分泌或排泄至培養(yǎng)基中的產(chǎn)物或 其任何組合。在某些實(shí)施方案中，生物質(zhì)包含本公開(kāi)的&代謝微生物和培養(yǎng)的培養(yǎng)基，本公 開(kāi)的Q代謝微生物在所述培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。在其他實(shí)施方案中，生物質(zhì)包含從生長(zhǎng)于心基質(zhì) (例如，天然氣、甲烷等)上的培養(yǎng)物中回收的本公開(kāi)的&代謝微生物(完整的或裂解的或兩 者）。在其他實(shí)施方案中，生物質(zhì)包含來(lái)自培養(yǎng)于 Cl基質(zhì)上的(^代謝微生物培養(yǎng)物的廢培養(yǎng) 基上清液。這種培養(yǎng)物可被認(rèn)為是可再生資源。本發(fā)明的生物質(zhì)關(guān)于所需碳水化合物的水 平富集的。
[0086] 提供有用于細(xì)胞生長(zhǎng)的天然氣來(lái)源的基質(zhì)的本公開(kāi)的重組心代謝微生物在如他 們的S13C值所代表的他們的碳指紋(就像來(lái)源于此類重組&代謝微生物的產(chǎn)物)方面各有不 同。作為【背景技術(shù)】，穩(wěn)定同位素測(cè)量值和質(zhì)量平衡方法廣泛用來(lái)評(píng)估甲烷的全球源和宿(參 見(jiàn)，Whiticar和Faber，0rg.Geochem·10:759，1986;Whiticar，Org.Geochem·16:531，1990)〇 為了使用殘余甲烷的S 13c值來(lái)確定氧化量，必須了解由甲烷的微生物氧化所引起的同位素 分餾的程度。例如，好氧甲烷氧化菌可通過(guò)特異性酶（甲烷單加氧酶(匪〇))來(lái)代謝甲烷。甲 烷氧化菌將甲烷轉(zhuǎn)化成甲醇并隨后轉(zhuǎn)化成甲醛。甲醛可進(jìn)一步氧化成c〇 2來(lái)以還原當(dāng)量 (NADH)的形式向細(xì)胞提供能量，或者通過(guò)RuMP或絲氨酸循環(huán)并入至生物質(zhì)中（Hanson和 Hanson，Microbiol .Rev. 60:439，1996)，所述RuMP或絲氨酸循環(huán)直接類似于光合生物中的 碳同化途徑。更具體地說(shuō)，I型甲烷氧化菌使用用于生物合成的RuMP途徑并且產(chǎn)生完全來(lái)自 CH4的生物質(zhì)，而II型甲烷氧化菌使用使來(lái)自CH4的50 % -70 %的細(xì)胞碳和來(lái)自⑶2的30 % -50%的細(xì)胞碳同化的絲氨酸途徑（Hanson和Hanson ,1996)。在例如Templeton等 (Geochim. Cosmochim. Acta 70:1739,2006)中提供了用于測(cè)量碳同位素組成的方法，所述 方法以引用方式整體并入本文。實(shí)施例2描述不同(^代謝微生物的細(xì)胞的穩(wěn)定碳同位素分 布的表征。細(xì)胞的高度負(fù)δ 13(：值類似地反映在從這些細(xì)胞中提取的化合物（即，脂質(zhì)部分)的 δ13(：方面。本文描述的本發(fā)明產(chǎn)物（即，如本文所述的本公開(kāi)的重組&代謝微生物、來(lái)源于此 的相關(guān)生物質(zhì)和碳水化合物組合物)的S 13C可根據(jù)如實(shí)施例2所展示使用的&基質(zhì)的來(lái)源和 純度而變化。
[0087] 在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的重組&代謝微生物以及來(lái)源于此的相關(guān)生物質(zhì)和碳 水化合物組合物展現(xiàn)出的S13C小于-30%。、小于-31%〇、小于_32%〇、小于_33%〇、小于-34%。、小 于 _35%。、小于_36%。、小于_37%。、小于_38%。、小于 _39%。、小于_40%。、小于_41%。、小于_ 42%〇、小于 _43%。、小于 _44%。、小于 _45%。、小于 _46%。、小于 _47%。、小于 _48%。、小于 _49%。、小 于-50%。、小于-51 %。、小于-52%。、小于-53%。、小于-54%。、小于-55%。、小于-56%。、小于- 57%。、小于-58%〇、小于-59%〇、小于-60%〇、小于-61%〇、小于-62%〇、小于-63%〇、小于-64%。、小 于-65%。、小于-66%。、小于-67%。、小于-68%。、小于-69%。或小于_70%〇。
[0088]在某些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的重組&代謝微生物以及來(lái)源于此的相關(guān)生物質(zhì)和碳 水化合物組合物展現(xiàn)出的S13C為約-35%。至約-50%。、-45%〇至約-35%。，或約-50%。至約-40%〇，或約-45%。至約-65%。，或約-60%。至約-70%。或約-30%。至約 _70%〇。
[0089]在其他實(shí)施方案中，Q代謝非光合微生物生物質(zhì)的δ13(：小于約-30%?；蚍秶鸀榧s-40%。至約-60%。。在某些實(shí)施方案中，生物質(zhì)包含重組(^代謝非光合微生物和廢培養(yǎng)基，或 者生物質(zhì)包含來(lái)自重組&代謝非光合微生物的培養(yǎng)物的廢培養(yǎng)基上清液組合物，其中所述 生物質(zhì)的S13C小于約-30%。。在某些其他實(shí)施方案中，碳水化合物組合物從生物質(zhì)中提取或 濃縮，所述生物質(zhì)可包含重組Ci代謝非光合微生物和來(lái)自培養(yǎng)物的廢培養(yǎng)基或來(lái)自重組Q 代謝非光合微生物的培養(yǎng)物的廢培養(yǎng)基上清液組合物。
[0090] 在某些實(shí)施方案中，來(lái)源于心代謝微生物的碳水化合物組合物(其可任選地為來(lái) 自C!代謝微生物生物質(zhì)的提取物或分離物)包含組合物重量的至少約50 %至約80 %的氫、 氧和碳原子，并且其中組合物的S13C小于約-35%。，或小于約-36%。，或小于約-37%。，或小于 約-38%。，或小于約-39%?；蛐∮诩s-40%。。在某些實(shí)施方案中，來(lái)源于此的碳水化合物組合 物包含具有氫、氧和碳原子的分子，其中氫、氧和碳原子為組合物重量的至少50%、至少 55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%，或至少80%，或至少90%，或至少95%，并 且當(dāng)在存在或不存在銅的情況下培養(yǎng)時(shí)，其中組合物的δ 13(：的范圍為約-30%。至約-70%。，或 者其中生物質(zhì)的S13C隨細(xì)胞密度增加而減少約-5%。至約-20%。，或者其中生物質(zhì)的δ 13(：比同 時(shí)產(chǎn)生的C02的δ13(：高5%。至15%。的平均數(shù)。
[0091] 通常，碳水化合物組合物包含多糖，并且在某些情況下，其包含單糖。在其他實(shí)施 方案中，碳水化合物組合物包含二糖。在一些實(shí)施方案中，碳水化合物包含β-葡聚糖。通常， β-葡聚糖為β-α，3)-葡聚糖。在其他實(shí)施方案中，β-葡聚糖為β-α，3) a，6)-葡聚糖，或0-(1，3)(1，4)-葡聚糖或0-(1，6)-葡聚糖。來(lái)源于在天然氣來(lái)源的基質(zhì)存在下培養(yǎng)的重組(：1 代謝微生物的碳水化合物組合物展現(xiàn)出上文描述的S13C值。
[0092] 下文的實(shí)施例闡明了在天然氣來(lái)源的原料存在下培養(yǎng)的一些&代謝微生物的δ1% 的表征。
[0093] 本公開(kāi)還提供包含本公開(kāi)的重組Q代謝微生物、相關(guān)生物質(zhì)和/或碳水化合物組 合物的動(dòng)物飼料。如在本發(fā)明的實(shí)踐中所設(shè)想的，動(dòng)物飼料可以是牲畜飼料(例如像，豬飼 料、牛飼料、綿羊飼料等）、家禽飼料(例如像，雞飼料、火雞飼料等)或魚(yú)飼料(例如像，鮭魚(yú) 飼料、貝類飼料等）。動(dòng)物飼料還可包含添加劑，例如像植物來(lái)源的材料(包括例如來(lái)源于谷 物的那些材料，例如像玉米、大麥、燕麥、大米、黑麥、小麥、高粱、啤酒糟等；以及來(lái)源于豆類 的那些材料，例如像苜蓿、三葉草、豌豆、黃豆、扁豆、大豆等）、動(dòng)物來(lái)源的材料(例如像，魚(yú) 粉)和/或微生物來(lái)源的材料(包括例如來(lái)自可為例如細(xì)菌、酵母或藻類的異源微生物的生 物質(zhì)）。在一些實(shí)施方案中，植物來(lái)源的材料添加劑是大豆粉或豌豆蛋白。
[0094] 在又一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供一種包含本公開(kāi)的重組心代謝微生物、相關(guān)生 物質(zhì)和/或碳水化合物組合物的培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基。通常，培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基還包含氨 基酸和/或水。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供一種包含如本文所述的培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng) 基以及第二微生物的細(xì)胞培養(yǎng)物組合物。通常，第二微生物為細(xì)菌、酵母或藻類。
[0095] 本發(fā)明的實(shí)施方案包括如下：
