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制備氣道細(xì)胞的組合物和方法

文檔序號(hào):10556817閱讀:951來源:國知局
制備氣道細(xì)胞的組合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了制備氣道細(xì)胞的組合物和方法。在一個(gè)方面,描述了源自誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞的上皮氣道細(xì)胞,其特征在于表達(dá)氣道細(xì)胞表面標(biāo)記和增殖的能力。在另一個(gè)方面,提供了將iPS分化為上皮氣道細(xì)胞的方法。還公開了工程化肺、制造包括上皮氣道細(xì)胞的這樣的工程化肺和治療呼吸障礙的方法。
【專利說明】制備氣道細(xì)胞的組合物和方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2014年1月14日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/927,097的優(yōu)先權(quán),其 全部公開內(nèi)容通過引用并入本文,如同以其全部在本文陳述一樣。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 在美國,有大約30,000人患有囊性纖維化(CF),并且每年診斷出大約1,000例新的 CFXF是最嚴(yán)重地影響肺以及胰腺、肝和腸的常染色體隱性遺傳病。其特征在于異常地輸送 氯化物和鈉穿過上皮,導(dǎo)致稠密的、粘性的分泌物?;加蠧F的人中最常見的死亡原因是呼吸 衰竭。多個(gè)研究已經(jīng)顯示囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)基因的突變可以損害折疊、 分泌、細(xì)胞表面穩(wěn)定性、和/或穿過上皮的CFTR氯離子通道的功能。雖然在進(jìn)行巨大的努力 以鑒定靶向CFTR結(jié)構(gòu)缺陷的化合物,但是到目前為止它們的臨床療效被證明很差,這凸顯 出更好地理解CFTR調(diào)節(jié)的分子機(jī)制的必要性,其是用于研發(fā)更有效的療法的先決條件。
[0005] 在氣道中,CFTR突變對(duì)近端氣道上皮細(xì)胞具有很大影響。CF研究中的主要困難之 一是缺少供機(jī)制研究和藥物研發(fā)使用的活的人近端氣道上皮細(xì)胞一一細(xì)胞類型受CFTR突 變選擇性地影響。CF的動(dòng)物模型通常不非常好地重演人的狀況。
[0006]已經(jīng)顯示誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞展示了發(fā)育為肺泡上皮細(xì)胞的潛能。多個(gè)研究組 已經(jīng)報(bào)道,使用多種方案朝向肺泡II型細(xì)胞分化ESC和iPS細(xì)胞。然而,仍然很差地理解這些 極度重要的氣道疾病的許多方面。
[0007] 因此,本領(lǐng)域中存在用于鑒定將要在肺相關(guān)療法中使用的功能性氣道上皮細(xì)胞的 可靠來源的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明包括制備氣道上皮細(xì)胞的組合物和方法,該氣道上皮細(xì)胞可以在組織工程 中使用并且可以用于治療呼吸障礙。
[0009] 在一個(gè)方面,本發(fā)明包括源自誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞,其特征在于 氣道細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)一一其中氣道細(xì)胞表面標(biāo)記包括克拉拉細(xì)胞分泌蛋白(CCSP)、細(xì) 胞角蛋白5(KRT5)和F0XJ1--和在培養(yǎng)中增殖而不喪失氣道細(xì)胞表面標(biāo)記的能力。在一個(gè) 方面,本發(fā)明包括將誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞分化為氣道上皮細(xì)胞的方法,其包括在缺乏血清 的情況下培養(yǎng)iPS細(xì)胞以誘導(dǎo)分化為定形內(nèi)胚層(DE)細(xì)胞,在存在血清的情況下培養(yǎng)DE細(xì) 胞以誘導(dǎo)分化為前前腸內(nèi)胚層(anterior foregut endoderm)(AFE)細(xì)胞,并且在存在血 清、細(xì)胞因子混合物(cocktail)和高濃度的視黃酸的情況下培養(yǎng)AFE細(xì)胞以誘導(dǎo)AFE細(xì)胞分 化為氣道上皮細(xì)胞。在另一個(gè)方面,本發(fā)明包括工程化三維肺組織的方法,其包括將誘導(dǎo)多 能干(iPS)細(xì)胞群分化為氣道上皮細(xì)胞--其中氣道上皮細(xì)胞表達(dá)包括克拉拉細(xì)胞分泌蛋 白(CCSP)、細(xì)胞角蛋白5(KRT5)和F0XJ1的氣道細(xì)胞表面標(biāo)記;并且能夠在培養(yǎng)中增殖而不 喪失氣道細(xì)胞標(biāo)記一一和將氣道上皮細(xì)胞接種在三維支架上。在又另一個(gè)方面,本發(fā)明包 括包含本文所述的氣道上皮細(xì)胞的工程化三維肺組織。
[0010]在本文描繪的本發(fā)明的以上方面或任何其它方面的多種實(shí)施方式中,本發(fā)明包括 有纖毛的氣道上皮細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中,氣道上皮細(xì)胞源自囊性纖維化人iPS細(xì)胞。 在又另一個(gè)實(shí)施方式中,氣道上皮細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中增殖至少大約30天,比如大于大約30 天。
[0011] 在另一個(gè)實(shí)施方式中,氣道細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)進(jìn)一步包括囊性纖維化跨膜傳導(dǎo) 調(diào)節(jié)蛋白(CFTR),和/或β-微管蛋白IV、粘蛋白-5AC和P63中的至少一種。在又另一個(gè)實(shí)施方 式中,氣道細(xì)胞表面標(biāo)記以比得上在新鮮分離的人氣道細(xì)胞上表達(dá)的水平表達(dá)。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施方式中,培養(yǎng)iPS細(xì)胞包括在存在激活素 Α的情況下培養(yǎng)iPS細(xì)胞。在這 樣的實(shí)施方式中,激活素 A在iPS細(xì)胞培養(yǎng)中處于大約飽和濃度。在另一個(gè)實(shí)施方式中,培養(yǎng) iPS細(xì)胞包括在存在無血清補(bǔ)充物的情況下培養(yǎng)iPS細(xì)胞。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施方式中,DE細(xì)胞表達(dá)選自c-ki t、S0X17、F0XA2和CXCR4的一種或多種定 形內(nèi)胚層細(xì)胞標(biāo)記。在這樣的實(shí)施方式中,在存在ECM分子的情況下的培養(yǎng)包括在用ECM分 子培養(yǎng)之前使DE細(xì)胞解離。同樣,ECM分子可以包括膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、生腱 蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖和糖胺聚糖中的一種或多種。在另一個(gè)實(shí)施方式中,培養(yǎng)DE細(xì)胞 包括順序地暴露DE細(xì)胞至小分子抑制劑以抑制后內(nèi)胚層命運(yùn)(posterior endoderm fate) 和誘導(dǎo)近端內(nèi)胚層命運(yùn)(proximal endoderm fate),比如抑制BMP/TGF信號(hào)傳導(dǎo)的小分子 抑制劑,諸如 dorsomorphin、Noggin、A83-01、DMH-l、D4476、GW788388、LY364947、RepSox、 SB431542、SB505124、SB525334和SD208。同樣,小分子抑制劑可以抑制TGF/WNT信號(hào)傳導(dǎo),比 如 1洲-1、勖88丨11、〇:1'036477、1肝2、去甲氧基姜黃素、^535483-01、04476、6¥788388、 LY364947、R印 5(?、58431542、58505124、58525334和50208。
[0014] 在另一個(gè)實(shí)施方式中,AFE細(xì)胞表達(dá)NKX2.1。
[0015] 在又另一個(gè)實(shí)施方式中,高濃度的視黃酸包括至少大約0.5μΜ的視黃酸,比如大約 1μΜ〇
[0016] 在另一個(gè)實(shí)施方式中,細(xì)胞因子混合物抑制WNT途徑。
[0017] 在還另一個(gè)實(shí)施方式中,iPS細(xì)胞源自患病的人細(xì)胞,比如囊性纖維化疾病特異性 人iPS細(xì)胞。
[0018] 在另一個(gè)方面,本發(fā)明包括改善、治療或減輕需要其的對(duì)象中的呼吸障礙的癥狀 的方法,其包括將誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞分化為氣道上皮細(xì)胞一一其中氣道上皮細(xì)胞表達(dá) 包括克拉拉細(xì)胞分泌蛋白(CCSP)、細(xì)胞角蛋白5(KRT5)和F0XJ1的氣道細(xì)胞表面標(biāo)記,并且 能夠在培養(yǎng)中增殖而不喪失氣道細(xì)胞標(biāo)記--和以對(duì)治療對(duì)象中的呼吸障礙有效的量施 用氣道上皮細(xì)胞。
[0019] 在本文描繪的本發(fā)明的以上方面或任何其它方面的多種實(shí)施方式中,本發(fā)明包括 形成類器官結(jié)構(gòu)的氣道上皮細(xì)胞。
[0020]在另一個(gè)實(shí)施方式中,三維支架包括基質(zhì)膠(matrigel)。
【附圖說明】
[0021]圖1圖解了將人iPS細(xì)胞分化為氣道上皮細(xì)胞的步驟。
[0022]圖2A顯示了在第5天時(shí)表達(dá)c-kit的源自iPS細(xì)胞的細(xì)胞群的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。 [0023]圖2B顯示了在第5天時(shí)表達(dá)F0XA2的源自iPS細(xì)胞的細(xì)胞群的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。 [0024]圖2C顯示了在第5天時(shí)表達(dá)S0X17的源自iPS細(xì)胞的細(xì)胞群的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。
[0025]圖2D顯示了在第5天時(shí)在克隆Cl中表達(dá)CXCR4的源自iPS細(xì)胞的細(xì)胞群的流式細(xì)胞 檢測(cè)分析。
[0026]圖3A顯示了在AFE分化期間激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)F0XA2/S0X2表達(dá)的作用。
[0027]圖3B顯示了在AFE分化期間激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)NKX2.1表達(dá)的作用。
[0028]圖4圖解了方案的步驟,操作所述方案以將人iPS細(xì)胞分化為氣道上皮細(xì)胞并導(dǎo)致 NKX2.1+F0XA2+細(xì)胞的增加。
[0029] 圖5顯示了與暴露于N0GGIN/SB的DE細(xì)胞相比,第15天時(shí)NKX2.1+F0XA2+細(xì)胞的增 加,小于1 %沒有前部化(anteriorization) 〇
[0030] 圖6A顯示了用DAPI染色的離體分化的ΝΚΧ2.Γ細(xì)胞。
[0031] 圖6B顯示了用F0XA2染色的離體分化的ΝΚΧ2.Γ細(xì)胞。
[0032] 圖6C顯示了用NKX2.1染色的離體分化的ΝΚΧ2.Γ細(xì)胞。
[0033] 圖6D顯示了用NKX2.1/F0XA2/DAPI共染色的離體分化的ΝΚΧ2.Γ細(xì)胞,表明ΝΚΧ2.Γ 細(xì)胞在體外分化。
[0034] 圖7A顯示了用DAPI染色的離體分化的NKX2.1+/S0X2+。
[0035] 圖7B顯示了用S0X2染色的離體分化的NKX2.1+/S0X2+。
[0036] 圖7C顯示了用NKX2.1染色的離體分化的NKX2.1+/S0X2+。
[0037] 圖7D顯示了用S0X2/NKX2.1/DAPI染色的離體分化的NKX2.1+/S0X2+,表明NKX2. Γ/ S0X2+細(xì)胞在體外分化。
[0038] 圖8是顯示與治療前的大約1-2%相比,NKX2.1+/S0X2+氣道祖細(xì)胞接近大約30%的 柱形圖。
[0039]圖9是顯示氣道分化和基礎(chǔ)培養(yǎng)基的補(bǔ)充物的圖。
[0040]圖10A顯示了第20天時(shí)的F0XJ1的定量RT-PCR產(chǎn)生成熟肺氣道上皮細(xì)胞。
[00411圖10B顯示了第20天時(shí)的KRT5的定量RT-PCR產(chǎn)生成熟肺氣道上皮細(xì)胞。
[0042]圖10C顯示了第20天時(shí)的CFTR的定量RT-PCR產(chǎn)生成熟肺氣道上皮細(xì)胞。
[0043] 圖10D顯示了第20天時(shí)的CCSP或SCGB1A1的定量RT-PCR產(chǎn)生成熟肺氣道上皮細(xì)胞。
[0044]圖10E顯示了第20天時(shí)的P63的定量RT-PCR產(chǎn)生成熟肺氣道上皮細(xì)胞。
[0045]圖10F顯示了第20天時(shí)的S0X2的定量RT-PCR產(chǎn)生成熟肺氣道上皮細(xì)胞。
[0046]圖10G顯示了第20天時(shí)的粘蛋白5AC的定量RT-PCR產(chǎn)生成熟肺氣道上皮細(xì)胞。
[0047]圖11是顯示在第27天時(shí)生長因子和抑制劑結(jié)合誘導(dǎo)氣道上皮分化的圖。
[0048]圖12A顯示了在第27天時(shí)表達(dá)F0XJ1的源自iPS細(xì)胞的細(xì)胞群的流式細(xì)胞檢測(cè)分 析。
[0049]圖12B顯示了在第27天時(shí)表達(dá)CFTR的源自iPS細(xì)胞的細(xì)胞群的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。 [0050]圖12C顯示了在第27天時(shí)表達(dá)β-微管蛋白IV的源自iPS細(xì)胞的細(xì)胞群的流式細(xì)胞 檢測(cè)分析。
[0051 ]圖12D顯示了在第27天時(shí)表達(dá)S0X2的源自iPS細(xì)胞的細(xì)胞群的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。 [0052]圖12E顯示了在第27天時(shí)表達(dá)CCSP的源自iPS細(xì)胞的細(xì)胞群的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。 [0053]圖12F顯示了在第27天時(shí)表達(dá)KRT5的源自iPS細(xì)胞的細(xì)胞群的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。 [0054]圖12G顯示了在第27天時(shí)表達(dá)粘蛋白5AC的源自iPS細(xì)胞的細(xì)胞群的流式細(xì)胞檢測(cè) 分析。
[0055]圖12H顯示了在第27天時(shí)表達(dá)P63的源自iPS細(xì)胞的細(xì)胞群的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。 [0056]圖13A顯示了在第27天時(shí)的CFTR的定量RT-PCR產(chǎn)生成熟肺氣道上皮細(xì)胞。
[0057]圖13B顯示了在第27天時(shí)的F0XJ1的定量RT-PCR產(chǎn)生成熟肺氣道上皮細(xì)胞。
[0058] 圖13C顯示了在第27天時(shí)的SCGB1A1 (CCSP)的定量RT-PCR產(chǎn)生成熟肺氣道上皮細(xì) 胞。
[0059]圖13D顯示了在第27天時(shí)的粘蛋白5AC的定量RT-PCR產(chǎn)生成熟肺氣道上皮細(xì)胞。 [0060]圖13E顯示了在第27天時(shí)的NKX2.1的定量RT-PCR產(chǎn)生成熟肺氣道上皮細(xì)胞中。
[00611圖13F顯示了在第27天時(shí)的KRT5的定量RT-PCR產(chǎn)生成熟肺氣道上皮細(xì)胞。
[0062]圖14是顯示在第35天時(shí)氣道上皮細(xì)胞分化成熟的圖。
[0063] 圖15A顯示了染色為近端先祖(proximal progenitor)的氣道上皮細(xì)胞。
[0064]圖15B顯示了用F0XJ1抗體染色的氣道上皮細(xì)胞。
[0065]圖15C顯示了用粘蛋白5AC抗體染色的氣道上皮細(xì)胞。
[0066]圖1?顯示了用CCSP抗體染色的氣道上皮細(xì)胞。
[0067]圖15E顯示了用CFTR抗體染色的氣道上皮細(xì)胞。
[0068] 圖15F顯示了用PanKRT抗體染色的氣道上皮細(xì)胞。
[0069]圖16A顯示了第35天時(shí)氣道細(xì)胞標(biāo)記粘蛋白5AC的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。
[0070]圖16B顯示了第35天時(shí)氣道細(xì)胞標(biāo)記F0XJ1的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。
[0071]圖16C顯示了第35天時(shí)氣道細(xì)胞標(biāo)記β-微管蛋白IV的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。
[0072]圖16D顯示了第35天時(shí)氣道細(xì)胞標(biāo)記Ρ63的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。
[0073]圖16Ε顯示了第35天時(shí)氣道細(xì)胞標(biāo)記CFTR的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。
[0074]圖16F顯示了第35天時(shí)氣道細(xì)胞標(biāo)記CCSP的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。
[0075]圖16G顯示了第35天時(shí)氣道細(xì)胞標(biāo)記CK5或KRT5的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。
[0076]圖16H顯示了第35天時(shí)氣道細(xì)胞標(biāo)記S0X2的流式細(xì)胞檢測(cè)分析。
[0077] 圖17A顯示了在第35天時(shí)的KRT5或CK5的定量RT-PCR產(chǎn)生iPS源氣道上皮細(xì)胞。
[0078] 圖17B顯示了在第35天時(shí)的CFTR的定量RT-PCR產(chǎn)生iPS源氣道上皮細(xì)胞。
[0079] 圖17C顯示了在第35天時(shí)的NKX2.1的定量RT-PCR產(chǎn)生iPS源氣道上皮細(xì)胞。
[0080] 圖17D顯示了在第35天時(shí)的P63的定量RT-PCR產(chǎn)生iPS源氣道上皮細(xì)胞中。
[0081 ] 圖17E顯示了在第35天時(shí)的SCGB1A1或CCSP的定量RT-PCR產(chǎn)生iPS源氣道上皮細(xì)胞 中。
[0082] 圖17F顯示了在第35天時(shí)的F0XJ1的定量RT-PCR產(chǎn)生iPS源氣道上皮細(xì)胞。
[0083] 圖17G顯示了在第35天時(shí)的粘蛋白5AC的定量RT-PCR產(chǎn)生iPS源氣道上皮細(xì)胞。
[0084]圖18圖解了從CF疾病特異性人iPS細(xì)胞生成肺氣道先祖的逐步分化途徑。
[0085]圖19A顯示了用CFTR抗體染色的源自CF疾病特異性人iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞。 [0086]圖19B顯示了用粘蛋白5AC抗體染色的源自CF疾病特異性人iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì) 胞。
[0087]圖19C顯示了用PanKRT抗體染色的源自CF疾病特異性人iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞。 [0088]圖19D顯示了用CCSP抗體染色的源自CF疾病特異性人iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞。 [0089]圖20A顯示了源自CF疾病特異性人iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞中的粘蛋白5AC的流式 細(xì)胞檢測(cè)分析。
[0090] 圖20B顯示了源自CF疾病特異性人iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞中的P63的流式細(xì)胞檢 測(cè)分析。
[0091] 圖20C顯示了源自CF疾病特異性人iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞中的β-微管蛋白IV的 流式細(xì)胞檢測(cè)分析。
[0092]圖20D顯示了源自CF疾病特異性人iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞中的F0XJ1的流式細(xì)胞 檢測(cè)分析。
[0093]圖20E顯示了源自CF疾病特異性人iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞中的CFTR的流式細(xì)胞 檢測(cè)分析。
[0094]圖20F顯示了源自CF疾病特異性人iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞中的S0X2的流式細(xì)胞 檢測(cè)分析。
[0095]圖20G顯示了源自CF疾病特異性人iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞中的CK5或KRT5的流式 細(xì)胞檢測(cè)分析。
[0096]圖20H顯示了源自CF疾病特異性人iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞中的CCSP的流式細(xì)胞 檢測(cè)分析。
[0097]圖21A顯示了源自CF疾病特異性人iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞中的NKX2.1的定量RT-PCR〇
[0098]圖21B顯示了源自CF疾病特異性人iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞中的粘蛋白5AC的定量 RT-PCR。
[0099]圖21C顯示了源自CF疾病特異性人iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞中的S0X2的定量RT-PCR〇
[0100] 圖21D顯示了源自CF疾病特異性人iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞中的P63的定量RT-PCR〇
[0101] 圖21E顯示了源自CF疾病特異性人iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞中的SCGB1A1或CCSP的 定量 RT-PCR。
[0102] 圖21F顯示了源自CF疾病特異性人iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞中的F0XJ1的定量RT-PCR〇
[0103] 圖21G顯示了源自CF疾病特異性人iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞中的KRT5的定量RT-PCR〇
[0104] 圖21H顯示了源自CF疾病特異性人iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞中的CFTR的定量RT-PCR〇
[0105] 圖22A是顯示在基質(zhì)膠中發(fā)育為肺類器官結(jié)構(gòu)的源自iPSC的氣道祖細(xì)胞的陽性 P63免疫染色的一組圖。
[0106] 圖22B是顯示在基質(zhì)膠中發(fā)育為肺類器官結(jié)構(gòu)的源自iPSC的氣道祖細(xì)胞的陽性 NKX2.1免疫染色的一組圖。
[0107] 發(fā)明【具體實(shí)施方式】
[0108] 定義
[0109] 除非另外限定,本文使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員 通常理解的相同的含義。雖然與本文描述的那些類似或等價(jià)的任何方法和材料可以在用于 測(cè)試本發(fā)明的實(shí)踐中使用,但是本文描述了優(yōu)選的材料和方法。在描述和要求保護(hù)本發(fā)明 中,將使用以下術(shù)語。
[0110] 還可以理解,本文使用的術(shù)語僅僅是出于描述【具體實(shí)施方式】的目的,并且不意欲 是限制性的。
[0111] 如本文使用的,冠詞"一個(gè)(a)"和"一種(an)"用于指一個(gè)或多于一個(gè)(即,至少一 個(gè))該冠詞的語法對(duì)象。舉例來說,"一個(gè)要素"意思是一個(gè)要素或多于一個(gè)要素。
[0112] 如本文使用的,當(dāng)提及可測(cè)量的值比如量、時(shí)距等時(shí),術(shù)語"大約"意為包含規(guī)定值 的±20%的變化、或在規(guī)定值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、 0.1%、0.05%或0.01%內(nèi),因?yàn)檫@樣的變化適合于進(jìn)行公開的方法。除非另外從上下文清 楚,本文提供的全部數(shù)值由術(shù)語大約修飾。
[0113] "前前腸內(nèi)胚層"是在生成肝的內(nèi)胚層前面的內(nèi)胚層。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地領(lǐng) 會(huì)"前前腸內(nèi)胚層"因而包括,例如,咽內(nèi)胚層和其它更高度分化的內(nèi)胚層細(xì)胞群,并且術(shù)語 "前前腸內(nèi)胚層"包含的多種細(xì)胞類型可以展示分子標(biāo)記的不同的表達(dá)模式。本領(lǐng)域技術(shù)人 員將領(lǐng)會(huì)"前前腸內(nèi)胚層"生成多種組織,例如,扁桃體、鼓膜、甲狀腺、甲狀旁腺、胸腺、氣 管、食管、胃、肺和喉/咽。
[0114] 如本文使用的,術(shù)語"分化"指的是較少特化的細(xì)胞比如干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 變?yōu)楦鼗募?xì)胞類型,以便其成為特定的譜系一一包括但不限于某些祖細(xì)胞以及更特化 的體細(xì)胞--的過程。干細(xì)胞分化的條件是本領(lǐng)域中熟知的。
[0115] 如本文使用的,"分化培養(yǎng)基"指的是細(xì)胞生長培養(yǎng)基,其包含添加劑或缺乏添加 劑,以便當(dāng)在該培養(yǎng)基中培育時(shí),干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能細(xì)胞、或未完全分化的其它這樣的組細(xì) 胞發(fā)育為具有分化細(xì)胞或比干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能細(xì)胞或其它這樣的細(xì)胞更多地分化的細(xì)胞的 一些或全部特性的細(xì)胞。
[0116] "定形內(nèi)胚層細(xì)胞"意思是表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系的一種或多種標(biāo)記的細(xì)胞。這些標(biāo) 記可以包括但不限于 CXCR4、S0X17、GATA-4、F0XA2、AFP、CER1、C-KIT、EPCAM、SNAI1、GSC、E-Cad或N-Cad。定形內(nèi)胚層由能夠朝向源自內(nèi)胚層胚層的組織中的一種或多種進(jìn)一步分化的 細(xì)胞在功能上限定。這可以包括肺、甲狀腺、肝、胰腺或腸。
[0117] "氣道上皮細(xì)胞"意思是組成襯在(line)大氣道(支氣管)和小氣道(細(xì)支氣管)內(nèi) 的一層細(xì)胞的上皮細(xì)胞。氣道上皮細(xì)胞包括有纖毛的、分泌的、基底的和柱狀的細(xì)胞類型。
[0118] "誘導(dǎo)多能干細(xì)胞"或"iPS細(xì)胞"意思是通過誘導(dǎo)特定基因的表達(dá),人工地(使用遺 傳或化學(xué)方法)源自非多能細(xì)胞一一通常是成人體細(xì)胞一一的一類多能干細(xì)胞。誘導(dǎo)多能 干細(xì)胞基本上類似于天然多能干細(xì)胞。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞能夠分化為多種細(xì)胞類型,其包括 但不限于定形內(nèi)胚層細(xì)胞、前前腸內(nèi)胚層細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞。
[0119] 術(shù)語"類器官"指的是模擬組織或器官的表面外觀或真實(shí)結(jié)構(gòu)或功能的一種或多 種細(xì)胞類型的三維聚集體。
[0120] 術(shù)語"誘導(dǎo)(induction)"或"誘導(dǎo)(induce)"與引起對(duì)細(xì)胞的表型發(fā)生具體作用的 過程或行為相關(guān)。這樣的作用可以是引起表型變化的形式,例如,分化至另一種細(xì)胞表型; 或可以是維持細(xì)胞處于特定細(xì)胞的形式,例如,阻止脫分化或促進(jìn)細(xì)胞的存活。
[0121]如本文使用的,術(shù)語"多能的"指的是維持允許分化為多種細(xì)胞類型的能力的未分 化細(xì)胞。
[0122]術(shù)語"前體細(xì)胞"、"組細(xì)胞"和"干細(xì)胞"在本領(lǐng)域中可交換地使用,并且如本文使 用的,指的是多能的或譜系-未定型的組細(xì)胞,其潛在地能夠不限數(shù)目地有絲分裂以更新其 自身或產(chǎn)生將分化為期望的細(xì)胞類型的子代細(xì)胞。與多能干細(xì)胞相比,譜系-定型的祖細(xì)胞 通常被認(rèn)為不能夠生成在表型上彼此不同的眾多細(xì)胞類型。相反,祖細(xì)胞生成一種或可能 兩種譜系一一定型的細(xì)胞類型。在一個(gè)實(shí)施方式中,干細(xì)胞是誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞。