[0096] 1. -種生物質(zhì)，其來(lái)源于重組心代謝微生物的培養(yǎng)物，其中所述重組微生物包含 編碼碳水化合物生物合成酶的外源性核酸，其中所述重組&代謝能夠?qū)⑻烊粴鈦?lái)源的碳原 料轉(zhuǎn)化成所需碳水化合物。
[0097] 2. -種生物質(zhì)，其來(lái)源于重組&代謝微生物的培養(yǎng)物，其中所述重組&代謝微生物 包含編碼碳水化合物生物合成酶的外源性核酸，其中所述重組&代謝微生物能夠?qū)⒓淄檗D(zhuǎn) 化成所需碳水化合物。
[0098] 3.如實(shí)施方案1-2中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述重組&代謝微生物是非光合& 代謝微生物。
[0099] 4.如實(shí)施方案1-3中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述碳水化合物選自由多糖、二糖 和單糖組成的組。
[0100] 5.如實(shí)施方案4所述的生物質(zhì)，其中所述碳水化合物為單糖。
[0101 ] 6.如實(shí)施方案4所述的生物質(zhì)，其中所述碳水化合物為二糖。
[0102] 7.如實(shí)施方案4所述的生物質(zhì)，其中所述碳水化合物為多糖。
[0103] 8.如實(shí)施方案7所述的生物質(zhì)，其中所述多糖為β-葡聚糖。
[0104] 9.如實(shí)施方案8所述的生物質(zhì)，其中所述β-葡聚糖為β_(1，3)_葡聚糖。
[0105] 10.如實(shí)施方案8所述的生物質(zhì)，其中所述β-葡聚糖為0-(1，3)(1，6)_葡聚糖。
[0106] 11.如實(shí)施方案8所述的生物質(zhì)，其中所述β-葡聚糖為0-(1，3)(1，4)_葡聚糖。
[0107] 12.如實(shí)施方案8所述的生物質(zhì)，其中所述β-葡聚糖為β_(1，4)_葡聚糖。
[0108] 13.如實(shí)施方案8所述的生物質(zhì)，其中所述β-葡聚糖為β_(1，6)_葡聚糖。
[0109] 14.如實(shí)施方案1-13中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述外源性核酸的序列經(jīng)過(guò)密 碼子優(yōu)化以在所述重組&代謝微生物中最佳表達(dá)。
[0110] 15.如實(shí)施方案1-14中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述外源性核酸編碼糖異生酶。
[0111] 16.如實(shí)施方案15所述的生物質(zhì)，其中所述糖異生酶選自由以下組成的組:丙酮酸 羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3_磷酸脫氫酶、Α型醛縮酶、果糖1，6_二磷酸酶、磷酸果糖激酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶、己糖激酶 和葡糖-6-磷酸。
[0112] 17.如實(shí)施方案1-14中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述外源性核酸編碼糖原生成 酶。
[0113] 18.如實(shí)施方案17所述的生物質(zhì)，其中所述糖原生成酶選自由以下組成的組：葡 糖-1-磷酸腺苷?；D(zhuǎn)移酶、糖原合成酶和1，4-α_葡聚糖分支蛋白。
[0114] 19.如實(shí)施方案8-14中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述外源性核酸是β-葡聚糖合 酶。
[0115] 20.如實(shí)施方案1-19中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述外源性核酸編碼對(duì)于細(xì)菌 是內(nèi)源性的碳水化合物生物合成酶。
[0116] 21.如實(shí)施方案1-19中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述外源性核酸編碼對(duì)于選自 由酵母、真菌和植物組成的組的生物體是內(nèi)源性的碳水化合物生物合成酶。
[0117] 22.如實(shí)施方案1-19中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述外源性核酸編碼對(duì)于選自 由大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌組成的組的微生物是內(nèi)源性的碳水化合物生物合成酶。
[0118] 23.如實(shí)施方案1-14中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述外源性核酸編碼選自由以 下任何SEQ ID N0組成的組的碳水化合物生物合成酶：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、 24、26、28、30、32、34、36和38。
[0119] 24.如實(shí)施方案1-23中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述編碼碳水化合物生物合成 途徑的酶的外源性核酸可操作地連接至表達(dá)控制序列。
[0120] 25.如實(shí)施方案24所述的生物質(zhì)，其中所述表達(dá)控制序列是外源性表達(dá)控制序列。
[0121] 26.如實(shí)施方案1-25中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述(^代謝微生物還包含內(nèi)源 酶活性的缺失。
[0122] 27.根據(jù)實(shí)施方案1-26中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述Q代謝微生物是甲烷氧 化菌。
[0123] 28.根據(jù)實(shí)施方案27所述的生物質(zhì)，其中所述甲烷氧化菌為甲基單胞菌屬、甲基細(xì) 菌屬、甲基球菌屬、甲基彎曲菌屬、甲基孢囊菌屬、甲基微菌屬、甲烷單胞菌屬、甲基胞菌屬 或甲基莢膜菌屬。
[0124] 29.如實(shí)施方案27所述的生物質(zhì)，其中所述甲烷氧化菌選自由以下組成的組:莢膜 甲基球菌Bath菌株、甲烷甲基單胞菌16a(ATCC PTA2402)、發(fā)孢甲基彎曲菌0B3b(NRRL B-11，196)、生孢甲基彎曲菌(冊(cè)此8-11，197)、小甲基孢囊菌(置此8-11，198)、甲烷甲基單 胞菌（NRRL B-ll，199)、白色甲基單胞菌（NRRL B-ll，200)、莢膜甲基細(xì)菌（NRRL B-11， 201)、嗜有機(jī)甲基桿菌(ATCC 27,886)、甲基單胞菌屬AJ-3670(FERM P-2400)、森林甲基胞 菌、沼澤甲基胞菌(ATCC 700799)、凍原甲基胞菌、道氏甲基孢囊菌菌株SB2、苔蘚甲基孢囊 菌、金色甲基莢膜菌KYG、極端嗜酸甲烷氧化菌、嗜油甲基菌和嗜喊甲基微菌。
[0125] 30.根據(jù)實(shí)施方案1和3-29中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述天然氣來(lái)源的碳原料 選自由以下組成的組：天然氣、合成氣、甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、一氧化碳、二氧化碳、氰化 物、甲胺、甲硫基、甲基鹵素及其任何組合或兩種或更多種。
[0126] 31.如實(shí)施方案30所述的生物質(zhì)，其中所述天然氣來(lái)源的碳原料是天然氣。
[0127] 32.如實(shí)施方案1和3-30中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述天然氣來(lái)源的碳原料是 甲烷。
[0128] 33.如實(shí)施方案30所述的生物質(zhì)，其中所述天然氣來(lái)源的碳原料是合成氣。
[0129] 34.如實(shí)施方案30所述的生物質(zhì)，其中所述&代謝微生物是合成氣代謝細(xì)菌。
[0130] 35.根據(jù)實(shí)施方案34所述的生物質(zhì)，其中所述合成氣代謝細(xì)菌選自由以下組成的 組：自產(chǎn)乙醇梭菌、楊氏梭菌、拉氏梭菌、嗜羧基梭菌、食甲基丁酸桿菌、伍氏梭菌和新產(chǎn)丙 醇梭菌。
[0131] 36.根據(jù)實(shí)施方案1和3-35中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述生物質(zhì)的613(：小于-40%〇。
[0132] 37.如實(shí)施方案2所述的生物質(zhì)，其中所述甲烷為生物甲烷。
[0133] 38. -種組合物，其包含碳水化合物組合物，其中所述碳水化合物組合物展現(xiàn)出小 于-40%。的 δ13(：。
[0134] 39.如實(shí)施方案38所述的組合物，其中所述碳水化合物包括β-葡聚糖。
[0135] 40.如實(shí)施方案39所述的組合物，其中所述β-葡聚糖為β_( 1，3)_葡聚糖。
[0136] 41.-種動(dòng)物飼料，其包含如實(shí)施方案1-37中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)或如實(shí)施方案 38-40中任一項(xiàng)所述的組合物。
[0137] 42.如實(shí)施方案41所述的動(dòng)物飼料，其還包含植物來(lái)源的材料。
[0138] 43.如實(shí)施方案41所述的動(dòng)物飼料，其中所述植物來(lái)源的材料選自由大豆粉和豌 豆蛋白組成的組。
[0139] 44.-種培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基，其包含如實(shí)施方案1-37中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)或 如實(shí)施方案38-40中任一項(xiàng)所述的組合物。
[0140] 45.-種重組心代謝微生物，其中所述重組微生物包含編碼碳水化合物生物合成 酶的外源性核酸，其中所述重組&代謝微生物能夠?qū)⑻烊粴鈦?lái)源的碳原料轉(zhuǎn)化成所需碳水 化合物。
[0141] 46.-種重組&代謝微生物，其中所述重組&代謝微生物包含編碼碳水化合物生物 合成酶的外源性核酸，其中所述重組&代謝微生物能夠?qū)⒓淄檗D(zhuǎn)化成所需碳水化合物。
[0142] 47.如實(shí)施方案45-46中任一項(xiàng)所述重組Q代謝微生物，其中所述重組(^代謝微生 物是非光合&代謝微生物。
[0143] 48.如實(shí)施方案45-47中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述碳水化合物選 自由多糖、二糖和單糖組成的組。
[0144] 49.如實(shí)施方案48所述的重組&代謝微生物，其中所述碳水化合物為單糖。
[0145] 50.如實(shí)施方案48所述的重組&代謝微生物，其中所述碳水化合物為二糖。
[0146] 51.如實(shí)施方案48所述的重組&代謝微生物，其中所述碳水化合物為多糖。
[0147] 52.如實(shí)施方案51所述的重組&代謝微生物，其中所述多糖為β-葡聚糖。
[0148] 53.如實(shí)施方案52所述的重組Q代謝微生物，其中所述β-葡聚糖為β_(1，3)_葡聚 糖。
[0149] 54.如實(shí)施方案52所述的重組Q代謝微生物，其中所述β-葡聚糖為β-(1，3)(1，6)_ 葡聚糖。
[0150] 55.如實(shí)施方案52所述的重組Q代謝微生物，其中所述β-葡聚糖為β-(1，3)(1，4)_ 葡聚糖。
[0151] 56.如實(shí)施方案52所述的重組Q代謝微生物，其中所述β-葡聚糖為β_(1，4)_葡聚 糖。
[0152] 57.如實(shí)施方案52所述的重組Q代謝微生物，其中所述β-葡聚糖為β_(1，6)_葡聚 糖。
[0153] 58.如實(shí)施方案45-57中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述外源性核酸的 序列經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化以在重組&代謝微生物中最佳表達(dá)。
[0154] 59.如實(shí)施方案45-58中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述外源性核酸編 碼糖異生酶。
[0155] 60.如實(shí)施方案59所述的重組Q代謝微生物，其中所述糖異生酶選自由以下組成 的組:丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸變位酶、磷酸甘油酸激 酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、Α型醛縮酶、果糖1，6_二磷酸酶、磷酸果糖激酶、磷酸葡糖異構(gòu) 酶、己糖激酶和葡糖-6-磷酸。
[0156] 61.如實(shí)施方案45-58中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述外源性核酸編 碼糖原生成酶。
[0157] 62.如實(shí)施方案61所述的重組Q代謝微生物，其中所述糖原生成酶選自由以下組 成的組:葡糖-1-磷酸腺苷?；D(zhuǎn)移酶、糖原合成酶和1，4-α_葡聚糖分支蛋白。
[0158] 63.如實(shí)施方案52-57中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述外源性核酸是 葡聚糖合酶。
[0159] 64.如實(shí)施方案45-63中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述外源性核酸編 碼對(duì)于細(xì)菌是內(nèi)源性的碳水化合物生物合成酶。
[0160] 65.如實(shí)施方案45-63中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述外源性核酸編 碼對(duì)于選自由酵母、真菌和植物組成的組的生物體是內(nèi)源性的碳水化合物生物合成酶。 [0161 ] 66.如實(shí)施方案45-63中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述外源性核酸編 碼對(duì)于選自由大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌組成的組的微生物是內(nèi)源性的碳水化合物生物合 成酶。
[0162] 67.如實(shí)施方案45-57中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述外源性核酸編 碼選自由以下任何SEQ ID Ν0組成的組的碳水化合物生物合成酶:2、4、6、8、10、12、14、16、 18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38。
[0163] 68.如實(shí)施方案45-67中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述編碼碳水化合 物生物合成途徑的酶的外源性核酸可操作地連接至表達(dá)控制序列。
[0164] 69.如實(shí)施方案68所述的重組Q代謝微生物，其中所述表達(dá)控制序列是外源性表 達(dá)控制序列。
[0165] 70.如實(shí)施方案45-69中任一項(xiàng)所述的重組C!代謝微生物，其中所述C!代謝微生物 還包含內(nèi)源酶活性的缺失。
[0166] 71.根據(jù)實(shí)施方案45-70中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述(^代謝微生 物是甲烷氧化菌。
[0167] 72.根據(jù)實(shí)施方案71所述的重組Q代謝微生物，其中所述甲烷氧化菌為甲基單胞 菌屬、甲基細(xì)菌屬、甲基球菌屬、甲基彎曲菌屬、甲基孢囊菌屬、甲基微菌屬、甲烷單胞菌屬、 甲基胞菌屬或甲基莢膜菌屬。
[0168] 73.如實(shí)施方案71所述的重組Q代謝微生物，其中所述甲烷氧化菌選自由以下組 成的組：莢膜甲基球菌Bath菌株、甲烷甲基單胞菌16a(ATCC PTA 2402)、發(fā)孢甲基彎曲菌 0B3b(NRRL B-ll，196)、生孢甲基彎曲菌（NRRL B-ll，197)、小甲基孢囊菌（NRRL B-11, 198)、甲烷甲基單胞菌(NRRL B-ll，199)、白色甲基單胞菌(NRRL B-ll，200)、莢膜甲基細(xì)菌 (NRRL B-11,201)、嗜有機(jī)甲基桿菌(ATCC 27,886)、甲基單胞菌屬AJ-3670(FERM P-2400)、 森林甲基胞菌、沼澤甲基胞菌(ATCC 700799)、凍原甲基胞菌、道氏甲基孢囊菌菌株SB2、苔 蘚甲基孢囊菌、金色甲基莢膜菌KYG、極端嗜酸甲烷氧化菌、嗜油甲基菌和嗜喊甲基微菌。
[0169] 74.根據(jù)實(shí)施方案45和47-73中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述天然氣 來(lái)源的碳原料選自由以下組成的組:天然氣、合成氣、甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、一氧化碳、二 氧化碳、氰化物、甲胺、甲硫基、甲基鹵素及其任何組合或兩種或更多種。
[0170] 75.如實(shí)施方案74所述的重組Q代謝微生物，其中所述天然氣來(lái)源的碳原料是天 然氣。
[0171] 76.如實(shí)施方案74所述的重組Q代謝微生物，其中所述天然氣來(lái)源的碳原料是甲 烷。
[0172] 77.如實(shí)施方案74所述的重組Q代謝微生物，其中所述天然氣來(lái)源的碳原料是合 成氣。
[0173] 78.如實(shí)施方案77所述的重組&代謝微生物，其中所述&代謝微生物是合成氣代謝 細(xì)囷。
[0174] 79.根據(jù)實(shí)施方案78所述的生物質(zhì)，其中所述合成氣代謝細(xì)菌選自由以下組成的 組：自產(chǎn)乙醇梭菌、楊氏梭菌、拉氏梭菌、嗜羧基梭菌、食甲基丁酸桿菌、伍氏梭菌和新產(chǎn)丙 醇梭菌。
[0175] 80.根據(jù)實(shí)施方案45和47-79中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述生物質(zhì) 的 δ13(：小于 _40%〇。
[0176] 81.如實(shí)施方案46所述的重組&代謝微生物，其中所述甲烷為生物甲烷。
[0177] 82.-種生產(chǎn)碳水化合物的方法，所述方法包括在天然氣來(lái)源的碳原料存在下在 足以產(chǎn)生所述碳水化合物的條件下培養(yǎng)如實(shí)施方案45和47-68中任一項(xiàng)所述的重組&代謝 微生物。
[0178] 83.-種生產(chǎn)碳水化合物的方法，所述方法包括在甲烷存在下在足以產(chǎn)生所述碳 水化合物的條件下培養(yǎng)如實(shí)施方案46所述的重組&代謝微生物。
[0179] 84.如實(shí)施方案83所述的方法，其中所述碳水化合物為β-葡聚糖。