[0123] "呼吸障礙"意思是身體上顯現(xiàn)在呼吸道中的疾病或病癥,包括但不限于囊性纖維 化、呼吸窘迫綜合征、急性呼吸窘迫綜合征、肺結(jié)核、咳嗽、支氣管哮喘、基于增加的氣道高 反應(yīng)性的咳嗽(支氣管炎、流感綜合征(flu syndrome)、哮喘、阻塞性肺病等)、流感綜合征、 止咳(anti-cough)、氣道高反應(yīng)性、結(jié)核病、哮喘(氣道炎性細(xì)胞浸潤、增加的氣道高應(yīng)答 性、支氣管收縮、粘液分泌過多等)、慢性阻塞性肺病、氣腫、肺纖維化、特發(fā)性肺纖維化、咳 嗽、可逆性氣道阻塞、成人呼吸疾病綜合征、鶴"愛好者"病(pigeon fancieV s disease)、 農(nóng)民肺、支氣管肺發(fā)育異常、氣道障礙、氣腫、變應(yīng)性支氣管肺曲霉病、過敏性支氣管炎支氣 管擴(kuò)張、職業(yè)性哮喘、反應(yīng)性氣道疾病綜合征(reactive airway disease syndrome)、間質(zhì) 性(inters i t ial)肺病、寄生性肺病等。
[0124] 在本公開內(nèi)容中,"包括(comprises) "、"包括(comprising) "、"包含 (containing)"和"具有(having)"等可以具有歸屬于它們?cè)诿绹鴮@ㄖ械暮x,并且可 以意為"包括(includes )"、"包括(including)" 等;"主要由......組成(consisting essentially of)"或"主要由......構(gòu)成(consists essentially)"同樣地具有歸屬于美 國專利法的含義,并且該術(shù)語是開放式的,其允許比敘述的多的特征的存在,只要敘述的特 征的基本特性或新穎特性沒有被比敘述的多的特征的存在改變,但是排除現(xiàn)有技術(shù)實(shí)施方 式。
[0125] "有效量"意思是相對(duì)于未治療的患者減少或改善呼吸障礙、病癥或疾病的臨床標(biāo) 記中的至少一種癥狀或變化所需的量。用于治療呼吸障礙、病癥或疾病的氣道上皮細(xì)胞的 有效量取決于具體的障礙、病癥或疾病的方式,障礙、病癥或疾病的程度,和細(xì)胞的施用,以 及對(duì)象的年齡、體重和一般健康變化。
[0126] "可擴(kuò)增性"在本文使用以指細(xì)胞增殖的能力,例如,在數(shù)目上擴(kuò)增,或在細(xì)胞群的 情況下經(jīng)歷群體倍增。
[0127] 如本文使用的,術(shù)語"表達(dá)"限定為由其啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的具體的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄 和/或翻譯。
[0128] 術(shù)語"分離的"、"純化的"或"生物學(xué)上純的"指的是如此物質(zhì),其以不同程度脫離 如在其天然狀態(tài)發(fā)現(xiàn)的正常伴隨其的組分。"分離"表示與原始來源或環(huán)境分開的程度。"純 化"表示高于分離的分開程度。"純化的"或"生物學(xué)上純的"蛋白質(zhì)充分地不含其它物質(zhì),以 便任何雜質(zhì)不實(shí)質(zhì)地影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)或引起其它不良后果。即,如果細(xì)胞基本上 不含細(xì)胞或物質(zhì),則其是純化的。通常使用分析技術(shù)測(cè)定純度和均一性,例如,流式細(xì)胞術(shù) 或流動(dòng)激活的(flow activated)細(xì)胞分選。術(shù)語"純化的"可以表示細(xì)胞大體上產(chǎn)生一個(gè)群 體。
[0129] 如本文使用的,"表型"指的是細(xì)胞的全部物理、生化和生理組成,例如,具有任意 一種性狀或任意性狀組。
[0130] "增殖"在本文使用以指類似的形式一一尤其是細(xì)胞一一的繁殖或增加。即,增殖 包含產(chǎn)生更大數(shù)目的細(xì)胞,并且可以通過一一除了其它以外一一簡單地計(jì)數(shù)細(xì)胞的數(shù)目、 測(cè)量并入細(xì)胞的3H-胸苷等測(cè)量。
[0131] 如本文使用的,"樣品"或"生物樣品"指的是任何事物,其可以包含對(duì)篩選方法或 治療期望的感興趣的細(xì)胞(例如,其癌細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞)。樣品可以是生物樣品,比如生物流 體或生物組織。在一個(gè)實(shí)施方式中,生物樣品是包含肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的組織樣品。這樣的樣 品可以包括各種各樣的細(xì)胞、蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)。生物組織的實(shí)例還包括器官、腫瘤、淋巴 結(jié)、動(dòng)脈和個(gè)體細(xì)胞(一種或多種)。生物流體的實(shí)例包括尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、 糞便、痰、腦脊液、眼淚、粘液、羊水等。
[0132] 如其中使用的,"對(duì)象"或"患者"可以是人或非人哺乳動(dòng)物。非人哺乳動(dòng)物包括例 如牲畜和寵物,比如羊科、???、豬科、犬科、貓科和鼠科哺乳動(dòng)物。優(yōu)選地,對(duì)象是人。
[0133] 如本文使用的,術(shù)語"治療(treat)"、"治療(treating)"、"治療(treatment)"等指 的是減少或改善呼吸障礙、病癥或疾病和/或與其相關(guān)聯(lián)的一種或多種癥狀。將領(lǐng)會(huì),雖然 未排除,但是治療呼吸障礙、病癥或疾病不需要該障礙、病癥、疾病或與其相關(guān)聯(lián)的癥狀被 完全地緩和或消除。
[0134] 本文提供的范圍理解為是該范圍內(nèi)的全部值的簡寫。例如,1至50的范圍理解為包 括選自 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50的任 何數(shù)字、數(shù)字組合或子范圍。
[0135] 本文敘述的變量或方面的實(shí)施方式包括作為任何單一實(shí)施方式的實(shí)施方式或與 任何其它實(shí)施方式或其部分組合的實(shí)施方式。
[0136] 本文提供的任何組合物或方法可以與本文提供的任何其它組合物和方法中的一 種或多種組合。
[0137] 氣道上皮細(xì)胞
[0138] 供體肺的可替代來源的發(fā)展將改變肺病治療的范例。治療末期肺病的一個(gè)選項(xiàng)是 移植由患者特異性細(xì)胞制成的工程化肺。iPS細(xì)胞源氣道上皮細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)不僅促進(jìn)了基礎(chǔ) 肺病理學(xué)的研究,而且促進(jìn)了研發(fā)用于治療肺病一一包括CF-一的新型療法。如本文所述 的源自iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞為基于細(xì)胞的治療應(yīng)用和患病的肺上皮的潛在替換提供了 獨(dú)特的機(jī)會(huì)。
[0139] 在一個(gè)方面,源自誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞包括在本發(fā)明中。氣道上 皮細(xì)胞的特征在于表達(dá)氣道細(xì)胞表面標(biāo)記,比如克拉拉細(xì)胞分泌蛋白(CCSP)、細(xì)胞角蛋白5 (KRT5)和F0XJ1。氣道上皮細(xì)胞還具有在培養(yǎng)中增殖而不喪失氣道細(xì)胞表面標(biāo)記的能力。氣 道上皮細(xì)胞包括有纖毛的、分泌的、基底的和柱狀的細(xì)胞類型。在一個(gè)實(shí)施方式中,氣道上 皮細(xì)胞是有纖毛的。
[0140] 源自iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞還表達(dá)大量氣道特異性細(xì)胞表面標(biāo)記。氣道細(xì)胞表 面標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于粘蛋白1或MUC1、粘蛋白5AC、FOX J1、CCSP、KRT5、KRT14、TRP63、 SOX17、SOX2、0-微管蛋白 IV或CFTR。
[0141] 粘蛋白1或MUC1是粘蛋白家族的成員,并且是膜結(jié)合的糖基化磷蛋白。該蛋白質(zhì)通 過跨膜結(jié)構(gòu)域錨定至許多上皮的頂端表面。示例性粘蛋白1序列包括在GenBank登錄號(hào)NM_ 001018016或NP_001018016處發(fā)現(xiàn)的人MUC1序列或其片段,和在NM_013605或NP_038633處 發(fā)現(xiàn)的小鼠 Mucl序列或其片段。
[0142 ]粘蛋白5AC是在胃和呼吸道上皮中發(fā)現(xiàn)的糖蛋白。示例性粘蛋白5AC序列包括在 GenBank登錄號(hào)XM_003403450或P98088處發(fā)現(xiàn)的人MUC5AC序列或其片段。
[0143] 叉頭框(forkhead box)Jl(FOXJl)是參與纖毛形成的轉(zhuǎn)錄因子。示例性F0XJ1序列 包括在GenBank登錄號(hào)NM_001454或NP_001445處發(fā)現(xiàn)的人F0XJ1序列或其片段,和在NM_ 008240或NP_032266處發(fā)現(xiàn)的小鼠 Foxjl序列或其片段。
[0144] 克拉拉細(xì)胞分泌蛋白(CCSP)是免疫調(diào)節(jié)劑和抗炎劑。示例性CCSP序列包括在 GenBank登錄號(hào)NM_003357或NP_003348處發(fā)現(xiàn)的人CCSP序列或其片段,和在NM_011681或 NP_035811處發(fā)現(xiàn)的小鼠 CCSP序列或其片段。
[0145] 角蛋白5(KRT5)屬于形成角質(zhì)形成細(xì)胞的結(jié)構(gòu)框架的一組堅(jiān)韌的纖維狀蛋白質(zhì)。 示例性KRT5序列包括在GenBank登錄號(hào)NM_000424或NP_000415處發(fā)現(xiàn)的人KRT5序列或其片 段,和在NM_027011或NP_081287處發(fā)現(xiàn)的小鼠 KRT5序列或其片段。
[0146] 角蛋白14(KRT14)是中間絲蛋白的I型角蛋白家族的成員。示例性KRT14序列包括 在GenBank登錄號(hào)NM_000526或NP_000517處發(fā)現(xiàn)的人KRT14序列或其片段,和在NM_016958 或NP_058654處發(fā)現(xiàn)的小鼠 KRT14序列或其片段。
[0147] 轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白63(TRP63或P63)是參與細(xì)胞對(duì)壓力和發(fā)育的應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子的p53 家族的成員。示例性TRP63序列包括在GenBank登錄號(hào)NM_001114978或NP_001108450處發(fā)現(xiàn) 的人TRP63序列或其片段,和在NM_001127259或NP_001120731處發(fā)現(xiàn)的小鼠 TRP63序列或其 片段。
[0148] 性別決定區(qū)Y框17(S0X17)是結(jié)合目標(biāo)啟動(dòng)子DNA并在胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵 作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子。示例性S0X17序列包括在GenBank登錄號(hào)NM_022454或NP_071899處發(fā)現(xiàn) 的人S0X17序列或其片段。
[0149] 性別決定區(qū)Y框2(S0X2)是對(duì)維持未分化的胚胎干細(xì)胞的自我更新或多能性必需 的轉(zhuǎn)錄因子。示例性CFTR序列包括在GenBank登錄號(hào)NM_003106或NP_003097處發(fā)現(xiàn)的人 CFTR序列或其片段,和在NM_011443或NP_035573處發(fā)現(xiàn)的小鼠 CFTR序列或其片段。
[0150] β-微管蛋白IV是球狀蛋白質(zhì)的小家族的數(shù)個(gè)成員中的一個(gè)。β-微管蛋白IV以纖毛 細(xì)胞類型存在,并且對(duì)哺乳動(dòng)物中的軸絲(axonemal)結(jié)構(gòu)可能是需要的。
[0151] 如本文別處描述的,CFTR是參與輸送氯離子穿過細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)。示例性CFTR序 列包括在GenBank登錄號(hào)NM_000492或NP_000483處發(fā)現(xiàn)的人CFTR序列或其片段,和在NM_ 021050或NP_066388處發(fā)現(xiàn)的小鼠 CFTR序列或其片段。
[0152] 在一個(gè)實(shí)施方式中,源自iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞包括表達(dá)氣道細(xì)胞表面標(biāo)記 CFTR。在另一個(gè)實(shí)施方式中,氣道細(xì)胞表面標(biāo)記包括β-微管蛋白IV、粘蛋白-5AC和P63。氣道 細(xì)胞表面標(biāo)記在氣道上皮細(xì)胞中的表達(dá)比得上在新鮮分離的人氣道細(xì)胞上表達(dá)的水平。
[0153] 與分離的氣道細(xì)胞不同,源自iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞能夠增殖數(shù)代而不喪失氣 道上皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記,比如CCSP、P63、F0XJ1、CFTR和MUC5AC。細(xì)胞的增殖能力可以出于不同 的目的用于生成數(shù)百萬細(xì)胞。當(dāng)使用自體iPS細(xì)胞源細(xì)胞轉(zhuǎn)換這些技術(shù)用于產(chǎn)生組織工程 化人肺組織時(shí),"放大(scale up)"先祖群體的能力是特別有價(jià)值的。在一個(gè)實(shí)施方式中,氣 道上皮細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中增殖至少大約30天。在另一個(gè)實(shí)施方式中,氣道上皮細(xì)胞能夠在 培養(yǎng)中增殖大于大約30天。
[0154] 分化為氣道上皮細(xì)胞
[0155] 在一個(gè)方面,本發(fā)明進(jìn)一步提供將誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞分化為氣道上皮細(xì)胞的 方法。方法包括在缺乏血清的情況下培養(yǎng)iPS細(xì)胞以誘導(dǎo)分化為定形內(nèi)胚層(DE)細(xì)胞,在存 在血清的情況下培養(yǎng)DE細(xì)胞以誘導(dǎo)分化為前前腸內(nèi)胚層(AFE)細(xì)胞,并且在存在血清的情 況下在細(xì)胞因子混合物和高濃度的視黃酸中培養(yǎng)AFE細(xì)胞以誘導(dǎo)AFE細(xì)胞分化為氣道上皮 細(xì)胞。
[0156] iPS 細(xì)胞
[0157] 可以使用與來自 2006(Yamanaka等,Cell Stem Cell 1:39-49(2007))的原始描述 的方法基本類似的方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的修改得到可以與本發(fā)明一起使用的iPS細(xì) 胞。例如,可以通過修改將基因插入宿主細(xì)胞DNA的方法產(chǎn)生iPS細(xì)胞。參見,例如,Wernig 等,PNAS,105:5856-5861(2008) ;Jaenisch等,Cell 132:567-582(2008) ;Hanna等,Cell 133:250-264(2008);和Brambrink等,Cell Stem Cell 2:151-159(2008)。這些參考文獻(xiàn)通 過引用以其全部并入,以便教導(dǎo)iPS細(xì)胞和產(chǎn)生它們的方法。