[0180] 85. -種碳水化合物，其通過(guò)如實(shí)施方案82所述的方法來(lái)產(chǎn)生，其中所述碳水化合 物展現(xiàn)出在約-40%。至約-60%。的范圍內(nèi)的δ 13(：。
[0181] 結(jié)合以下非限制性實(shí)施例可更好理解本發(fā)明的前述及其他方面。 實(shí)施例
[0182] 實(shí)施例1
[0183] 用于&代謝微生物的培養(yǎng)條件和生物反應(yīng)器條件
[0184] 本公開(kāi)的示例性(^代謝微生物（甲烷氧化菌、甲基營(yíng)養(yǎng)菌、梭狀芽孢桿菌 (Clostridia))培養(yǎng)于試管中、小瓶中、瓶子中、平板上或生物反應(yīng)器(發(fā)酵）中。本實(shí)施例描 述了用于各種微生物的生長(zhǎng)條件、培養(yǎng)基和碳源。
[0185] 發(fā)孢甲基彎曲菌菌株0B3b(NCIMB 11131);甲基單胞菌屬菌株16a(ATCC PTA-2402);或甲烷甲基單胞菌
[0186] 對(duì)于血清瓶，將細(xì)菌在30°C下在希金斯最低硝酸鹽培養(yǎng)基（NSM; Cornish等， J.Gen.Microbiol·130:2565，1984;Park等，Biotechnol·Bioeng·38:423，1991)或MM-W1培 養(yǎng)基中培養(yǎng)。將頂部空間組成調(diào)節(jié)至1:1體積的甲烷:空氣。將瓶子以200-250rpm的速率震 蕩。另選地，將培養(yǎng)物在含有1.5 % w/v瓊脂的NSM培養(yǎng)基平板上維持，在含有1:1 (v/v)甲烷： 空氣氣體混合物的氣密室中或在甲醇蒸汽(通過(guò)在石蠟?zāi)っ芊獾钠桨宓纳w子中的〇.5mL甲 醇)存在下或在增補(bǔ)有〇. 5 %甲醇的NSM培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)。在30°C下，將平板在加濕室中倒 置孵育。
[0187] 使用的NSM培養(yǎng)基的組成如下：1.0g MgS〇4*7H20、0.20g CaCl2*6H20、2.0ml螯合鐵 溶液(〇. lg檸檬酸鐵(ΠΙ)銨或0.5g氯化鐵（III);0.2g EDTA、鈉鹽;0.3ml濃HC1; 100.0ml蒸 餾的去離子H20)、1.0g KN〇3、0.5ml微量元素溶液（500.0mg EDTA、200.0mg FeS〇4.7H20、 lO.Omg ZnS〇4*7H2〇、3.0mg MnCl2*4H2〇、30.0mg H3B〇3、20.0mg CoCl2*6H2〇、1.0mg CaCl2* 2H2〇、2.0mgNiCl2*6H2〇、3.0mg Na2Mo〇4*2H2〇、l .0L蒸餾水）、0.272g KH2P〇4、0.717g Na2HP〇4*12H20、任選地12.5g精制瓊脂（例如，Oxoid L28瓊脂或Bacto?瓊脂；制備平板時(shí)使 用）、1.0L蒸餾的去離子水，將pH調(diào)節(jié)至6.8并且在121°(：下高壓滅菌15分鐘。
[0188] 對(duì)于發(fā)酵，將含有1L無(wú)菌限定培養(yǎng)基MM-W1的2升生物反應(yīng)器用來(lái)自在供應(yīng)有1:1 (v/v)甲烷和空氣混合物的麗-W1中生長(zhǎng)的血清瓶分批培養(yǎng)物（10-20% v/v)的細(xì)胞接種。使 用的培養(yǎng)基 MM-W1 的組成如下：0.8mM MgS〇4*7H20、10mM NaN03、0.14mM CaCl2、1.2mM NaHC03、2.35mM KH2P〇4、3.4mM Κ2ΗΡ〇4、20.7μΜ Na2Mo〇4*2H2〇、lyM CuS〇4*5H20、10yM Fem-Na-EDTA和lmL/升的微量金屬溶液（含有每升500mg FeS〇4*7H20、400mg ZnS〇4*7H20、20mg MnCl2*7H20、50mg CoCl2*6H20、10mg NiCl2*6H2〇、15mg H3B03、250mg EDTA)。在將培養(yǎng)基高壓 滅菌并冷卻后，添加磷酸鹽、碳酸氫鹽和Fem-Na-EDTA。在某些發(fā)酵中，將碳酸氫鹽添加至 0.1%(￥八）。將反應(yīng)器內(nèi)容物用架空葉輪以恒定的750印111攪拌。將培養(yǎng)物用以約6〇111171^11 至約120mL/min噴射的恒定甲燒補(bǔ)料，同時(shí)以約lOmL/min-lOOmL/min的可變速率供應(yīng)濃縮 的氧氣(至少85%)以維持約40%至約80% (相對(duì)于培養(yǎng)基的空氣飽和度）的溶解氧水平。
[0189] 將生物反應(yīng)器的溫度維持在30°C，并且每4小時(shí)至約24小時(shí)利用向培養(yǎng)物中自動(dòng) 添加0.5M NaOH和0.5M HC1以及其他添加物來(lái)將pH維持在7.1 ± 0.1處（相當(dāng)于0D6QQ增加大 約50D單位）。其他添加物在金屬添加物（最終濃度10μΜ CuS04、5yM FeS04、5yM Fem-Na-EDTA)與營(yíng)養(yǎng)添加物(5.75mM KxHyP04、10mM NaN03)之間交替。在這些條件下，對(duì)于大于20 的0D6QQ，觀察到基本線性生長(zhǎng)，有效生物質(zhì)產(chǎn)生率為每升每天約2.7克至約3.3克干細(xì)胞重 量。將培養(yǎng)物生物質(zhì)通過(guò)離心收獲，在MM-W1培養(yǎng)基中洗滌一次，并且將回收的生物質(zhì)在-80 °C下冷凍或者立即用于細(xì)胞組分的分級(jí)分離(例如，脂質(zhì)提?。?br>[0190] 半連續(xù)發(fā)酵方法也可用來(lái)維持生物質(zhì)生產(chǎn)率并減少與發(fā)酵關(guān)閉和啟動(dòng)相關(guān)的時(shí) 間（即，周轉(zhuǎn)期或提前期）。
[0191] 隨著培養(yǎng)密度接近(但在進(jìn)入前)靜止期，以大約12-24小時(shí)的間隔進(jìn)行細(xì)菌生物 質(zhì)的收獲。將大約一半的生物反應(yīng)器體積通過(guò)用離心栗轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的容器來(lái)移除。然后將 等體積無(wú)菌或回收的培養(yǎng)基返還至生物反應(yīng)器中，以便反應(yīng)器的光密度為其初始值的大約 一半。根據(jù)以上方案繼續(xù)生物反應(yīng)器發(fā)酵，以便可在單次發(fā)酵運(yùn)行期間實(shí)施多個(gè)周期的生 長(zhǎng)和生物質(zhì)回收。
[0192] 莢膜甲基球菌 Bath (NCBffi 11132)
[0193] 將細(xì)菌在42°C下在含有希金斯最低硝酸鹽培養(yǎng)基(NSM)或MM-W1培養(yǎng)基的血清瓶 中培養(yǎng)。將頂部空間組成調(diào)節(jié)至1:1體積的甲烷:空氣。將瓶子以200_250rpm的速率震蕩。另 選地，將培養(yǎng)物在用1.5 %w/v瓊脂固化的NSM培養(yǎng)基平板上維持，在含有1:1 (v/v)甲烷:空 氣氣體混合物的氣密室中生長(zhǎng)。在42°C下，將平板在所述室中倒置孵育。
[0194] 對(duì)于發(fā)酵，將含有1.25L無(wú)菌培養(yǎng)基MMF1.1的3升生物反應(yīng)器用來(lái)自在供應(yīng)有1:1 (v/v)甲烷和空氣混合物的相同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的血清瓶分批培養(yǎng)物（10-20% V/v)的細(xì)胞接 種。培養(yǎng)基MMF1.1 的組成如下：0.8mM MgS〇4*7H20、40mM NaN03、0.14mM CaCl2、6mM NaHC03、 4.7mM KH2P〇4、6.8mM Κ2ΗΡ〇4、20·7μΜ Na2Mo〇4*2H20、6yM CuS〇4*5H20、10yM Fem-Na-EDTA和 lmL/升的微量金屬溶液（含有每升500mg FeS〇4*7H20、400mg ZnS〇4*7H20、20mg MnCl2*7H20、 50mg CoCl2*6H2〇、10mg NiCl2*6H2〇、15mg H3B03、250mg EDTA)。在將培養(yǎng)基高壓滅菌并冷卻 后，添加磷酸鹽、碳酸氫鹽和Fem-Na-EDTA。將反應(yīng)器內(nèi)容物用架空葉輪以恒定的750rpm攪 拌。將培養(yǎng)物用以約60mL/min至約200mL/min噴射的恒定甲燒補(bǔ)料，同時(shí)以15mL/min-90mL/ min的可變速率供應(yīng)濃縮的氧氣(>85%)，并且使溶解氧水平維持在10%以下（相對(duì)于培養(yǎng) 基的空氣飽和度）。
[0195] 將生物反應(yīng)器的溫度維持在44°C，并且每3-6小時(shí)利用向培養(yǎng)物中自動(dòng)添加0.5M NaOH和0.5M HC1以及銅和鐵的添加物（最終濃度5μΜ CuS04、5yM FeS〇4、10yM Fem-Na-EDTA)來(lái)將pH維持在7.0±0.1處(相當(dāng)于在達(dá)到0D 5之后，0D6Q()增加大約3-50D單位）。在這 些條件下，對(duì)于大于10的OD600,觀察到基本線性生長(zhǎng)，有效生物質(zhì)產(chǎn)生率為每升每天約多于 5克干細(xì)胞重量。將培養(yǎng)物生物質(zhì)通過(guò)離心收獲，將細(xì)胞在MM-W1培養(yǎng)基中洗滌一次，并且將 細(xì)胞團(tuán)塊在_80°C下冷凍或者立即用于細(xì)胞組分的分級(jí)分離。
[0196] 營(yíng)養(yǎng)耗竭被認(rèn)作為可限制發(fā)酵期間生長(zhǎng)收率的問(wèn)題。為避免營(yíng)養(yǎng)物的限制，在培 養(yǎng)物OD600超過(guò)5之后，啟動(dòng)由2倍濃縮MMF1.1構(gòu)成的主要氮和磷酸鹽營(yíng)養(yǎng)物補(bǔ)料。當(dāng)擴(kuò)大培 養(yǎng)物體積時(shí)，以對(duì)應(yīng)于大約一半的培養(yǎng)物生長(zhǎng)速率的稀釋率啟動(dòng)營(yíng)養(yǎng)物補(bǔ)料以避免沖洗并 且維持0D的增加。根據(jù)以上方案繼續(xù)生物反應(yīng)器發(fā)酵，以便可在單次發(fā)酵運(yùn)行期間實(shí)施多 個(gè)周期的生長(zhǎng)和生物質(zhì)回收。
[0197] 扭脫甲基桿菌或發(fā)孢甲基彎曲菌菌株0B3b(NCBffi 11131)
[0198] 將細(xì)菌在30°C下在含有用0.5%甲醇增補(bǔ)的希金斯最低硝酸鹽培養(yǎng)基(NSM)的試 管中培養(yǎng)。將試管以200_250rpm的速率震蕩。另選地，將培養(yǎng)物在含有1.5%w/v瓊脂的NSM 培養(yǎng)基平板上維持，在甲醇蒸汽(通過(guò)在石蠟?zāi)っ芊獾钠桨宓纳w子中的〇.5mL甲醇)存在下 生長(zhǎng)或用0.5%甲醇增補(bǔ)。在30°C下，將平板在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下在加濕室中倒置孵育。
[0199] 對(duì)于發(fā)酵，將含有1L限定培養(yǎng)基MM-W1的2升生物反應(yīng)器用來(lái)自培養(yǎng)試管分批培養(yǎng) 物的細(xì)胞（10-20%v/v)接種。培養(yǎng)基MM-W1的組成如以上所述。將反應(yīng)器內(nèi)容物用架空葉輪 以恒定的SOOrpm攪拌。將培養(yǎng)物用甲烷的初始灌注補(bǔ)料至0.5%的最終濃度并且用可變甲 烷補(bǔ)料來(lái)補(bǔ)料，同時(shí)以30mL/min-100mL/min的可變速率供應(yīng)純氧以維持60%-90% (相對(duì)于 培養(yǎng)基的空氣飽和度)的溶解氧水平。
[0200] 將生物反應(yīng)器的溫度維持在30°C，并且利用自動(dòng)添加0.5M NaOH和1M HC1以及如 以上所述的金屬添加物和營(yíng)養(yǎng)添加物來(lái)將pH維持在7.1 ±0.1處。在這些條件下，對(duì)于大于 20的0D6QQ，觀察到基本線性生長(zhǎng)，有效生物質(zhì)產(chǎn)生率每升每天2.7克至3.3克干細(xì)胞重量。將 培養(yǎng)物生物質(zhì)通過(guò)離心收獲，將細(xì)胞在MM-W1培養(yǎng)基中洗滌一次，并且將細(xì)胞團(tuán)塊在-80 °C 下冷凍或者立即用于細(xì)胞組分的分級(jí)分離。
[0201] 半連續(xù)發(fā)酵方法也可用來(lái)維持生物質(zhì)生產(chǎn)率并減少與發(fā)酵關(guān)閉和啟動(dòng)相關(guān)的時(shí) 間（即，周轉(zhuǎn)期或提前期）。
[0202] 隨著培養(yǎng)密度接近(但在進(jìn)入前)靜止期，以大約12-24小時(shí)的間隔進(jìn)行積累的細(xì) 菌生物質(zhì)的收獲。將大約一半的生物反應(yīng)器體積通過(guò)用離心栗轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的容器來(lái)移除。 然后將等體積新鮮或回收的培養(yǎng)基返還至生物反應(yīng)器中，以便反應(yīng)器的光密度為其初始值 的大約一半。根據(jù)以上方案繼續(xù)生物反應(yīng)器發(fā)酵，以便在單次發(fā)酵運(yùn)行期間實(shí)施多個(gè)周期 的生長(zhǎng)和生物質(zhì)回收。
[0203]自產(chǎn)乙醇梭菌和楊氏梭菌
[0204] 將梭菌屬細(xì)菌在lOOmL改良的PETC培養(yǎng)基(ATCC培養(yǎng)基1754)中在37°C下在具有丁 基橡膠塞和200kPa鋼廠廢氣的塑料涂覆的500ml SchottDuran⑩GL45瓶中厭氧培養(yǎng)。通過(guò) 測(cè)量600nm處的光密度(OD600)來(lái)監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)。
[0205]改良的PETC培養(yǎng)基含有(每升）lg NH4Cl、0.4g KCl、0.2g MgS〇4*7H20、0.8g NaCl、 O.lg KH2P〇4、20mg CaCl2*2H20、10ml微量元素溶液（參見(jiàn)如下）、10ml Wolfe氏維生素溶液 (參見(jiàn)如下）、28似!10)3和11^刃天青。在將?!1調(diào)節(jié)至5.6之后，將培養(yǎng)基煮沸、厭氧分配并在 121°C下高壓滅菌15分鐘。將鋼廠廢氣(組成:44%0)、32%他、22%0) 2、2%!12)或當(dāng)量合成混 合物用作碳源。培養(yǎng)基的最終pH為5.9，并且用0.008% (w/v)的濃度的鹽酸半胱氨酸和Na2S 來(lái)還原。
[0206]微量元素含有每升2g次氮基三乙酸(在添加剩余成分之前，用Κ0Η調(diào)節(jié)至pH 6)、lg MnS〇4、0.8g Fe(S〇4)2(NH4)2*6H20、0.2g CoCl2*6H20、0.2mg ZnS〇4*7H20、20mg CuC12*2H2〇、 20mg NiCl2*6H2〇、20mg Na2Mo〇4*2H2〇、20mg Na2Se〇4和20mg Na2W〇4。
[0207] Wolfe 氏維生素溶液(Wolin等，J. Biol. Chem· 238:2882,1963)含有（每升）2mg 生物 素、2mg葉酸、lOmg鹽酸吡咳醇、5mg鹽酸硫胺素、5mg核黃素、5mg煙酸、5mg D-( + )-泛酸鈣、 0. lmg維生素 B12、5mg對(duì)氨基苯甲酸和5mg硫辛酸。
[0208] a.自產(chǎn)乙醇梭菌發(fā)酵
[0209]使用類似于例如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?011/0300593中描述的那些的方法來(lái)進(jìn)行自產(chǎn) 乙醇梭菌的發(fā)酵。簡(jiǎn)言之，將含有1.3L溶液A(3.083g NH4Ac;0.61g MgCl2*6H20;0.294g CaCl2*2H 20;0.15g KCl;0.12g NaCl(任選的）；用蒸餾水補(bǔ)足至1L)的2升生物反應(yīng)器用N2氣 體來(lái)噴射。添加85 %H3P〇4溶液（2.025mL，30mM)，并且使用濃縮的NH40H水溶液將pH調(diào)節(jié)至 5 · 3。然后添加13 · 5mL溶液B(20 · Omg生物素；20 · Omg葉酸；10 · Omg鹽酸吡咳醇；50 · Omg鹽酸硫 胺素;50 · Omg核黃素;50 · Omg煙酸;50 · Omg D-(*)_泛酸|丐；50 · Omg維生素 B12; 50 · Omg對(duì)氨基 苯甲酸;50.Omg硫辛酸；用蒸餾水補(bǔ)足至1L)，并且將溶液用N2氣體來(lái)噴射。添加氯化鉻（II) 直到溶液的氧化-還原電位(0RP)減少至大約-200mV，其中添加刃天青（1.35mL的2g/L溶 液）。添加多硫化鈉（5.4mL的3M溶液，參見(jiàn)如下），并且將溶液用N 2來(lái)噴射，然后用含有C0的 氣體（1 %H2; 13 %N2; 71 %C0; 15 %⑶2)來(lái)噴射。添加金屬硫化物溶液（150mL，參見(jiàn)如下），并 且在用大約5%(v/v)水平的活躍生長(zhǎng)的自產(chǎn)乙醇梭菌培養(yǎng)物接種之前，將溶液噴射另外30 分鐘。
[0210] 在裝有恥23(93.78,0.39111〇1)和2001111 !120的5001111燒瓶中制備多硫化鈉溶液。將溶 液攪拌直到鹽溶解，并且在恒定N2流下添加硫(25g，0. lmol)。在室溫下攪拌2小時(shí)后，將多 硫化鈉溶液(相對(duì)于Na約4M，并且相對(duì)于硫約5M)(現(xiàn)在為透明紅棕色液體)轉(zhuǎn)移至N 2吹掃的 血清瓶中，并且包裹在鋁箱中。
[0211] 在配備有氣密入口和出口的1L三頸燒瓶中制備鉻（II)溶液以允許在惰性氣體下 工作并且隨后將所需產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至適合的存儲(chǔ)燒瓶中。將燒瓶用CrCl 3*6H20(40g，0.15mol)、 鋅粒[20 目](18 · 3g，0 · 28mol)、汞（13 · 55g，lmL，0 · 0676mo 1)和500mL蒸餾水填裝。接著用N2 沖洗一小時(shí)，將混合物溫?zé)嶂良s80 °C以啟動(dòng)反應(yīng)。在恒定他流下攪拌兩小時(shí)后，將混合物冷 卻至室溫，并且連續(xù)攪拌另一個(gè)48小時(shí)，到那時(shí)反應(yīng)混合物變成深藍(lán)色溶液。將溶液轉(zhuǎn)移至 N2吹掃的血清瓶中，并且在4 °C下儲(chǔ)存而用于將來(lái)使用。