[0158] 由于iPS細(xì)胞源自已經(jīng)被重編程為多能干細(xì)胞的體細(xì)胞,因此多種細(xì)胞類型可以 用于生成iPS細(xì)胞。例如,用來自患有呼吸障礙--比如囊性纖維化--的對(duì)象的自體細(xì)胞 治療將緩解或阻止細(xì)胞的免疫排斥。因此,從將接受用源自它們的iPS細(xì)胞的分化細(xì)胞治療 的對(duì)象生成iPS細(xì)胞是有用的。在一個(gè)實(shí)施方式中,氣道上皮細(xì)胞源自患病的細(xì)胞,比如囊 性纖維化人iPS細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方式中,氣道上皮細(xì)胞源自與患有呼吸障礙的對(duì)象自體 的細(xì)胞。
[0159] 將iPS細(xì)胞分化為氣道上皮細(xì)胞的方法包括培養(yǎng)iPS細(xì)胞以誘導(dǎo)分化為DE細(xì)胞。在 一個(gè)實(shí)施方式中,iPS細(xì)胞在缺乏血清的情況下培養(yǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中,iPS細(xì)胞在存在 無血清補(bǔ)充物的情況下培養(yǎng)。無血清補(bǔ)充物的實(shí)例包括但不限于血清替代品(Sigma, St.Louis,M0)、B_27(Life Technologies,Car1sbad,CA)、BI0GR0_2(BI,Israel)、 Knock0ut?(Life Technologies,Carlsbad,CA)、PluriQ(GlobalStem,Rockvilie,MD)、 TCH?(MP,Santa Ana,CA)和其它類似的補(bǔ)充物。
[0160] 在一個(gè)實(shí)施方式中,iPS細(xì)胞可以在存在誘導(dǎo)分化至定形內(nèi)胚層細(xì)胞的試劑、分子 或化合物的情況下培養(yǎng),其包括但不限于激活素 A、nodal蛋白、激活素 A的激動(dòng)劑、抑制素的 拮抗劑或其任意組合。例如,細(xì)胞可以用激活激活素 A受體的試劑、分子或化合物培養(yǎng),比如 激活素 A或激活素 A受體激動(dòng)劑。在另一個(gè)實(shí)例中,細(xì)胞可以用以與激活素 A類似的方式提供 激活信號(hào)或刺激細(xì)胞的試劑、分子或化合物一一比如nodal蛋白一一培養(yǎng),導(dǎo)致iPS細(xì)胞分 化為定形內(nèi)胚層細(xì)胞。在又另一個(gè)實(shí)施例中,細(xì)胞可以用試劑、分子或化合物,比如激活素 A 抑制劑的拮抗劑,例如,抑制素的抑制劑,或其它拮抗分子培養(yǎng),所述其它拮抗分子可以間 接地激活激活素 A受體或誘導(dǎo)分化至定形內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0161] 誘導(dǎo)iPS細(xì)胞分化至定形內(nèi)胚層細(xì)胞的一種或多種試劑、分子或化合物一一比如 激活素 A--的濃度可以在大約5ng/ml至大約500ng/ml的范圍內(nèi)。一種或多種試劑、分子或 化合物--比如激活素 A--的濃度可以是大約5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、55ng/ml、60ng/ml、65ng/ml、70ng/ml、 75ng/ml、80ng/ml、85ng/ml、90ng/ml、95ng/ml、lOOng/ml、llOng/ml、120ng/ml、130ng/ml、 140ng/ml、150ng/ml、175ng/ml、200ng/ml、225ng/ml、250ng/ml、275ng/ml、300ng/ml、 350ng/ml、400ng/ml、450ng/ml、550ng/ml或其間的任何濃度。在一個(gè)實(shí)施方式中,iPS細(xì)胞 在存在lOOng/ml的一種或多種試劑、分子或化合物一一比如激活素 A-一的情況下培養(yǎng),以 誘導(dǎo)iPS細(xì)胞分化至定形內(nèi)胚層細(xì)胞。誘導(dǎo)分化至定形內(nèi)胚層細(xì)胞的試劑、分子或化合 物一一比如激活素 A-一的濃度還可以在iPS細(xì)胞培養(yǎng)中處于大約飽和濃度。激活素 A的飽 和濃度是大約5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、 45ng/ml、50ng/ml、55ng/ml、60ng/ml、65ng/ml、70ng/ml、75ng/ml、80ng/ml、85ng/ml、90ng/ ml、95ng/ml、lOOng/ml、1lOng/ml、120ng/ml、130ng/ml、140ng/ml、150ng/ml、175ng/ml、 200ng/ml、225ng/ml、250ng/ml、275ng/ml、300ng/ml、350ng/ml、400ng/ml、450ng/ml、 550ng/ml或更大。在另一個(gè)實(shí)施方式中,誘導(dǎo)分化至定形內(nèi)胚層細(xì)胞的試劑、分子或化合 物一一比如激活素 A-一的濃度在iPS細(xì)胞培養(yǎng)中處于大約飽和濃度。
[0162] iPS細(xì)胞可以培養(yǎng)至少大約12小時(shí)、16小時(shí)、20小時(shí)、24小時(shí)、30小時(shí)、36小時(shí)、48小 時(shí)、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或更久。在一個(gè)實(shí)施方式中,iPS細(xì)胞培養(yǎng)大約5天。在一 個(gè)實(shí)施方式中,iPS細(xì)胞培養(yǎng)大約5天。iPS細(xì)胞可以在存在激活素 A的情況下培養(yǎng)至少大約6 小時(shí)。iPS細(xì)胞可以培養(yǎng)至少大約12小時(shí)、16小時(shí)、20小時(shí)、24小時(shí)、30小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)、 3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或更久。在另一個(gè)實(shí)施方式中,iPS細(xì)胞在存在激活素 A的情 況下培養(yǎng)至少大約5天。
[0163] 可以使用擬胚體(embroid body)方法或直接在飼養(yǎng)層或基質(zhì)膠上發(fā)生iPS細(xì)胞至 定形內(nèi)胚層期的分化。
[0164] 定形內(nèi)胚層細(xì)胞
[0165] 自iPS細(xì)胞分化的DE細(xì)胞表達(dá)大量定形內(nèi)胚層細(xì)胞標(biāo)記。定形內(nèi)胚層細(xì)胞標(biāo)記的 實(shí)例包括但不限于c-kit、S0X17、F0XA2和CXCR4。
[0166] CD117或c-kit是在人中由KIT基因編碼的蛋白質(zhì)。示例性c-kit序列包括在 GenBank登錄號(hào)NM_000222或NP_000213處發(fā)現(xiàn)的人c-kit序列或其片段,和在NM_001122733 或NP_001116205處發(fā)現(xiàn)的小鼠 c-kit序列或其片段。
[0167] CXCR4是對(duì)基質(zhì)衍生因子-1特異性的α-趨化因子受體。示例性CXCR4序列包括在 GenBank登錄號(hào)ΝΜ_001008540或ΝΜ_001008540處發(fā)現(xiàn)的人CXCR4序列或其片段,和在ΝΜ_ 009911或ΝΡ_034041處發(fā)現(xiàn)的小鼠 CXCR4序列或其片段。
[0168] 在一個(gè)實(shí)施方式中,自iPS細(xì)胞分化的DE細(xì)胞包括表達(dá)內(nèi)胚層細(xì)胞表面標(biāo)記(3_ 1^扒50父17、卩(^厶2和〇父〇?4。
[0169] 將iPS細(xì)胞分化為氣道上皮細(xì)胞的方法還包括在存在血清的情況下培養(yǎng)DE細(xì)胞以 誘導(dǎo)分化為前前腸內(nèi)胚層(AFE)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中,DE細(xì)胞在存在血清的情況下培 養(yǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中,DE細(xì)胞在存在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)分子的情況下培養(yǎng)。ECM分子的實(shí) 例包括但不限于膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、生腱蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚 糖、多糖、纖維素、在ECM中發(fā)現(xiàn)的其它分子、和其任意組合。
[0170] DE細(xì)胞可以在存在ECM分子的情況下培養(yǎng)之前解離。培養(yǎng)基還可以從DE細(xì)胞誘導(dǎo) 培養(yǎng)基改變?yōu)锳FE細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方式中,iPS細(xì)胞在存在血清的情況下培養(yǎng)。 [0171] DE細(xì)胞順序地暴露于小分子抑制劑以抑制后內(nèi)胚層命運(yùn)并誘導(dǎo)近端內(nèi)胚層命運(yùn)。 DE細(xì)胞還可以在存在ECM分子的情況下培養(yǎng),同時(shí)將DE細(xì)胞順序地暴露于抑制BMP/TGF信號(hào) 傳導(dǎo)的小分子抑制劑和抑制TGF/WNT信號(hào)傳導(dǎo)的小分子抑制劑。抑制BMP/TGF信號(hào)傳導(dǎo)的小 分子抑制劑可以包括但不限于 dorsomorphin、Noggin、A83-01、DMH-l、D4476、GW788388、 1^364947、1^口5(?、58431542、58505124、58525334、50208、和其任意組合。抑制了6?/^1'信號(hào) 傳導(dǎo)的小分子抑制劑可以包括但不限于IWR-l、Noggin、CCT036477、IWP2、去甲氧基姜黃素、 FH535 A83-01、D4476、GW788388、LY364947、ItepSox、SB431542、SB505124、SB525334、SD208、 和其任意組合。在另一個(gè)實(shí)施方式中,DE細(xì)胞被順序地暴露于小分子抑制劑以抑制后內(nèi)胚 層命運(yùn)并誘導(dǎo)近端內(nèi)胚層命運(yùn)。在具體的實(shí)施方式中,小分子抑制劑抑制BMP/TGF信號(hào)傳 導(dǎo),比如dorsomorphin、Noggin、A83-01、DMH-l、D4476、GW788388、LY364947、RepSox、 38431542、38505124、38525334、30208、和其任意組合。在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中,小分子 抑制劑抑制TGF/WNT信號(hào)傳導(dǎo),比如IWR-l、Noggin、CCT036477、IWP2、去甲氧基姜黃素、 FH535 A83-01、D4476、GW788388、LY364947、ItepSox、SB431542、SB505124、SB525334、SD208、 和其任意組合。在另一個(gè)實(shí)施方式中,DE細(xì)胞首先暴露于抑制BMP/TGF信號(hào)傳導(dǎo)的小分子抑 制劑,然后暴露于抑制TGF/WNT信號(hào)傳導(dǎo)的小分子抑制劑。
[0172] DE細(xì)胞可以在存在抑制BMP/TGF信號(hào)傳導(dǎo)的小分子抑制劑的情況下培養(yǎng)至少大約 6小時(shí)。DE細(xì)胞可以用抑制BMP/TGF信號(hào)傳導(dǎo)的小分子抑制劑培養(yǎng)至少大約12小時(shí)、16小時(shí)、 20小時(shí)、24小時(shí)、30小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更久。在 一個(gè)實(shí)施方式中,DE細(xì)胞用抑制BMP/TGF信號(hào)傳導(dǎo)的小分子抑制劑培養(yǎng)大約2天至大約10天 的范圍。在一個(gè)實(shí)施方式中,DE細(xì)胞用抑制BMP/TGF信號(hào)傳導(dǎo)的小分子抑制劑培養(yǎng)大約2天 至大約7天的范圍。
[0173] DE細(xì)胞可以在存在抑制TGF/WNT信號(hào)傳導(dǎo)的小分子抑制劑的情況下培養(yǎng)至少大約 6小時(shí)。DE細(xì)胞可以用抑制TGF/WNT信號(hào)傳導(dǎo)的小分子抑制劑培養(yǎng)至少大約12小時(shí)、16小時(shí)、 20小時(shí)、24小時(shí)、30小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更久。在 一個(gè)實(shí)施方式中,DE細(xì)胞用抑制TGF/WNT信號(hào)傳導(dǎo)的小分子抑制劑培養(yǎng)大約2天至大約10天 的范圍。在一個(gè)實(shí)施方式中,DE細(xì)胞用抑制TGF/WNT信號(hào)傳導(dǎo)的小分子抑制劑培養(yǎng)大約2天 至大約7天的范圍。
[0174]前前腸內(nèi)胚層細(xì)胞
[0175]自DE細(xì)胞分化的AFE細(xì)胞表達(dá)大量前前腸內(nèi)胚層細(xì)胞標(biāo)記。前前腸內(nèi)胚層細(xì)胞標(biāo) 記的實(shí)例包括但不限于NKX2.1。
[0176] NKX2.1是在人中由NKX2-1基因編碼的蛋白質(zhì)。示例性NKX2.1序列包括在GenBank 登錄號(hào)NM_001079668或NP_001073136處發(fā)現(xiàn)的人NKX2.1序列或其片段,和在NM_001146198 或NP_001139670處發(fā)現(xiàn)的小鼠 NKX2.1序列或其片段。在一個(gè)實(shí)施方式中,AFE細(xì)胞表達(dá) NKX2·1〇
[0177] 將iPS細(xì)胞分化為氣道上皮細(xì)胞的方法還包括培養(yǎng)AFE細(xì)胞以誘導(dǎo)AFE細(xì)胞分化為 氣道上皮細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方式中,AFE細(xì)胞在存在血清的情況下培養(yǎng)。在另一個(gè)實(shí)施方式 中,AFE細(xì)胞在存在高濃度的視黃酸的情況下培養(yǎng)。在又另一個(gè)實(shí)施方式中,AFE細(xì)胞在存在 細(xì)胞因子混合物的情況下培養(yǎng)。在具體的實(shí)施方式中,細(xì)胞因子混合物抑制WNT途徑。抑制 WNT途徑的細(xì)胞因子的實(shí)例包括但不限于IWR-1、PD980 59、BMP4、BMP7、和其它WNT拮抗劑、和 其任意組合。
[0178] AFE細(xì)胞在存在高濃度的視黃酸的情況下培養(yǎng)以誘導(dǎo)分化。高濃度的視黃酸可以 在大約0. ΙμΜ至大約2.ΟμΜ的范圍內(nèi)。高濃度的視黃酸可以是大約0.1μΜ、0.2μΜ、0.3μΜ、0.4μ Μ、0·5μΜ、0·6μΜ、0·7μΜ、0·8μΜ、0·9、1·0μΜ、1·1μΜ、1·2μΜ、1·3μΜ、1·4μΜ、1·5μΜ、1·6μΜ、1·7μ M、1.8μΜ、1.9μΜ、2 . ΟμΜ、和其間的任何濃度。
[0179] AFE細(xì)胞可以在存在高濃度的視黃酸的情況下培養(yǎng)至少大約6小時(shí)。AFE細(xì)胞可以 在高濃度的視黃酸中培養(yǎng)至少大約12小時(shí)、16小時(shí)、20小時(shí)、24小時(shí)、30小時(shí)、36小時(shí)、48小 時(shí)、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更久。在另一個(gè)實(shí)施方式中,AFE細(xì)胞在高濃度 的視黃酸中培養(yǎng)至少大約3天。在一個(gè)實(shí)施方式中,AFE細(xì)胞用高濃度的視黃酸培養(yǎng)大約2天 至大約10天的范圍。在一個(gè)實(shí)施方式中,AFE細(xì)胞用高濃度的視黃酸培養(yǎng)大約2天至大約7天 的范圍。
[0180] 肺組織工程化
[0181] 本發(fā)明還提供工程化三維肺組織和制造三維肺組織的方法。在一個(gè)方面,描述了 工程化三維肺組織。工程化肺包括氣道上皮細(xì)胞。氣道上皮細(xì)胞表達(dá)氣道細(xì)胞表面標(biāo)記,比 如克拉拉細(xì)胞分泌蛋白(CCSP)、細(xì)胞角蛋白5(KRT5)和F0XJ1;并且能夠在培養(yǎng)中增殖而不 喪失氣道細(xì)胞標(biāo)記。因而,本發(fā)明提供供體肺組織的可替代來源以用工程化肺治療末期疾 病。
[0182] 在另一個(gè)方面,描述了工程化三維肺組織的方法。方法包括將誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì) 胞群分化為氣道上皮細(xì)胞,其中氣道上皮細(xì)胞表達(dá)氣道細(xì)胞表面標(biāo)記:克拉拉細(xì)胞分泌蛋 白(CCSP)、細(xì)胞角蛋白5(KRT5)和F0XJ1;并且能夠在培養(yǎng)中增殖而不喪失氣道細(xì)胞標(biāo)記。方 法還包括將氣道上皮細(xì)胞接種至三維支架上,比如包含基質(zhì)膠的支架。將氣道上皮細(xì)胞接 種至三維支架上允許氣道上皮細(xì)胞形成類器官結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域中已知的支架對(duì)本發(fā)明是有用 的。支架可以包括但不限于去細(xì)胞組織、和合成的/天然的聚合物支架或合成的與天然的聚 合物支架的組合。在一個(gè)實(shí)施方式中,三維支架包括基質(zhì)膠。支架生產(chǎn)的方法可以包括在美 國專利號(hào):2013/0013083和2012/0064050中描述的那些,其通過引用以其全部并入。
[0183] 治療方法
[0184] 源自iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞和包含這樣的細(xì)胞的工程化肺組織具有在體內(nèi)治療 對(duì)象的用途。本發(fā)明包括用于治療對(duì)象中的呼吸障礙的方法。如本文所述,在一個(gè)方面,方 法包括改善、治療或減輕需要其的對(duì)象中的呼吸障礙的癥狀。方法還包括將誘導(dǎo)多能干 (iPS)細(xì)胞分化為氣道上皮細(xì)胞,其中氣道上皮細(xì)胞表達(dá)氣道細(xì)胞表面標(biāo)記--克拉拉細(xì) 胞分泌蛋白(CCSP)、細(xì)胞角蛋白5(KRT5)和F0XJ1,并且能夠在培養(yǎng)中增殖而不丟失氣道細(xì) 胞標(biāo)記一一和以對(duì)治療對(duì)象中的呼吸障礙有效的量施用氣道上皮細(xì)胞。
[0185] 治療對(duì)象的方法可以進(jìn)一步包括施用源自iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞或移植包括源 自iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞的工程化組織,其中施用和移植導(dǎo)致對(duì)象中的呼吸障礙的癥狀 的改善、治療或減輕。改善、治療或減輕可以是可以使用自然意識(shí)或人造裝置檢測(cè)的呼吸障 礙或呼吸障礙的癥狀的任何改變。
[0186] 可以使用本發(fā)明的方法治療的呼吸障礙是身體上顯現(xiàn)在呼吸道中的疾病或病癥, 其包括但不限于囊性纖維化、呼吸窘迫綜合征、急性呼吸窘迫綜合征、肺結(jié)核、咳嗽、支氣管 哮喘、基于增加的氣道高反應(yīng)性的咳嗽(支氣管炎、流感綜合征、哮喘、阻塞性肺病等)、流感 綜合征、止咳、氣道高反應(yīng)性、結(jié)核病、哮喘(氣道炎性細(xì)胞浸潤、增加的氣道高應(yīng)答性、支氣 管收縮、粘液分泌過多等)、慢性阻塞性肺病、氣腫、肺纖維化、特發(fā)性肺纖維化、咳嗽、可逆 性氣道阻塞、成人呼吸疾病綜合征、鴿"愛好者"病、農(nóng)民肺、支氣管肺發(fā)育異常、氣道障礙、 氣腫、變應(yīng)性支氣管肺曲霉病、過敏性支氣管炎支氣管擴(kuò)張、職業(yè)性哮喘、反應(yīng)性氣道疾病 綜合征、間質(zhì)性肺病、寄生性肺病等。在一個(gè)實(shí)施方式中,呼吸障礙是囊性纖維化。
[0187] 有利地,本發(fā)明的組合物和方法表現(xiàn)出相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)方法的改進(jìn)。優(yōu)選地,用于 治療呼吸障礙的組合物包括源自iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞,如本文別處描述的。
[0188] 本發(fā)明還包含使用本發(fā)明的藥物制劑以實(shí)踐本發(fā)明的方法。這樣的藥物制劑可以 以適合于施用至對(duì)象的形式提供,并且可以包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、一種或 多種額外的成分、或這些的一些組合。
[0189] 在本發(fā)明的方法中有用的藥物制劑可以適當(dāng)?shù)乇婚_發(fā)用于吸入、口服、腸胃外、肺 部、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)施用或另外的施用途徑。其它預(yù)期的制劑包括投射(projected)納米顆粒、 脂質(zhì)體制劑和基于免疫的制劑(immunologically-based formulation)。施用途徑(一種或 多種)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的,并且將取決于任意數(shù)目的因素,包括正在治療的 疾病的類型和嚴(yán)重性、正在治療的獸患者或人患者的類型和年齡等。
[0190] 本文描述的藥物制劑可以通過藥理學(xué)領(lǐng)域中已知的或今后開發(fā)的任何方法制備。 一般而言,這樣的制備方法包括以下步驟:使細(xì)胞與載體或一種或多種其它助劑結(jié)合,然 后,如果必要或期望的話,將產(chǎn)物成形或包裝為期望的單劑量單位或多劑量單位。
[0191] 在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的細(xì)胞使用一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體 配制。在一個(gè)實(shí)施方式中,本發(fā)明的細(xì)胞的藥物制劑包括治療有效量的本發(fā)明的細(xì)胞和藥 學(xué)上可接受的載體。有用的藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于甘油、水、鹽水、乙醇和其它 藥學(xué)上可接受的鹽溶液比如磷酸鹽和有機(jī)酸鹽。這些和其它藥學(xué)上可接受的載體的實(shí)例在 Remington's Pharmaceutical Sciences( 1991,Mack Publication Co·,New Jersey)中描 述。
[0192] 施用/給藥
[0193] 在臨床環(huán)境中,細(xì)胞的遞送系統(tǒng)可以通過任何大量方法引入患者,其中的每種在 本領(lǐng)域中是常見的。例如,細(xì)胞的藥物制劑可以通過吸入或全身性例如通過靜脈注射施用。
[0194] 在一個(gè)示例性實(shí)施中,細(xì)胞的藥物制劑可以通過注射入肺組織直接地施用。美國 序列號(hào)10/914,829描述了直接注射的方案。
[0195] 施用方案可以影響什么構(gòu)成了有效量。治療制劑可以在顯現(xiàn)與疾病或病癥相關(guān)聯(lián) 的癥狀之前或之后施用至患者。進(jìn)一步,數(shù)個(gè)分開的劑量,以及交錯(cuò)的劑量可以每日施用或 順序地施用,或該劑量可以被連續(xù)地輸注,或可以是快速濃注。進(jìn)一步,治療制劑的劑量可 以成比例地增加或減少,如由治療或預(yù)防狀況的緊急度指示的。
[0196] 施用本發(fā)明的細(xì)胞至對(duì)象,優(yōu)選地哺乳動(dòng)物,更優(yōu)選地人,可以使用已知的程序以 對(duì)治療患者中的疾病或病癥有效的劑量和時(shí)段實(shí)施。實(shí)現(xiàn)治療效果所必需的細(xì)胞的有效量 可以根據(jù)以下因素變化:比如施用的細(xì)胞的植入程度;施用時(shí)間;施用持續(xù)時(shí)間;與細(xì)胞結(jié) 合使用的其它藥物、化合物或物質(zhì);疾病或障礙的狀態(tài);正在治療的對(duì)象的年齡、性別、重 量、狀況、一般健康和先前病史;和在醫(yī)療領(lǐng)域中熟知的類似因素??梢哉{(diào)整給藥方案以提 供最佳的治療應(yīng)答。例如,數(shù)個(gè)分開的劑量可以每日施用或該劑量可以成比例地減少,如由 治療狀況的緊急度指示的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠研究相關(guān)的因素并關(guān)于細(xì)胞的有效量做 出決定,而不需要過度的實(shí)驗(yàn)。
[0197] 本發(fā)明的藥物制劑中的細(xì)胞的實(shí)際劑量水平可以變化,以便獲得對(duì)實(shí)現(xiàn)具體的對(duì) 象、組合物和施用模式的期望的治療應(yīng)答有效的細(xì)胞的量,而對(duì)患者是無毒的。
[0198] 施用途徑
[0199] 本發(fā)明的細(xì)胞的施用途徑包括吸入、口服、鼻部、直腸、腸胃外、舌下、經(jīng)皮、經(jīng)粘膜 (例如,舌下、舌部、(經(jīng))口、(經(jīng))尿道、陰道(例如,經(jīng)陰道的和陰道周圍的)、鼻(內(nèi))和(經(jīng)) 直腸)、膀胱內(nèi)、肺內(nèi)、十二指腸內(nèi)、胃內(nèi)、鞘內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、支氣 管內(nèi)、吸入和局部施用。
[0200] 合適的細(xì)胞制劑和劑型包括,例如,分散體、懸浮液、溶液、珠劑(bead)、片劑、乳 劑、霜?jiǎng)?、糊劑、膏藥、洗液、圓片(disc)、栓劑、用于鼻部或口服施用的液體噴霧、用于吸入 的霧化制劑、用于膀胱內(nèi)施用的組合物和制劑等。
[0201] 應(yīng)當(dāng)理解,將用于本發(fā)明的制劑和組合物不限于在實(shí)施例中陳述的具體的制劑。 提出下列實(shí)施例以便向本領(lǐng)域技術(shù)人員提供完整的公開內(nèi)容和如何制造和使用本發(fā)明的 細(xì)胞、分化方法、工程化組織和治療方法的描述,并且不意欲限制本發(fā)明人所視為其發(fā)明的 范圍。
[0202] 除非另外指示,本發(fā)明的實(shí)踐采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生 物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù),其恰好在本領(lǐng)域技術(shù)人員的視界內(nèi)。這樣的技術(shù)在文 獻(xiàn)中充分地說明,比如,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual",第四版(Sambrook, 2012);"Oligonucleotide Synthesis"(Gait,1984);"Culture of Animal Cells" (Freshney,2010);"Methods in Enzymology""Handbook of Experimental Immunology" (Weir,1997);"Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"(Miller和Calos,1987); "Short Protocols in Molecular Biology"(Ausubel,2002);"Polymerase Chain Reaction principles Applications and Troubleshooting",(Babar,2011);"Current Protocols in Immunology"(Coligan,2002)。這些技術(shù)適用于生產(chǎn)本發(fā)明的多核苷酸和多 肽,并且因此,可以考慮制造和實(shí)踐本發(fā)明。將在下列部分中討論具體的實(shí)施方式的特別有 用的技術(shù)。 實(shí)施例
[0203] 通過參考下列實(shí)驗(yàn)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。除非另外規(guī)定,這些實(shí)施例 僅出于說明的目的提供,并且不意欲是限制性的。因而,本發(fā)明絕不應(yīng)當(dāng)解釋為限制于下列 實(shí)施例,而是應(yīng)當(dāng)解釋為包含由于本文提供的教導(dǎo)變得明顯的任何和全部變化。
[0204]不需要進(jìn)一步的描述,認(rèn)為本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用在前的描述和下列說明性實(shí) 施例,制造和利用本發(fā)明的化合物并且實(shí)踐要求保護(hù)的方法。因此,下列操作實(shí)施例具體地 指出本發(fā)明的實(shí)施方式,并且不以任何方式解釋為限制性的。
[0205] 現(xiàn)在描述在進(jìn)行本文公開的實(shí)驗(yàn)中使用的材料和方法。
[0206] 人iPS細(xì)胞的培養(yǎng)
[0207] 用于本研究的人iPS細(xì)胞系--使用慢病毒重編程的iPS細(xì)胞(克隆C2)--由 Madison,WI的威斯康星大學(xué)解剖學(xué)系的James A Thomson教授提供??寺2通過向分離的 人皮膚成纖維細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)〇〇'-4、5(^2、似11叩和111128基因而生成。0?-1?5細(xì)胞由 Darrell N Kotton教授提供,并且由從囊性纖維化患者皮膚樣品分離的真皮成纖維細(xì)胞生 成。CF-iPS細(xì)胞由單個(gè)慢病毒載體非轉(zhuǎn)基因地生成。這些誘導(dǎo)多能人干細(xì)胞已經(jīng)在Thomson 和Kotton實(shí)驗(yàn)室中被表征。它們具有正常的核型、表達(dá)端粒酶活性、表達(dá)表征人ES細(xì)胞的細(xì) 胞表面標(biāo)記和基因、和維持分化為全部三種原胚層的高級(jí)衍生物的發(fā)育潛能。這兩種iPS細(xì) 胞系展示了無法區(qū)分于hESC比如H9的形態(tài),并且可以無期限地維持在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 飼養(yǎng)物(feeder)或基質(zhì)膠上。如由Thomson實(shí)驗(yàn)室先前所述的,培養(yǎng)和維持兩種人iPS細(xì)胞。 簡略地,iPS細(xì)胞在37°C,5 %C02和90-95 %濕度下在補(bǔ)充有4ng/ml bFGF、ImM谷氨酰胺、1 % mM非必需氨基酸和0.1 mM β-巰基乙醇的DMEM-F12培養(yǎng)基和20 %的敲除血清替代品中在輻 射的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)飼養(yǎng)層上增殖,每天更換培養(yǎng)基。使用干細(xì)胞切割工具 (Stem Cell Cutting Tool) (VWR)通過機(jī)械解離每4-5天將未分化的iPS細(xì)胞傳代至新鮮的 飼養(yǎng)物上。