[0212]通過(guò)將約950mL溶液A添加至1L發(fā)酵罐中并用N2氣體噴射來(lái)制備金屬硫化物溶液。 添加85 %H3P〇4溶液（1.5mL，30mM)，并且使用濃縮的NH40H水溶液將pH調(diào)節(jié)至5.3。添加溶液B (10mL)，并且將溶液用N2噴射。添加氯化鉻（II)直到溶液的氧化-還原電位(0RP)減少至大 約-200mV，其中添加刃天青（lmL的2g/L溶液）。添加溶液C( 1/10; 10ml FeCl3; 5ml CoCl2; 5ml NiCl2;lml H3B03;lml Na2Mo〇4;lml MnCl2;lml Na2W〇4;lml ZnCl2;lml Na2Se〇3;至 1L培養(yǎng)基 中），然后添加多硫化鈉(2mL的3M溶液），然后將溶液用N2氣體噴射。
[0213] 由自產(chǎn)乙醇梭菌在分批條件下在多硫化物存在下進(jìn)行的包含C0的基質(zhì)的發(fā)酵在 2-3天周期內(nèi)產(chǎn)生基本增加的積累率，和大約4g/L的最終生物質(zhì)積累。例如，大約1天的短暫 遲緩期后，生物質(zhì)可在發(fā)酵的大約36小時(shí)內(nèi)從約0.5g/L增加至至少3.5g/L。此外，在生長(zhǎng)期 期間在多硫化合物(通常存在于分批培養(yǎng)中）存在下不產(chǎn)生乙酸鹽，并且在某些情況下一些 乙酸鹽被消耗，以致在發(fā)酵罐中存在乙酸鹽的量的凈減少。將培養(yǎng)物生物質(zhì)通過(guò)離心收獲， 將細(xì)胞在培養(yǎng)基中洗滌一次，并且將細(xì)胞團(tuán)塊在-80°C下冷凍或者立即用于細(xì)胞組分的分 級(jí)分離。
[0214] 半連續(xù)發(fā)酵方法也可用來(lái)維持生物質(zhì)生產(chǎn)率并減少與發(fā)酵關(guān)閉和啟動(dòng)相關(guān)的時(shí) 間（即，周轉(zhuǎn)期或提前期）。
[0215] 隨著培養(yǎng)密度接近(但在進(jìn)入前)靜止期，以大約12-24小時(shí)的間隔進(jìn)行積累的細(xì) 菌生物質(zhì)的收獲。將大約一半的生物反應(yīng)器體積通過(guò)用離心栗轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的容器來(lái)移除。 然后將等體積新鮮或回收的培養(yǎng)基返還至生物反應(yīng)器中，以便反應(yīng)器的光密度為其初始值 的大約一半。根據(jù)以上方案繼續(xù)生物反應(yīng)器發(fā)酵，以便在單次發(fā)酵運(yùn)行期間實(shí)施多個(gè)周期 的生長(zhǎng)和生物質(zhì)回收。
[0216] b.楊氏梭菌發(fā)酵
[0217] 使用例如美國(guó)專利號(hào)5，173，429和5，593，886中描述的那些方法的類似方法來(lái)進(jìn) 行楊氏梭菌的發(fā)酵。簡(jiǎn)言之，使用楊氏梭菌的生物學(xué)純培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行分批發(fā)酵。在80%氮?dú)夂?20%C02的氣氛中厭氧地實(shí)施培養(yǎng)基的制備（（1 )80 . OmL鹽，其包含KH2P〇4 3. OOg/L、K2HP〇4 3.00g/L、（NH4)2S〇4 6.00g/L、NaCl 6.00g/L、MgS〇4*2H20 1.25g/L;(2)1.0g酵母提取物；（3) 1.(^胰酶解酪蛋白；（4)3.〇!111??~(?€61111丨即)微量金屬溶液，其包含？6(：12*4!1 20 150〇11^、 ZnS〇4*7H20 100mg、MnCl2*4H20 30mg、H3B03 300mg、CoCl2*6H20 200mg、CuCl2*H20 10mg、 NiCl2*6H20 20mg、NaMo〇4*2H20 30mg、Na2Se03 10mg，并用蒸餾水補(bǔ)足至lL;(5)10.0ml B族 維生素，其包含鹽酸吡咳醛l〇mg、核黃素 50mg、鹽酸硫胺素 硫辛酸60mg、對(duì)氨基苯甲酸50mg、葉酸20mg、生物素20mg、氰鈷胺50mg，并用蒸餾水補(bǔ)足至 11^(6)0.58鹽酸半胱氨酸；（7)0.068〇&(：1 2*2!120;(8)2.(^似!^03;(9)1.011^刃天青 (0.01%);以及（10)920.OmL蒸餾水）。在發(fā)酵期間控制培養(yǎng)基的pH并且用HC1維持在5.0處。 如果需要，用無(wú)菌10 %NaOH或1.0 %乙酸溶液進(jìn)行pH的調(diào)節(jié)。將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至157.5mL血清 瓶中并且用丁基橡膠塞和鋁封條密封。然后將瓶子在121°C下高壓滅菌20分鐘。
[0218] 開(kāi)始試驗(yàn)之前的大約48小時(shí)，在類似于如上所述的那些的瓶子中由楊氏梭菌的儲(chǔ) 用培養(yǎng)物制備種子培養(yǎng)物。使種子培養(yǎng)物在振蕩器培養(yǎng)箱中在37 °C下生長(zhǎng)，并且以lOOrprn 震蕩。向培養(yǎng)物中添加還原溶液(2.0ml Na2S，2.5 %溶液以及2.0ml鹽酸半胱氨酸，3.5 %溶 液），將所述培養(yǎng)物置于振蕩器培養(yǎng)箱中大約15分鐘以允許完全除氧和溫度順應(yīng)。不像用于 分離生物體的生物學(xué)純培養(yǎng)物的程序，在分批發(fā)酵中不需要添加甲烷抑制劑。
[0219] 在含有營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的New Brunswick Scientific Bioflow lie 2.5升發(fā)酵罐中 在37°C下進(jìn)行具有楊氏梭菌的發(fā)酵，并且維持1.5升的恒定液面，同時(shí)將液體用以大約每分 鐘500立方厘米的速率引入的氣體以高達(dá)每分鐘1,000轉(zhuǎn)數(shù)的可變速率攪拌。最佳氣體保留 時(shí)間在三分鐘的范圍內(nèi)。氣體補(bǔ)料隨著由細(xì)菌進(jìn)行的攝取而改變，這反過(guò)來(lái)是細(xì)胞密度的 函數(shù)。
[0220] 隨著培養(yǎng)密度接近(但在進(jìn)入前)靜止期，以大約12-24小時(shí)的間隔進(jìn)行積累的細(xì) 菌生物質(zhì)的收獲。將大約一半的生物反應(yīng)器體積通過(guò)用離心栗轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的容器來(lái)移除。 然后將等體積新鮮或回收的培養(yǎng)基返還至生物反應(yīng)器中，以便反應(yīng)器的光密度為其初始值 的大約一半。根據(jù)以上方案繼續(xù)生物反應(yīng)器發(fā)酵，以便在單次發(fā)酵運(yùn)行期間實(shí)施多個(gè)周期 的生長(zhǎng)和生物質(zhì)回收。
[0221] 實(shí)施例2
[0222] 來(lái)自&代謝微生物的脂質(zhì)的穩(wěn)定碳同位素分布
[0223] 通過(guò)元素分析儀/連續(xù)流同位素比質(zhì)譜儀使用與IsoPrimelOOIRMS( Isoprime， Cheadle，UK)相結(jié)合的CHN0S元素分析儀（vario IS0T0PE cube，Elementar，Hanau， Germany)來(lái)分析發(fā)孢甲基彎曲菌生物質(zhì)和脂質(zhì)部分干樣品的碳和氮含量(干重％)以及碳 (13C)和氮( 15N)穩(wěn)定同位素比。將在發(fā)酵罐或血清瓶中培養(yǎng)的甲烷氧化菌生物質(zhì)的樣品離 心，重懸于去離子水中，并且將相當(dāng)于0.2mg-2mg碳(約0.5mg-5mg干細(xì)胞重量）的體積轉(zhuǎn)移 至5x 9mm錫囊（Costech Analytical Technologies, Inc.，Valencia，CA)中并在8CTC下干 燥24小時(shí)。類似地，將先前提取的脂質(zhì)部分懸浮于氯仿中，并將含有0.1mg-1.5mg碳的體積 轉(zhuǎn)移至錫囊中并在80°C下蒸發(fā)至干燥24小時(shí)。含有O.lmg碳的標(biāo)準(zhǔn)物提供可靠的δ 13(：值。
[0224] 同位素比以"δ"符號(hào)來(lái)表示(％。），其中相對(duì)于在每百萬(wàn)偏差基礎(chǔ)上的標(biāo)準(zhǔn)物的同 位素組成的物質(zhì)的同位素組成由以下等式給出：3 13C(或315N) = (R?a/R^ithi)x 1，000,其中 R為重同位素形式對(duì)輕同位素形式的分子比率。碳的標(biāo)準(zhǔn)物為Vienna Pee Dee Belemnite (V-PDB)，并且氮的標(biāo)準(zhǔn)物為空氣。將NIST(國(guó)家技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)局）提案的SRM(標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)）號(hào) 1547(桃樹(shù)葉）用作校準(zhǔn)用基準(zhǔn)。在加州大學(xué)伯克利分校的穩(wěn)定同位素生物地球化學(xué)中心進(jìn) 行所有同位素分析。C和N同位素分析的長(zhǎng)期外部精度分別為0.10%。和0.15% 〇。
[0225] 使發(fā)孢甲基彎曲菌菌株0B3b以三個(gè)不同發(fā)酵批次在甲烷上生長(zhǎng)，使莢膜甲基球菌 Bath以兩個(gè)不同發(fā)酵批次在甲烷上生長(zhǎng)，并且使甲基單胞菌屬16a以單個(gè)發(fā)酵批次在甲烷 上生長(zhǎng)。分析來(lái)自這些培養(yǎng)物中的每個(gè)的生物質(zhì)的穩(wěn)定碳同位素分布(S 13C值;參見(jiàn)表3)。 [0226] 表3.不同甲烷氧化菌的穩(wěn)定碳同位素分布
[0227]
[0228]
[0229] *DCW、干細(xì)胞重量以從測(cè)量到的光密度（0D6QQ)利用比相關(guān)因素關(guān)聯(lián)Mt 0B3b的 1·Og/L至0·558g/L的0D、Mc Bath的1·Og/L至0·355g/L的0D和Mms 16a的1·Og/L至0·42g/L 的0D而計(jì)算出的g/L來(lái)列出。對(duì)于Mt 0B3b，每次發(fā)酵使用的碳酸氫鹽的初始濃度為1.2mM或 0.01 % (批號(hào)68C)和0.1 %或12mM(批號(hào)68A和68B)。
[0230] f EFT =有效發(fā)酵時(shí)間（以小時(shí)計(jì)）
[0231] 此外，對(duì)來(lái)自如實(shí)施例1所述的在生物反應(yīng)器中的甲烷上生長(zhǎng)的菌株發(fā)孢甲基彎 曲菌0B3b(Mt 0B3b)、莢膜甲基球菌Bath(Mc Bath)和甲基單胞菌屬16a(Mms 16a)的生物質(zhì) 和相應(yīng)脂質(zhì)部分(參見(jiàn)表4)進(jìn)行穩(wěn)定碳同位素分析。
[0232] 表4.細(xì)胞和脂質(zhì)的穩(wěn)定碳同位素分布
[0233]
[0234] 分別在94h時(shí)（3.14g DCW/L)、26h時(shí)（2.2g DCW/L)和39h時(shí)（1.14g DCW/L)收獲來(lái) 自菌株Mt 0B3b、Mc Bath和Mms 16a的生物質(zhì)。表4中脂質(zhì)的δ13(：值表示重復(fù)測(cè)定的平均值。
[0235] 實(shí)施例3
[0236] 甲烷來(lái)源和純度對(duì)脂質(zhì)的穩(wěn)定碳同位素分布的影響
[0237] 為檢測(cè)在含有天然氣組分的甲烷上的甲烷氧化菌的生長(zhǎng)，將含有100mL限定培養(yǎng) 基麗S1.0的一系列0.5升血清瓶用來(lái)自在供應(yīng)有1:1 (v/v)甲烷和空氣混合物的相同培養(yǎng)基 中生長(zhǎng)的血清瓶分批培養(yǎng)物(5 % v/v)的發(fā)孢甲基彎曲菌0B3b或莢膜甲基球菌Bath接種。培 養(yǎng)基MMS1.0的組成如下：0.8mM MgS〇4*7H20、30mM NaN03、0.14mM CaCl2、1.2mM NaHC03、 2.35mM KH2P〇4、3.4mM Κ2ΗΡ〇4、20.7μΜ Na2Mo〇4*2H2〇、6yM CuS〇4*5H20、10yM Fem-Na-EDTA 和lmL/升的微量金屬溶液（含有每升：500mg FeS04*7H20、400mg ZnS〇4*7H20、20mg MnCh* 7H20、50mg CoCl2*6H20、10mg NiCl2*6H2〇、15mg H3B03、250mg EDTA)。在將培養(yǎng)基高壓滅菌 并冷卻后，添加磷酸鹽、碳酸氫鹽和Fem-Na-EDTA。培養(yǎng)基的最終pH為7.0±0.1。
[0238] 將所接種的瓶子用橡膠套塞密封，并且用通過(guò)注射器添加的60mL甲烷氣體通過(guò)無(wú) 菌的0.45μπι濾器和無(wú)菌的27G針頭來(lái)注射。將復(fù)制的培養(yǎng)物各自用60mL體積的99 %純度的 (A)甲燒（2.0 級(jí)，Praxair through Alliance Gas, San Carlos, CA)、代表天然氣標(biāo)準(zhǔn)的 70%純度的(B)甲烷(Sigma-Aldrich;還含有9%乙烷、6%丙烷、3%甲基丙烷、3%丁烷及其 他較小烴組分）、作為甲烷來(lái)源A和B的1:1混合物遞送的85%純度的(C)甲烷；以及(D)>93% 甲燒（1.3級(jí)，Specialty Chemical Products，South Houston，TX;內(nèi)部分析顯不組成>99% 甲烷）。將培養(yǎng)物在30 °C(發(fā)孢甲基彎曲菌菌株0B3b)或42 °C(莢膜甲基球菌Bath)下用 250rpm旋轉(zhuǎn)震蕩孵育，并且以大約12小時(shí)間隔通過(guò)取出lmL樣品以測(cè)定OD600來(lái)計(jì)算生長(zhǎng)。在 這些時(shí)候，將瓶子放空，并且將頂部空間用60mL各自的甲烷來(lái)源(A、B、C或D)和60mL濃縮氧 氣(至少85 %純度)替換。以約24小時(shí)間隔將5mL樣品移除，將細(xì)胞通過(guò)離心(8，OOOrpm，10分 鐘）回收，然后在分析前在-80 °C下儲(chǔ)存。
[0239] 實(shí)施對(duì)來(lái)源于發(fā)孢甲基彎曲菌菌株0B3b和莢膜甲基球菌Bath的甲烷氧化菌生物 質(zhì)的碳和氮含量(干重％)以及碳(13C)和氮( 15N)穩(wěn)定同位素比的分析。表5示出來(lái)自在具有 不同水平和純度的甲烷上以及在不同批次的瓶培養(yǎng)中生長(zhǎng)的莢膜甲基球菌Bath的生物質(zhì) 樣品的穩(wěn)定碳同位素分析的結(jié)果。
[0240] 表5.在具有不同純度的不同甲烷來(lái)源上生長(zhǎng)的莢膜甲基球菌Bath的穩(wěn)定碳同位 素分布
[0241]
[0242] *甲烷純度:A: 99 %甲烷，2.0級(jí)（最小值99 % ); B: 70 %甲烷，天然氣標(biāo)準(zhǔn)（含有9 % 乙燒、6%丙烷、3%甲基丙烷、3%丁燒）；C:85%甲燒(A甲燒和B甲燒的1:1混合物）
[0243] f時(shí)間=瓶培養(yǎng)時(shí)間（以小時(shí)計(jì)）
[0244] 在一種甲烷來(lái)源(A，99 % )上生長(zhǎng)的莢膜甲基球菌Bath的平均δ13(：為-41.2 ± 1.2， 然而在一種不同的甲烷來(lái)源(Β，70%)上生長(zhǎng)的莢膜甲基球菌Bath的平均δ13(：為-44.2土 1.2。當(dāng)甲烷來(lái)源Α和Β混合時(shí)，觀察到-43.8±2.4的中間平均δ 13(：。這些數(shù)據(jù)顯示了由于輸入 甲烷的S13C的差異，在甲烷來(lái)源Α和Β上生長(zhǎng)的細(xì)胞材料的δ 13(：彼此顯著不同。但是，在兩種 氣體的混合物上生長(zhǎng)的細(xì)胞優(yōu)先地利用12C，并且因此顯示出更負(fù)δ 13(：值的趨勢(shì)。
[0245] 進(jìn)行相似的實(shí)驗(yàn)以檢驗(yàn)在不同甲烷來(lái)源上以及在不同批次的瓶培養(yǎng)中生長(zhǎng)的兩 種不同甲烷氧化菌(莢膜甲基球菌Bath和發(fā)孢甲基彎曲菌0B3b)是否顯示δ 13(：分布(參見(jiàn)，表 6)的差異。
[0246] 表6.在不同純度的不同甲烷來(lái)源上生長(zhǎng)的不同甲烷氧化菌的穩(wěn)定碳同位素分布
[0247]
[0248] *甲烷來(lái)源和純度:A:99%甲烷(2.0級(jí)）；D:>93%甲烷（1.3級(jí)）
[0249] 言時(shí)間=瓶培養(yǎng)時(shí)間（以小時(shí)計(jì)）
[0250]在第一甲烷來(lái)源(A)上生長(zhǎng)的莢膜甲基球菌的平均δ13(：為-44.5±8.8,然而在相同 甲烷來(lái)源上生長(zhǎng)的發(fā)孢甲基彎曲菌的平均S13C為-47.8±2.0。在第二甲烷來(lái)源(Β)上生長(zhǎng)的 莢膜甲基球菌的平均& 3C為_(kāi)37.9±0.4,然而發(fā)孢甲基彎曲菌的平均δ13(：為_(kāi)39.8±4.5。這 些數(shù)據(jù)顯示了在甲烷來(lái)源上生長(zhǎng)的細(xì)胞材料的δ 13(：高度類似于來(lái)自在相同甲烷來(lái)源上生長(zhǎng) 的不同菌株的細(xì)胞材料的S13C。因此，觀察到的細(xì)胞材料的δ 13(：似乎主要依賴于輸入氣體的 組成，而不是所研究的特定細(xì)菌菌株的性質(zhì)。
[0251] 可組合以上所述的各個(gè)實(shí)施方案來(lái)提供其他實(shí)施方案。本說(shuō)明書(shū)中提及的或本申 請(qǐng)數(shù)據(jù)表中列出的專利和非專利出版物的全部?jī)?nèi)容(包括2014年1月16日提交的美國(guó)臨時(shí) 專利申請(qǐng)?zhí)?1/928,366的公開(kāi)）以引用方式整體并入本文。如果需要采用各種專利、申請(qǐng)和 出版物的構(gòu)思來(lái)提供其他實(shí)施方案，可修改實(shí)施方案的方面。