[0208] iPS細(xì)胞體外分化至氣道上皮細(xì)胞
[0209] iPS細(xì)胞首先朝向定形內(nèi)胚層(DE)分化。DE細(xì)胞在先前描述的條件下開始。簡略 地,iPS細(xì)胞在補(bǔ)充有100ng/ml激活素 A、2mM L-谷氨酰胺和1%抗生素-抗真菌劑的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)。然后,將1 X B27補(bǔ)充物和0.5mM丁酸鈉加入相同的培養(yǎng)基,并且 iPS細(xì)胞在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天,每天更換培養(yǎng)基。
[0210]隨后,DE細(xì)胞被胰蛋白酶消化,并且重新平板接種在人ECM蛋白涂布的平板上,并 且通過在第5至第7天之間將其順序地暴露于具有10%FBS、2mM L-谷氨酰胺、ImM非必需氨 基酸、1%抗生素-抗真菌劑的MDM中的小分子抑制劑的組合而分化至前前腸內(nèi)胚層(AFE)。 參見圖1。
[0211] 然后,AFE細(xì)胞在由頂DM與20%FBS、2mM L-谷氨酰胺、ImM非必需氨基酸、1%抗生 素-抗真菌劑、視黃酸(0 · 5μΜ)、bFGF( 10ng/ml)、BMP4( 10ng/ml)、Wnt3a( 100ng/ml)和KGF(每 種lOng/ml)組成的肺內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基中維持5天。生長因子組合然后轉(zhuǎn)換為BMP7(10ng/ ml)、KGF( 10ng/ml)、高濃度的視黃酸(ΙμΜ)、RA-補(bǔ)充的B27、IWR-1 (ΙΟΟηΜ) (WNT拮抗劑)、 PD98059(lyM)(MAPK 拮抗劑)持續(xù) 3天。
[0212]第 16天開始,細(xì)胞在補(bǔ)充有IWR-1 (50nM)、高RA(lyM)、BMP7(10ng/ml)、KGF(10ng/ ml)、EGF(10ng/ml)、地塞米松(50nM)、丁酰cAMP(O.lmM)和異丁基甲基黃嘌呤(O.lmM)的相 同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中持續(xù)12天進(jìn)一步分化至氣道上皮細(xì)胞。作為替代選擇,DE細(xì)胞使用上面 提及的相同的培養(yǎng)基直接地分化,而不進(jìn)行分裂。在第28天,使用胰蛋白酶分裂細(xì)胞,并且 在BEGM?支氣管上皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基--來自Lonza--中重新接種在膠原蛋白I/III包被 的平板上直至使用。
[0213] 實(shí)時(shí)定量RT-PCR
[0214] 根據(jù)制造商的說明,使用來自Qiagene的RNeasy迷你試劑盒從iPS細(xì)胞和iPS細(xì)胞 源氣道上皮細(xì)胞提取總RNA。根據(jù)制造商的方案(Invitrogen),使用Superscript第一鏈合 成系統(tǒng)以隨機(jī)的六聚體作為引物合成第一鏈互補(bǔ)DNA(cDNA)。相等體積的產(chǎn)物混合物被用 作PCR擴(kuò)增的模板。用iQ? SYBR Green Supermix(Bio-Rad)和使用iCyler和iQ軟件(Bio-Rad)顯示的200nM每種正向和反向引物在25μ1體積中進(jìn)行反應(yīng)。每個(gè)樣品運(yùn)行一式三份。 PCR條件包括95°C 4min的預(yù)變性步驟,接著進(jìn)行由95°C 15s,60°C 30s和72°C 30s組成的 40個(gè)循環(huán)的PCR。對(duì)于感興趣的基因(G0I),來自一式三份的PCR反應(yīng)的平均閾值循環(huán)(Ct)值 針對(duì)于來自相同的cDNA樣品的GATOH的平均Ct值標(biāo)準(zhǔn)化。G0I轉(zhuǎn)錄物水平在樣品A和樣品B之 間的倍數(shù)變化等于2- ΔΔα,其中 Δ Ct = Ct(G〇i)-Ct(GAPDH),和 Δ Δ ct= Δ ct⑷-Δ ct⑶。
[0215] 流式細(xì)胞術(shù)和免疫化學(xué)分析
[0216] 在分化前和在誘導(dǎo)DE與AFE和朝向氣道上皮分化期間,在不同的時(shí)間點(diǎn)通過免疫 化學(xué)和/或流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞。iPS細(xì)胞和分化細(xì)胞在PBS中的4 %多聚甲醛中固定20min, 在室溫(RT)下用roS中的0.1%Triton X-100透化15min,在RT下在roS中的3%BSA中封閉 60min,并且然后在4°C下在一次抗體中培育過夜,在RT下在二次抗體中培育2h。
[0217] 對(duì)于流式細(xì)胞術(shù),如制造商所述的,用來自固定/透化試劑盒(BD Bioscience)的 固定溶液固定細(xì)胞,并且用一次和檢測(cè)抗體染色。簡略地,通過用0.25%胰蛋白酶培育 2min,細(xì)胞解離為單細(xì)胞懸浮液。將解離的細(xì)胞重懸(0.5X10 6個(gè)細(xì)胞)在250μ1的固定/透 化溶液中,在冰上保持20min,并且用Perm/Wash緩沖液洗滌兩次。在用封閉溶液在冰上封閉 30min后,用封閉溶液中相應(yīng)的一次抗體在冰上培育細(xì)胞30min。在用相應(yīng)的綴合二次抗體 在冰上培育30min后,細(xì)胞重懸在350μ1的Perm/Wash緩沖液中,洗滌兩次,并且通過流式細(xì) 胞術(shù)進(jìn)行分析。
[0218]統(tǒng)計(jì)分析
[0219] 用軟件Origin (Or iginLab,Northampton,MA)完成全部統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)表示為平均 值土s.e.m.(測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)誤差)。進(jìn)行T檢驗(yàn)以評(píng)估兩組是否彼此顯著地不同。小于0.05的p 值(雙側(cè))被認(rèn)為統(tǒng)計(jì)上顯著的。全部誤差棒代表土 SEM。
[0220]類器官形成
[0221] 第 15 天的氣道祖細(xì)胞在補(bǔ)充有高 RA(lyM)、BMP7(10ng/ml)、KGF(10ng/ml)、EGF (10ng/ml)、地塞米松(50nM)、丁酰cAMP(O.lmM)和異丁基甲基黃嘌呤(O.lmM)的頂DM培養(yǎng)基 中一一氣道上皮細(xì)胞在其中分化一一在氣-液相條件中的基質(zhì)膠中培養(yǎng)30天。如制造商所 述的,細(xì)胞用來自固定/透化試劑盒(BD Bioscience)的固定溶液固定,并且用氣道上皮細(xì) 胞的一次抗體、P63和NKX2.1以及檢測(cè)抗體染色。
[0222] 現(xiàn)在描述在本文公開的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
[0223] 肺具有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu),其以沿著其近端-遠(yuǎn)端軸的上皮組成中的主要差異為特 征。腔上皮(氣管和主支氣管)主要由纖毛細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌(NE)細(xì)胞和克拉拉樣細(xì)胞組成。 后者產(chǎn)生分泌珠蛋白(secretoglobins)--CCSP。在更遠(yuǎn)端氣道(小支氣管和細(xì)支氣管) 中,克拉拉細(xì)胞比纖毛細(xì)胞占優(yōu)勢(shì),并且比在氣管中存在更多的NE細(xì)胞。肺的最遠(yuǎn)端區(qū)域組 成肺泡的復(fù)雜系統(tǒng),肺泡由兩種主要的上皮細(xì)胞類型組成:1型(ATI)和II型(ΑΤΠ )上皮細(xì) 胞。ATI襯在肺中的大多數(shù)肺泡內(nèi)(覆蓋多至95%的肺泡表面積)并且主要地負(fù)責(zé)氣體交換, 而ΑΤΠ 細(xì)胞分泌肺泡表面活性物并且主要地是立方形的形狀。先前已經(jīng)描述了從人iPS細(xì) 胞生成定形內(nèi)胚層(DE)、前前腸內(nèi)胚層(AFE)和隨后的相對(duì)均一的人肺泡II型細(xì)胞群的分 步分化方法(Ghaedi等,JCI 2012)。在本文描述的操作中,采用了模擬引導(dǎo)氣道上皮發(fā)育的 信號(hào)傳導(dǎo)途徑的時(shí)序和協(xié)調(diào)的分步分化方法。使用獨(dú)特的策略,高效地從人多能干細(xì)胞生 成了功能性氣道上皮細(xì)胞。
[0224] 將人iPS細(xì)胞誘導(dǎo)為前前腸內(nèi)胚層和肺內(nèi)胚層細(xì)胞。胚胎呼吸系統(tǒng)一一氣管的遠(yuǎn) 端一一起源于在小鼠的胚胎期9.5天或人的胚胎期4周時(shí)分化為許多種類的特化的上皮細(xì) 胞的定形內(nèi)胚層(DE)的前腹面上的肺芽。
[0225] 使用無血清條件將人iPS細(xì)胞分化至DE細(xì)胞(圖1)。通過將iPS細(xì)胞暴露于飽和濃 度的激活素 A,生成了大于85%的內(nèi)胚層細(xì)胞。流式細(xì)胞檢測(cè)分析顯示源自iPS細(xì)胞的細(xì)胞 群在第5天表達(dá)高百分比的與此胚層相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記。89%的細(xì)胞是c-kit陽性的(圖2A), 91%是3(^17陽性的(圖2〇,93%是?(^2陽性的(圖28),并且88%的細(xì)胞在克隆(:1中表達(dá) 內(nèi)胚層表面標(biāo)記CXCR4 (圖2D)。
[0226]雖然以此方式得到的定形內(nèi)胚層細(xì)胞已經(jīng)假定是寬廣地多能的,但是數(shù)個(gè)研究已 經(jīng)顯示最前的前腸內(nèi)胚層譜系,比如胸腺、甲狀腺和肺上皮,難以衍生自這些先祖。定向分 化至肺泡上皮應(yīng)當(dāng)通過生成定形內(nèi)胚層(DE),接著圖式發(fā)育(patterning)為前前腸內(nèi)胚層 (AFE)進(jìn)行。
[0227] 因此,在第二步中,DE細(xì)胞進(jìn)一步分化至AFEJE細(xì)胞被解離,重新平板接種在人 ECM包被的平板上,并且在AFE分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天。ECM蛋白的選擇源自先前的研究,其顯 示在包含細(xì)胞外蛋白基質(zhì)的混合物(膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、生腱蛋白、彈性蛋白 和大量的蛋白聚糖與糖胺聚糖)的人ECM蛋白表面上培養(yǎng)的DE細(xì)胞與在其它ECM蛋白上培養(yǎng) 的DE細(xì)胞相比更快地貼附,并且導(dǎo)致更高數(shù)目的NKX2. Γ。
[0228] 小鼠與人ES和iPS上的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)清楚地證明,在iPS細(xì)胞源定形內(nèi)胚層中雙重抑制 激活素 A/nodal和TGF-β/ΒΜΡ信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于定量地生成前前腸內(nèi)胚層是必需的。在先前的嘗 試中,應(yīng)用Noggin(BMP信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑)和SB141524(TGF-i3信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑)至DE細(xì)胞2 天抑制了后內(nèi)胚層命運(yùn)(CDX2+),支持前內(nèi)胚層命運(yùn)(S0X2+),并且生成強(qiáng)烈表達(dá)與AFE表型 相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記的富集的細(xì)胞群。
[0229] 為了增加 NKX2.1+F0XA2+祖細(xì)胞的數(shù)目,對(duì)先前的方法做出修改以從DE細(xì)胞產(chǎn)生 AFE。Sneock和同事已經(jīng)顯示,連續(xù)抑制BMP/TGF,接著TGF和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制給予從DE 細(xì)胞更好的AFE分化(Huang SX等,Nat Biotechnol.,2013年12月1 日.doi:10.1038/ nbt. 2754)。為了促進(jìn)AFE同一性,DE細(xì)胞然后在第6天至第8天之間順序地暴露于BMP4/TGF0 和Wnt激動(dòng)劑與拮抗劑的不同的組合,如表1中列舉的。檢驗(yàn)增加 NKX2.1 +、F0XA2+S0X2+和 NKX2.1+F0XA2+組細(xì)胞數(shù)目的能力。表1中列舉的激動(dòng)劑和拮抗劑在AFE分化期間對(duì)F0XA2/ S0X2和NKX2.1表達(dá)的作用分別顯示在圖3A和3B中。
[0230] 表1:在第6天至第8天之間順序地添加的BMP4/TGFi3和Wnt激動(dòng)劑與拮抗劑的列表。
[0231]
[0232] 先前的研究顯示,F(xiàn)GF、BMP4家族成員、KGF和WNT3a提供在胚胎發(fā)生期間圖式發(fā)育 為肺內(nèi)胚層的信號(hào)。BMP4信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)肺特化是必需的,并且bFGF和WNT濃度的增加增加了 NKX2. Γ未成熟的肺先祖。為了規(guī)定肺細(xì)胞命運(yùn),在第7天后,培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換為包含bFGF(10ng/ ml)、BMP4( 10ng/ml)、Wnt3a( 100ng/ml)和KGF( 10ng/ml)的肺內(nèi)胚層分化培養(yǎng)基持續(xù)5天。在 第7天時(shí)比較不同條件之間的FOXA2+SOX2+前內(nèi)胚層細(xì)胞的數(shù)目。通過流式細(xì)胞術(shù)量化總 FOXA2+內(nèi)胚層細(xì)胞中FOXA2+SOX2+前內(nèi)胚層細(xì)胞的雙陽性細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果指示,阻斷DE細(xì) 胞中的BMP4/TGFB和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)與單獨(dú)的培養(yǎng)基相比增加了 FOXA2+SOX2+前內(nèi)胚層細(xì)胞的 數(shù)目。與其它抑制劑的組合相比,當(dāng)細(xì)胞順序地暴露于dorsomorphin/SB431542(BMP/TGF0 的抑制劑)和IWP2/SB431542(WNT/TGF-f3的抑制劑)的組合時(shí),發(fā)現(xiàn)此增加更顯著(圖3A)。
[0233] ΝΚΧ2.Γ是區(qū)分未來的肺與前腸內(nèi)胚層的其它衍生物的最早的細(xì)胞標(biāo)記。測(cè)試順 序地暴露于BMP/TGFf3和WNT/TGF-β以確定其是否致使iPS細(xì)胞-DE細(xì)胞更能夠分化為NKX2.1 +內(nèi)胚層細(xì)胞。NKX2. Γ細(xì)胞的百分比被量化為存在的總細(xì)胞的百分比。與其它抑制劑的組合 相比,當(dāng)DE細(xì)胞暴露于dorsomorphin/SB431542(BMP/TGF0的抑制劑)和IWP2/SB431542 (Wnt/TGF-邱勺抑制劑)的組合時(shí),NKX2. Γ細(xì)胞的數(shù)目更多(圖3B)。
[0234] 參見圖4和下面的表2,進(jìn)一步操作方案以在第15天時(shí)導(dǎo)致NKX2.1+F0XA2+細(xì)胞的增 加,與暴露于N0GGIN/SB的DE細(xì)胞中的50%相比其是72.1%,小于1%沒有前部化(圖5)。用 F0XA2共染色的全部離體分化的NKX2. Γ細(xì)胞(圖6A-6D)表明體外分化的NKX2. Γ細(xì)胞代表肺 內(nèi)胚層細(xì)胞。連續(xù)的激活素 A治療導(dǎo)致罕見的F0XA2+S0X2+細(xì)胞和極少的ΝΚΧ2.Γ細(xì)胞(圖3A 和3B),這表明激活素 A暴露的最佳持續(xù)時(shí)間是重要的。在培養(yǎng)中沒有檢測(cè)到PAX8+(甲狀腺 標(biāo)記)和TUJ1(神經(jīng)元標(biāo)記)細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。全部這些結(jié)果與以下發(fā)現(xiàn)一致:在連續(xù)地阻 斷DE細(xì)胞中的BMP4/TGFB和WNT信號(hào)傳導(dǎo)后,F(xiàn)GF、BMP4和WNT信號(hào)傳導(dǎo)的組合促進(jìn)肺特異性 NKX2. Γ祖細(xì)胞從前內(nèi)胚層的譜系特化。
[0235] 表2:在第5天至第15天之間順序地添加的BMP4/TGFi3和Wnt激動(dòng)劑與拮抗劑的列 表。
[0236]
[0237] 通過免疫熒光染色或PCR,沒有在蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)到任何類型的成熟肺氣道上 皮細(xì)胞的標(biāo)記,比如粘蛋白1、粘蛋白5AC(杯狀細(xì)胞)、F0XJ1 (纖毛細(xì)胞)和CCSP(克拉拉細(xì) 胞)(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0238] 朝向肺氣道祖細(xì)胞分化肺內(nèi)胚層細(xì)胞。早期肺內(nèi)胚層(NKX2.1+/F0XA2+)是多能的, 并且其命運(yùn)取決于由局部微環(huán)境(主要是中胚層)提供的信號(hào)或控制區(qū)域(近端對(duì)遠(yuǎn)端)細(xì) 胞命運(yùn)的信號(hào)。氣道上皮的特化發(fā)生在胚肺的柄中,而尖部中的肺泡先祖分化至遠(yuǎn)端細(xì) 胞--ΑΤΠ 和ATI細(xì)胞。柄區(qū)域中的NKX2.1+S0X2+細(xì)胞是生成成熟氣道上皮的氣道祖細(xì)胞。 相比之下,遠(yuǎn)端胚胎肺芽尖表達(dá)S0X9和F0XP2,并且能產(chǎn)生氣道和肺泡的全部細(xì)胞類型。
[0239] BMP4在遠(yuǎn)端表達(dá),而BMP7更靠近氣道表達(dá)。遠(yuǎn)端的bFGF和FGF10被近端的KGF (FGF7)替換,而WNT信號(hào)傳導(dǎo)在近端柄先祖中被抑制并且存在于遠(yuǎn)端尖部中。S0X2是支氣管 譜系特化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物,其由典范的WNT信號(hào)傳導(dǎo)負(fù)調(diào)節(jié)。抑制WNT和MAPKK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)途 徑增加來自AFE細(xì)胞的NKX2.1+S0X2+細(xì)胞比例。視黃酸(RA)是肺芽發(fā)育的重要因子,而且近 端柄區(qū)域中的RA濃度比遠(yuǎn)端尖部區(qū)域處的相對(duì)更高。高RA信號(hào)傳導(dǎo)阻止遠(yuǎn)端肺發(fā)育并且有 助于近端氣道發(fā)育。
[0240] 為了將NKX2. Γ肺先祖轉(zhuǎn)變?yōu)镹KX2.1+S0X2+近端祖細(xì)胞,調(diào)節(jié)BMP和WNT途徑以控制 氣道樹的近端至遠(yuǎn)端圖式發(fā)育。在第12天,為了增強(qiáng)近端氣道命運(yùn),將生長因子組合轉(zhuǎn)換為 包含BMP7(10ng/ml)、KGF(10ng/ml)、高濃度的視黃酸(ΙμΜ)、IWR-1 (lOOnM) (WNT拮抗劑)、 PD98059(lyM)(MAPK拮抗劑)的近端誘導(dǎo)培養(yǎng)基持續(xù)3天。在3天后,觀察到IWR-1、PD98059、 BMP7和高RA濃度抑制WNT途徑。與治療前大約1-2%相比,NKX2.1+/S0X2+氣道祖細(xì)胞接近大 約 30%。(圖7A-7D和8)。
[0241 ]為了進(jìn)一步促進(jìn)氣道分化,將第15天時(shí)的祖細(xì)胞在補(bǔ)充有IWR-1 (lOOnM)、RA( 1μ M)、BMP4( 10ng/ml)、BMP7( 10ng/ml)、KGF( 10ng/ml)、EGF( 10ng/ml)的相同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中 培養(yǎng)12天。參見圖9。定量RT-PCR揭示了成熟肺氣道上皮細(xì)胞標(biāo)記比如F0XJ1 (纖毛細(xì)胞)(圖 10A)、KRT5(基底細(xì)胞)(圖 10B)、CFTR(圖 10C)、CCSP 或 SCGB1A1 (克拉拉細(xì)胞)(圖 10D)、P63 (圖10E)、粘蛋白5AC(杯狀細(xì)胞)(圖10G)的相對(duì)適度的增加,并且當(dāng)與S0X2表達(dá)(圖10F)相 比時(shí),其在分化的第20天時(shí)在源自iPS細(xì)胞的細(xì)胞中高度地表達(dá)。還參見表3。
[0242] 表3:添加至基礎(chǔ)培養(yǎng)基以促進(jìn)氣道分化的激動(dòng)劑和拮抗劑的列表。
[0243]
[0244]
[0245] 第27天時(shí),流式細(xì)胞術(shù)揭示了上述生長因子和抑制劑組合誘導(dǎo)了氣道上皮分化, 此時(shí)76%的細(xì)胞是氣道細(xì)胞標(biāo)記S0X2陽性的(圖11和12DKS0X2陽性細(xì)胞的百分比在第35 天時(shí)從72%增加至92%?;缀头置?纖毛細(xì)胞是大和小氣道區(qū)室中的兩種主要的上皮細(xì) 胞譜系?;准?xì)胞(BC)是襯在人肺的傳導(dǎo)氣道內(nèi)的假復(fù)層上皮并且先前顯示為生成其它近 端氣道譜系。BC的一個(gè)特性是轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白63(P63)和細(xì)胞骨架蛋白一一細(xì)胞角 蛋白5和14(分別是KRT5和KRT14)--的高水平表達(dá)。當(dāng)在氣-液界面處或氣管球 (tracheosphere)體外試驗(yàn)中培養(yǎng)時(shí),這些細(xì)胞在人氣道中增殖并生成纖毛和分泌細(xì)胞(克 拉拉細(xì)胞)。
[0246] 在分化的第27天,64%的細(xì)胞是KRT5陽性的(圖12F)且超過60%的細(xì)胞是P63+(圖 12H),這表明絕大多數(shù)的細(xì)胞潛在地是基底細(xì)胞先祖。76%的細(xì)胞表達(dá)克拉拉細(xì)胞分泌蛋 白(CCSP)(圖12E)。克拉拉樣細(xì)胞是貫穿近端至遠(yuǎn)端軸的上皮分泌細(xì)胞,并且早就已經(jīng)被認(rèn) 為充當(dāng)氣道的祖細(xì)胞。囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體類別的離子通道, 其輸送氯離子和硫氰酸根離子穿過上皮細(xì)胞膜。大多數(shù)的氣道上皮細(xì)胞,以及神經(jīng)上皮細(xì) 胞表達(dá)CFTR蛋白。流式細(xì)胞術(shù)分析揭示了在第27天時(shí)36%的細(xì)胞是CFTR陽性的(圖12B)。多 至65 %和58%的細(xì)胞分別是纖毛細(xì)胞標(biāo)記F0XJ1 (圖12A)和β-微管蛋白IV(圖12C)陽性的, 這表明在培養(yǎng)中至少三分之一的細(xì)胞具有有纖毛的CFTR-表達(dá)氣道表型(圖12Β)。僅8%的 細(xì)胞表達(dá)粘蛋白 _5AC 杯狀細(xì)胞標(biāo)記(圖12G)。
[0247] 第27天時(shí)的qPCR指示轉(zhuǎn)換為氣道分化培養(yǎng)基導(dǎo)致進(jìn)一步上調(diào)氣道基因 KRT5(圖 13F)、P63、F0XJ1 (圖138)、50乂17、]\^:5六(:(圖130)和0?丁1?(圖13六),同時(shí)存在較低水平的粘蛋 白5AC、SCGB1A1(CCSP)(圖13C)。在此階段未檢測(cè)到其它內(nèi)胚層譜系標(biāo)記,比如AFP(肝)、 PDX1、TG (甲狀腺)和PAX9 (咽)。
[0248] ECM蛋白在肺中具有非常特異的分布和裝配模式。氣道上皮分化的復(fù)雜過程還涉 及細(xì)胞-基質(zhì)和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。與其它ECM蛋白相比,人氣管和氣道主要由膠原蛋白I 和III組成。因此,第28天開始,細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至膠原蛋白I/III包被的平板上BEGM?支氣管上 皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基--來自Lonza--中持續(xù)另外7天。使用修改的人肺泡分化的條件,在 第35天,AFE細(xì)胞被高效地成功轉(zhuǎn)變?yōu)闅獾郎掀ぷ婕?xì)胞。
[0249] 第35天時(shí),分化細(xì)胞是氣道上皮細(xì)胞標(biāo)記CFTR(圖15E)、CCSP(圖15D)、粘蛋白5AC (圖15C)、F0XJ1 (圖15B)和PanKRT(圖15F)陽性染色的。如在第35天時(shí)通過流式細(xì)胞術(shù)確定 的,100%的細(xì)胞是氣道細(xì)胞標(biāo)記S0X2陽性的(圖16H),并且多至97.5%的細(xì)胞是P63陽性的 (圖16D)。多至100 %的細(xì)胞表達(dá)CCSP (克拉拉細(xì)胞)(圖16F)、β-微管蛋白IV (圖16C)和FOXJ1 (纖毛細(xì)胞)(圖16B)。62 %和24%的細(xì)胞分別是CFTR(圖16E)和粘蛋白5AC(圖16A)陽性的。 [0250] 在第35天結(jié)束時(shí),絕大多數(shù)的--92.2%的--細(xì)胞是KRT5或CK5陽性的,同時(shí)它 們表達(dá)展示纖毛表型和分泌表型的F0XJ1和CCSP。這證明了 iPS細(xì)胞源氣道細(xì)胞在此階段仍 具有多能潛能。當(dāng)它們正在經(jīng)歷分化至其它近端細(xì)胞比如克拉拉細(xì)胞和纖毛細(xì)胞時(shí),氣道 祖細(xì)胞或基底細(xì)胞維持基底細(xì)胞標(biāo)記KRT5和P63的表達(dá)是可能的。Gomperts等在類器官試 驗(yàn)中證明克拉拉細(xì)胞表達(dá)F0XJ1,具有纖毛表型,以及包含表達(dá)Muc5AC、CCSP和角蛋白5的細(xì) 胞。
[0251]第35天時(shí)的定量RT-PCR揭示了CK5或KRT5(圖 17A)、SCGB1A1 (CCSP)(圖 17E)、CFTR (圖17B)、P63(圖17D)、F0XJ1 (圖17F)和粘蛋白-5AC(圖17G)在iPS源氣道上皮細(xì)胞中高度表 達(dá),而且表達(dá)水平比得上新鮮分離的人氣道細(xì)胞。在未分化的iPS、DE、AFE細(xì)胞中檢測(cè)不到 這些基因。
[0252] 然后,檢驗(yàn)類似的分步分化方法以從CF疾病特異性人iPS細(xì)胞生成肺氣道先祖(圖 18)。有趣地,CF-iPS細(xì)胞克隆產(chǎn)生類似的結(jié)果并且對(duì)朝向DE、AFE、氣道上皮細(xì)胞分化具有 類似的功效,這表明此方案可以被推廣至來自其它來源的其它iPS細(xì)胞系(圖19A-19D顯示 了細(xì)胞染色,圖20A-20H顯示了流式細(xì)胞檢測(cè)分析,和圖21A-21H顯示了定量RT-PCR結(jié)果)。
[0253] 免疫染色分析還顯示源自iPSC的氣道組細(xì)胞群能夠在基質(zhì)膠中發(fā)育為肺類器官 結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)是氣道標(biāo)記--P63 (圖22A)和NKX2.1 (圖22B)--陽性的。
[0254] 研發(fā)用于植入人體的功能性肺泡組織的離體裝配的先進(jìn)技術(shù)是組織工程師所面 對(duì)的挑戰(zhàn)性任務(wù)中的一個(gè)。將ESC和iPS細(xì)胞分化至肺上皮細(xì)胞或前體的最近研究已經(jīng)表明 使用干細(xì)胞源上皮細(xì)胞用于肺工程化的有希望的治療策略。
[0255] 在本研究中,研發(fā)了用于將iPS細(xì)胞定向分化至功能性傳導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞的高效 的方法,所述功能性傳導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞可以用于去細(xì)胞肺支架的再細(xì)胞化,并且其最終可 以提供用于肺移植的自體移植物。顯著地,這種定向分化的方法廣泛地適用于數(shù)種多能細(xì) 胞系(人iPS細(xì)胞克隆C1--重編程自胎兒肺成纖維細(xì)胞,和CF-iPS細(xì)胞--重編程自真皮 成纖維細(xì)胞)。兩種iPS細(xì)胞克隆產(chǎn)生類似的結(jié)果,并且對(duì)朝向DE、AFE和不同類型的氣道細(xì) 胞分化具有類似的功效,這表明此方案可以被推廣至來自其它來源的其它iPS細(xì)胞系。iPS 細(xì)胞分化至肺泡上皮的大多數(shù)努力集中于生成II型上皮細(xì)胞,而極少研究針對(duì)氣道上皮的 分化。在全部發(fā)布的報(bào)道中,功效很低并且氣道標(biāo)記的表達(dá)似乎是隨機(jī)的。在低效地分化 ESC和iPS細(xì)胞的非均一的培養(yǎng)中,存在在群體內(nèi)留下未分化的多能干細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn),其可以 在移植后攜帶畸胎瘤形成的顯著風(fēng)險(xiǎn)。無論何種干細(xì)胞類型用于分化,在肺工程化中特別 是在生成大數(shù)量的分化良好的細(xì)胞中仍存在挑戰(zhàn)。在先前的報(bào)道中,來自iPS細(xì)胞的分化的 氣道細(xì)胞已經(jīng)難以擴(kuò)增。然而,與分離的氣道細(xì)胞不同,在本研究中的iPS細(xì)胞源氣道細(xì)胞 能夠增殖數(shù)代而不喪失氣道上皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記,比如〇^?、?63、?(^11、0?了1?和粘蛋白-5八(:, 并且可以用于生成數(shù)千萬的細(xì)胞,其可以接種至無細(xì)胞的基質(zhì)支架。當(dāng)使用自體iPS細(xì)胞源 細(xì)胞轉(zhuǎn)換這些技術(shù)用于產(chǎn)生組織工程化人肺組織時(shí),"放大"先祖群體的能力將是特別有價(jià) 值的。