[0252] 可根據(jù)以上詳細(xì)說(shuō)明來(lái)對(duì)實(shí)施方案進(jìn)行這些變化和其他變化。通常，在以下實(shí)施 方案中，所使用的術(shù)語(yǔ)不應(yīng)該解釋為將實(shí)施方案限于本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中公開(kāi)的具體 實(shí)施方案，而應(yīng)該解釋為包括所有可能實(shí)施方案以及此類實(shí)施方案所授權(quán)的等效物的全部 范圍。因此，實(shí)施方案不受公開(kāi)限制。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組&代謝微生物，其包含選自由以下組成的組的外源性核酸:編碼碳水化合物 生物合成酶的外源性核酸，和編碼可操作地連接至編碼天然碳水化合物生物合成酶的核酸 的表達(dá)控制序列的核酸，其中所述重組&代謝微生物能夠?qū)⑻烊粴鈦?lái)源的碳原料轉(zhuǎn)化成所 需碳水化合物。2. 如權(quán)利要求1所述的重組C1代謝微生物，其中所述外源性核酸編碼碳水化合物生物合 成酶。3. 如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的重組C1代謝微生物，其中所述天然氣來(lái)源的原料是天 然氣。4. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的重組C1代謝微生物，其中所述天然氣來(lái)源的原料是甲 烷。5. 如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的重組C1代謝微生物，其中所述重組&代謝微生物能夠 產(chǎn)生所述所需碳水化合物，所產(chǎn)生的水平大于天然&代謝微生物所產(chǎn)生的水平至少10%。6. 如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的重組C1代謝微生物，其中所述C1代謝微生物是甲烷氧 化菌。7. 如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的重組C1代謝微生物，其中所述所需碳水化合物選自由 多糖、二糖和單糖組成的組。8. 如權(quán)利要求7所述的重組C1代謝微生物，其中所述所需碳水化合物是多糖，所述多糖 是匍聚糖。9. 如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的重組C1代謝微生物，其中所述β-葡聚糖選自由以下組 成的組:β-(1，3)_ 葡聚糖、0-(1，3)(1，6)-葡聚糖、0-(1，3)(1，4)-葡聚糖、0-(1，4)-葡聚糖 和β_(1，6)_葡聚糖。10. 如權(quán)利要求8-9中任一項(xiàng)所述的重組C1代謝微生物，其中所述外源性核酸編碼碳水 化合物生物合成酶，所述碳水化合物生物合成酶是葡聚糖合酶。11. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的重組C1代謝微生物，其中所述外源性核酸編碼作為 糖異生酶的碳水化合物生物合成酶。12. 如權(quán)利要求11所述的重組C1代謝微生物，其中所述糖異生酶選自由以下組成的組： 丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘 油醛-3-磷酸脫氫酶、A型醛縮酶、果糖1，6_二磷酸酶、磷酸果糖激酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶、己糖 激酶和葡糖-6-磷酸。13. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的重組C1代謝微生物，其中所述外源性核酸編碼作為 糖原生成酶的碳水化合物生物合成酶。14. 如權(quán)利要求13所述的重組C1代謝微生物，其中所述糖原生成酶選自由以下組成的 組:葡糖-1-磷酸腺苷?；D(zhuǎn)移酶、糖原合成酶和1，4-α_葡聚糖分支蛋白。15. 如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的重組C1代謝微生物，其中所述外源性核酸編碼對(duì)于 細(xì)菌是內(nèi)源性的碳水化合物生物合成酶。16. 如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的重組C1代謝微生物，其中所述外源性核酸編碼對(duì)于 選自由酵母、真菌和植物組成的組的生物體是內(nèi)源性的碳水化合物生物合成酶。17. 如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的重組C1代謝微生物，其中所述外源性核酸編碼對(duì)于 選自由大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌組成的組的微生物是內(nèi)源性的碳水化合物生物合成酶。18. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的重組C1代謝微生物，其中所述外源性核酸編碼碳水 化合物生物合成酶，所述碳水化合物生物合成酶具有與選自由以下SEQ ID NO組成的組的 參照序列至少90% 相同的氨基酸序列：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、 34、36和38。19. 如權(quán)利要求1和3-9中任一項(xiàng)所述的重組C1代謝微生物，其中所述外源性核酸編碼可 操作地連接至編碼天然碳水化合物生物合成酶的核酸的表達(dá)控制序列。20. 如權(quán)利要求19所述的重組C1代謝微生物，其中所述天然碳水化合物生物合成酶是天 然糖異生酶。21. 如權(quán)利要求19所述的重組C1代謝微生物，其中所述天然碳水化合物生物合成酶是天 然糖原生成酶。22. 如權(quán)利要求19所述的重組C1代謝微生物，其中所述天然碳水化合物生物合成酶是天 然葡聚糖合酶。23. 如權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所述的重組C1代謝微生物，其中所述外源性核酸經(jīng)過(guò)密碼 子優(yōu)化以在所述重組C 1代謝微生物中最佳表達(dá)。24. 如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的重組C1代謝微生物，其中所述外源性核酸編碼碳水 化合物生物合成酶，所述碳水化合物生物合成酶包含與選自由以下SEQ ID NO組成的組的 核酸參照序列至少85%相同的核酸序列：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、 31、33、35和37。25. 如權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的重組C1代謝微生物，其中所述微生物展現(xiàn)出小于-30%。的 S13C。26. 如權(quán)利要求25所述的重組C1代謝微生物，其中所述微生物展現(xiàn)出小于-40%。的δ13(：。27. -種生物質(zhì)，其來(lái)源于如權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)所述的重組C1代謝微生物。28. 如權(quán)利要求27所述的生物質(zhì)，其中所述生物質(zhì)展現(xiàn)出小于-30%。的δ13(：。29. 如權(quán)利要求28所述的生物質(zhì)，其中所述生物質(zhì)展現(xiàn)出小于-40%。的δ13(：。30. -種碳水化合物組合物，其包含從如權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)中提取 的碳水化合物，其中所述組合物展現(xiàn)出小于-30%。的δ 13(：。31. 如權(quán)利要求30所述的組合物，其中所述組合物展現(xiàn)出小于-40%。的δ13(：。32. -種動(dòng)物飼料，其包含如權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)或如權(quán)利要求30-31中任一項(xiàng)所述的碳水化合物組合物。33. 如權(quán)利要求32所述的動(dòng)物飼料，其還包含選自由以下組成的組的添加劑:植物來(lái)源 的材料、動(dòng)物來(lái)源的材料和微生物來(lái)源的材料。34. 如權(quán)利要求33所述的動(dòng)物飼料，其中所述添加劑是來(lái)源于異源微生物的微生物來(lái) 源材料。35. 如權(quán)利要求33所述的動(dòng)物飼料，其中所述添加劑是植物來(lái)源的材料。36. 如權(quán)利要求35所述的動(dòng)物飼料，其中所述植物來(lái)源的材料來(lái)源于玉米。37. 如權(quán)利要求35所述的動(dòng)物飼料，其中所述植物來(lái)源的材料選自由大豆粉和豌豆蛋 白組成的組。38. 如權(quán)利要求33所述的動(dòng)物飼料，其中所述添加劑是動(dòng)物來(lái)源的材料。39. 如權(quán)利要求38所述的動(dòng)物飼料，其中所述動(dòng)物來(lái)源的材料是魚(yú)粉。40. -種培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基，其包含如權(quán)利要求27-29中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)或如權(quán) 利要求30-31中任一項(xiàng)所述的組合物。41. 一種生產(chǎn)所需碳水化合物的方法，所述方法包括在天然氣來(lái)源的碳原料存在下在 足以產(chǎn)生所述所需碳水化合物的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)所述的重組C 1代謝 微生物。42. 如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述天然氣來(lái)源的碳原料是天然氣。43. 如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述天然氣來(lái)源的碳原料是甲烷。
【文檔編號(hào)】A23K10/16GK105916976SQ201580004796
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2015年1月16日
【發(fā)明人】J·A·西爾弗曼, L·J·吉維爾, J·米勒, R·M·薩維爾, D·D·瑞基茲蓋
【申請(qǐng)人】凱利斯塔公司