[0256] 而且,提供允許治療遭受遺傳和變性障礙的患者的限定的可移植的細(xì)胞的供應(yīng)是 人細(xì)胞療法的主要目標(biāo)。在某些肺病中,比如囊性纖維化,移植從人肺分離的成人肺干細(xì)胞 和祖細(xì)胞或肺泡細(xì)胞正在形成為恢復(fù)患者中的正常肺功能的新型治療方法。然而,此方法 受限于人肺泡細(xì)胞的缺乏,更重要地,缺乏在損傷的肺中體內(nèi)移植這樣的細(xì)胞。
[0257] 源自iPS細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞或肺上皮前體提供有希望的治療策略,其使用基于 干細(xì)胞的吸入療法以在患者中替換天然肺上皮細(xì)胞并重構(gòu)健康的肺上皮。
[0258] 而且,新藥物的研發(fā)是昂貴的且資源密集型的。iPS源氣道上皮細(xì)胞潛在地對(duì)藥物 研發(fā)非常有價(jià)值,其從早期靶標(biāo)研究和安全評(píng)定以及篩選模型中用作工具跨度至發(fā)現(xiàn)新化 學(xué)實(shí)體。iPS源氣道上皮細(xì)胞可以用于對(duì)肺組織病理學(xué)測(cè)試藥物。此外,iPS源氣道上皮細(xì)胞 可以用于檢驗(yàn)治療劑的具體的遞送運(yùn)載體對(duì)肺組織病理學(xué)的作用,例如,與經(jīng)由不同的遞 送系統(tǒng)施用的相同藥劑的作用相比,或簡單地評(píng)價(jià)遞送運(yùn)載體自身(例如病毒載體對(duì)非病 毒載體)是否能夠影響肺病理學(xué)。
[0259]使用在飼養(yǎng)層或基質(zhì)膠上將iPS細(xì)胞定向分化至定形內(nèi)胚層期取代胚狀體方法。 當(dāng)與EB方法相比時(shí),朝向DE定向分化產(chǎn)生高純度的群體。這主要是因?yàn)樵谂郀铙w中,甚至在 存在激活素 A的情況下,從兩種其它的胚胎胚層一一中胚層和外胚層一一留下細(xì)胞。
[0260]為了誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層,iPS細(xì)胞在補(bǔ)充有100ng/ml激活素 A的無血清RPMI 1640培 養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時(shí)。然后,1 X B27補(bǔ)充物、0.5mM丁酸鈉被添加入相同的培養(yǎng)基,并且iPS細(xì) 胞在此培養(yǎng)基中培養(yǎng)另外3天。在先前建立的公布的方案中,細(xì)胞在包含激活素 A的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)4天而不是5天。1 X B27補(bǔ)充物提供了低血清條件。這些細(xì)胞還顯示了在存在丁酸鈉 的情況下的均勻的形態(tài)。
[0261] 在其它方案中,研究者已經(jīng)主要地使用無血清培養(yǎng)基或限定的培養(yǎng)基。相比之下, 本文描述的修改的方案導(dǎo)致IPS源細(xì)胞群在第5天時(shí)表達(dá)高百分比的與此胚層相關(guān)聯(lián)的標(biāo) 記。該細(xì)胞群中89 %的細(xì)胞是c-kit陽性的,91 %是S0X17陽性的,93 %是F0XA2陽性的,并且 88 %的細(xì)胞在克隆C1中表達(dá)內(nèi)胚層表面標(biāo)記CXCR4。
[0262] 為了將定形內(nèi)胚層分化至前前腸內(nèi)胚層,DE細(xì)胞在包含5%FBS和Dorsomorphin/ SB141524的頂DM中培養(yǎng)。其它方案使用其它基礎(chǔ)培養(yǎng)基代替頂DM,并且其它的使用無血清 培養(yǎng)基或限定的培養(yǎng)基。
[0263] 為了控制從前前腸內(nèi)胚層至傳導(dǎo)氣道細(xì)胞的分化,生長因子和細(xì)胞外蛋白基質(zhì)是 焦點(diǎn)。在本文描述的分化方法中,選擇具有10%FBS的頂DM中的EGF、KGF和BMP7、BMP4、IWR-1 (WNT3a抑制劑)和高視黃酸。此分化混合物還沒有在先前的報(bào)道中使用。
[0264] 本文描述的方法模擬胚胎發(fā)生期間的肺發(fā)育,其使用存在于肺中的細(xì)胞外基質(zhì)蛋 白(這些包括膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、生腱蛋白、彈性蛋白、和大量的蛋白聚糖與 糖胺聚糖)以及在肺發(fā)育和再生中發(fā)揮主要作用的生長因子的組合。iPS細(xì)胞首先朝向定形 內(nèi)胚層(DE)分化,并且然后在ECM包被的表面上培養(yǎng)。本文描述的分化方法的發(fā)現(xiàn)首先使用 ECM包被的表面用于氣道上皮細(xì)胞分化,連同人iPS細(xì)胞中的生長因子用于組織特異性分 化。
[0265] 氣道上皮分化的復(fù)雜過程還涉及細(xì)胞-基質(zhì)和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。人氣管和氣道 主要由膠原蛋白I和III組成。因此,第28天開始,細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至膠原蛋白I/III包被的平板 上BEGM?支氣管上皮細(xì)胞生長培養(yǎng)基一一來自Lonza-一中持續(xù)另外5天。此研究是首先使 用膠原蛋白I/III混合包被的表面用于自iPS細(xì)胞的氣道上皮分化中的一種。
[0266] 意外地發(fā)現(xiàn)人多能干細(xì)胞可以高效地體外定向分化為傳導(dǎo)氣道上皮。使用本文描 述的方法用于人氣道分化,在第35天,AFE細(xì)胞高效地成功轉(zhuǎn)變?yōu)闅獾郎掀ぷ婕?xì)胞。如在第 35天通過流式細(xì)胞術(shù)確定的,大約100%的細(xì)胞是氣道細(xì)胞標(biāo)記S0X2陽性的,并且多至大約 97.5%的細(xì)胞是P63陽性的。此外,多至大約100%的細(xì)胞表達(dá)CCSP(克拉拉細(xì)胞)、β-微管蛋 白IV和F0XJ1 (纖毛細(xì)胞)。大約62%和24%的細(xì)胞分別是CFTR和粘蛋白5AC陽性的。
[0267] 在第35天結(jié)束時(shí),絕大多數(shù)的--大約92.2%的--細(xì)胞是KRT5陽性的,同時(shí)它 們表達(dá)顯示纖毛和分泌表型的F0XJ1和CCSP。定量RT-PCR還揭示了 CK5、SCGBlal(CCSP)、 〇?丁1?、?63、?(^11和粘蛋白-54(:在丨?3源氣道上皮細(xì)胞中高度地表達(dá),而且相對(duì)水平比得上 新鮮分離的人氣道細(xì)胞。
[0268] 與分離的氣道細(xì)胞不同,本文描述的iPS細(xì)胞源氣道細(xì)胞能夠增殖數(shù)代而不喪失 氣道上皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記,比如CCSP、P63、F0XJ1、CFTR和粘蛋白-5AC。這使得可能生成數(shù)千萬 細(xì)胞用于進(jìn)一步的目的,比如接種無細(xì)胞的基質(zhì)支架用于制造工程化肺組織。
[0269] 其它實(shí)施方式
[0270] 在本文的變量的任何限定中敘述一列要素包括將該變量限定為任何單一要素或 所列要素的組合(或子組合)。在本文敘述的實(shí)施方式包括作為任何單一實(shí)施方式或與任何 其它實(shí)施方式或其部分組合的實(shí)施方式。
[0271] 本文引用的每一個(gè)專利、專利申請(qǐng)和出版物的公開內(nèi)容在此通過引用以其全部并 入本文。雖然已經(jīng)參考具體的實(shí)施方式公開了本發(fā)明,但是明顯地,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè) 計(jì)本發(fā)明的其它實(shí)施方式和變型,而不背離本發(fā)明的真實(shí)精神和范圍。附帶的權(quán)利要求意 欲解釋為包括全部這樣的實(shí)施方式和等價(jià)變型。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 源自誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞的氣道上皮細(xì)胞,其特征在于: 表達(dá)氣道細(xì)胞表面標(biāo)記,其中所述氣道細(xì)胞表面標(biāo)記包括克拉拉細(xì)胞分泌蛋白 (CCSP)、細(xì)胞角蛋白5 (KRT5)和FOXJ1;和 在培養(yǎng)中增殖而不喪失所述氣道細(xì)胞表面標(biāo)記的能力。2. 權(quán)利要求1所述的氣道上皮細(xì)胞,其中所述氣道上皮細(xì)胞是有纖毛的。3. 權(quán)利要求1所述的氣道上皮細(xì)胞,進(jìn)一步包括表達(dá)囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白 (CFTR)04. 權(quán)利要求1所述的氣道上皮細(xì)胞,進(jìn)一步包括表達(dá)β_微管蛋白IV、粘蛋白-5AC和P63 中的至少一種。5. 權(quán)利要求1所述的氣道上皮細(xì)胞,其中所述氣道細(xì)胞表面標(biāo)記以比得上在新鮮分離 的人氣道細(xì)胞上表達(dá)的水平表達(dá)。6. 權(quán)利要求1所述的氣道上皮細(xì)胞,其中所述氣道上皮細(xì)胞源自囊性纖維化人iPS細(xì) 胞。7. 權(quán)利要求1所述的氣道上皮細(xì)胞,其中所述氣道上皮細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中增殖至少大 約30天。8. 權(quán)利要求7所述的氣道上皮細(xì)胞,其中所述氣道上皮細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中增殖大于大 約30天。9. 將誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞分化為氣道上皮細(xì)胞的方法,包括: 在缺少血清的情況下培養(yǎng)所述iPS細(xì)胞以誘導(dǎo)分化為定形內(nèi)胚層(DE)細(xì)胞; 在存在血清的情況下培養(yǎng)所述DE細(xì)胞以誘導(dǎo)分化為前前腸內(nèi)胚層(AFE)細(xì)胞;并且 在存在血清、細(xì)胞因子混合物和高濃度的視黃酸的情況下培養(yǎng)所述AFE細(xì)胞以誘導(dǎo)所 述AFE細(xì)胞分化為所述氣道上皮細(xì)胞。10. 權(quán)利要求9所述的方法,其中培養(yǎng)所述iPS細(xì)胞的步驟包括在存在激活素 A的情況下 培養(yǎng)所述iPS細(xì)胞以誘導(dǎo)分化至所述DE細(xì)胞。11. 權(quán)利要求10所述的方法,其中所述激活素 A在所述iPS細(xì)胞培養(yǎng)中處于大約飽和濃 度。12. 權(quán)利要求9所述的方法,其中培養(yǎng)所述iPS細(xì)胞的步驟包括在存在無血清補(bǔ)充物的 情況下培養(yǎng)所述iPS細(xì)胞。13. 權(quán)利要求9所述的方法,其中所述DE細(xì)胞表達(dá)選自c-k i t、SOX 17、F0XA2和CXCR4的一 種或多種定形內(nèi)胚層細(xì)胞標(biāo)記。14. 權(quán)利要求9所述的方法,其中培養(yǎng)所述DE細(xì)胞的步驟包括在存在細(xì)胞外基質(zhì)(ECM) 分子的情況下培養(yǎng)所述DE細(xì)胞。15. 權(quán)利要求14所述的方法,其中在存在ECM分子的情況下培養(yǎng)的步驟包括在用ECM分 子培養(yǎng)之前使所述DE細(xì)胞解離。16. 權(quán)利要求14所述的方法,其中所述ECM分子包括膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白、 生腱蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖和糖胺聚糖中的一種或多種。17. 權(quán)利要求9所述的方法,其中培養(yǎng)所述DE細(xì)胞的步驟包括將所述DE細(xì)胞順序地暴露 于小分子抑制劑以抑制后內(nèi)胚層命運(yùn)和誘導(dǎo)近端內(nèi)胚層命運(yùn)。18. 權(quán)利要求17所述的方法,其中所述小分子抑制劑抑制BMP/TGF信號(hào)傳導(dǎo)。19. 權(quán)利要求18所述的方法,其中所述小分子抑制劑選自(1〇^〇1]1〇印11;[11、1'1〇88;[11、483- 01、01^-1、04476、6¥788388、1^364947、1?印5(?、58431542、58505124、58525334和50208。20. 權(quán)利要求17所述的方法,其中所述小分子抑制劑抑制TGF/WNT信號(hào)傳導(dǎo)。21. 權(quán)利要求20所述的方法,其中所述小分子抑制劑選自IWR-l,Noggin、CCT036477、 IWP2、去甲氧基姜黃素、FH535A83-01、D4476、GW788388、LY364947、RepSox、SB431542、 SB505124、SB525334和SD208。22. 權(quán)利要求9所述的方法,其中所述AFE細(xì)胞表達(dá)NKX2.1。23. 權(quán)利要求9所述的方法,其中所述高濃度的視黃酸包括至少大約0.5μΜ。24. 權(quán)利要求9所述的方法,其中所述細(xì)胞因子混合物抑制所述WNT途徑。25. 權(quán)利要求9所述的方法,其中所述iPS細(xì)胞源自患病的人細(xì)胞。26. 權(quán)利要求25所述的方法,其中所述患病的人細(xì)胞是囊性纖維化疾病特異性人iPS細(xì) 胞。27. -種工程化三維肺組織,其包括權(quán)利要求1所述的氣道上皮細(xì)胞。28. 工程化三維肺組織的方法,包括: 將誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞群分化為氣道上皮細(xì)胞,其中所述氣道上皮細(xì)胞表達(dá)包括克 拉拉細(xì)胞分泌蛋白(CCSP)、細(xì)胞角蛋白5(KRT5)和FOXJl的氣道細(xì)胞表面標(biāo)記;并且能夠在 培養(yǎng)中增殖而不喪失氣道細(xì)胞標(biāo)記;和 將所述氣道上皮細(xì)胞接種至三維支架上。29. 權(quán)利要求28所述的方法,其中所述氣道上皮細(xì)胞形成類器官結(jié)構(gòu)。30. 權(quán)利要求28所述的方法,其中所述三維支架包括基質(zhì)膠。31. 改善、治療或減輕有需要的對(duì)象中的呼吸障礙的癥狀的方法,包括: 將誘導(dǎo)多能干(iPS)細(xì)胞分化為氣道上皮細(xì)胞,其中所述氣道上皮細(xì)胞表達(dá)包括克拉 拉細(xì)胞分泌蛋白(CCSP)、細(xì)胞角蛋白5(KRT5)和FOXJl的氣道細(xì)胞表面標(biāo)記,并且能夠在培 養(yǎng)中增殖而不喪失氣道細(xì)胞標(biāo)記;和 以對(duì)治療所述對(duì)象中的所述呼吸障礙有效的量施用所述氣道上皮細(xì)胞。32. 權(quán)利要求31所述的方法,其中所述呼吸障礙是囊性纖維化。
【文檔編號(hào)】C12N5/074GK105916978SQ201580004541
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2015年1月14日
【發(fā)明人】M·格赫德, L·尼克拉森
【申請(qǐng)人】耶魯大學(xué)
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