靶向Clec9a的親和肽WH肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于腫瘤預防和治療技術領域，具體涉及一種靶向mClec9a的親和肽WH肽、制備及其應用。該肽包括12個氨基酸，其氨基酸序列為：WPRFHSSVFHTH，可通過Fmoc固相合成法制備獲得?？稍谀[瘤預防和治療中應用。該肽通過噬菌體展示肽庫技術淘選獲得。對其在生物體內(nèi)和體外的交叉遞呈外源抗原的能力和誘導特異CTL反應情況的研究結果表明，WH肽作為一種靶向載體，能夠較好誘導特異性CTL應答，提升IFN?γ和相關細胞殺傷性分子的表達量，從而增強抗腫瘤效果。結合計算機模擬分子對接技術，對WH肽與Clec9a蛋白間可能的對接區(qū)域以及作用位點的研究，也為其他相關研究提供了較好地參考和借鑒意義。
【專利說明】
革田向Cl ec9a的親和脅VH化
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于腫瘤預防和治療技術領域，具體設及一種祀向mClec9a的親和膚W胡太、 制備及其應用。
【背景技術】
[0002] 樹突狀細胞(demlritic cells,DCs)是介導T細胞和B細胞免疫應答的專職抗原遞 呈細胞。與其他的抗原遞呈細胞(antigen-presenting cel Is, APC)相比，DC具有超強的捕 獲、加工和遞呈抗原的能力，只有DC能活化naive T細胞(T cells) eDC誘導強有力的特異性 的抗腫瘤免疫反應，因此針對DC的免疫治療是一個非常有效的免疫治療策略。
[0003] 在鼠和人類中至少可W分為3類DC:類漿細胞DC(plasmac5rtoid DC，pDC)，血液來 源的傳統(tǒng)的DC(blood-derived conventional DC,cDC)和組織來源的DC(tissue-derived cDC)。運3類DC根據(jù)DC膜表面的表面分子、功能和來源又可W將運3類分為不同的DC亞群。研 究最多的DC亞群是在淋己器官中發(fā)現(xiàn)的blood-derived CD8a+DC、CD4+DC和CD4-CD8a-DC (double negative DC，DN-DC)。不同的DC有不同的功能，如CD8a+DC具有超強MHCI交叉遞呈 能力，能夠遞呈細胞相關外源蛋白或自身抗原給CD8巧細胞。在感染模型中DC也能夠產(chǎn)生特 異性抗病毒性的CTL應答。而CDSa-DC具有很好的將外源抗原遞呈給MHC n分子和直接引發(fā) CD4巧細胞反應。因此運些不同DC亞群分化表面標志物為抗原祀向治療提供了理論基礎，為 增強疫苗的效果提供了保障。
[0004] 現(xiàn)在研究DC疫苗的策略是利用抗體祀向DC表面特異性受體。目前研究最廣泛的DC 膜受體是C型凝集素受體，如Clec9a(C-type Lectin domain family 9A，Clec9a，又稱 Dendritic cell Natural killer lectin Group Receptor I，DNGR1)，CD205，Dectin-l和 CD206。在鼠中，mClec9a(mouse Clec9a)選擇性的表達在CD8a+DC、遷移CD103+DC (migratoiT CD103+DC)和pDC(plasma巧toid DC),少量表達在一些單核細胞上，而不表達 在其他細胞上。在人體內(nèi)，hClec9a(human Clec9a)選擇性表達在與CD8a+DC功能相似的 抓CA3+DC(CD141+DC)上，少量表達在B細胞和單核細胞中。所W我們認為DC上的Clec9a是一 個非常有潛力的DC疫苗祀點。
[000日]Clec9a屬于n型跨膜糖蛋白，包括胞外區(qū)C型凝集素結構域(c-type Iectin-Uke domain，CTLD)，單次跨膜結構域和胞內(nèi)的一個免疫受體酪氨酸激酶結構域（hemi- immunoreceptor tyrosine-based activation motif，hemi ITAM motif)cmClec9a由264 氨基酸組成，hClec9a由241個氨基酸組成，有共同的保守區(qū)域CTLD，二者在CTLD相似度為 61%。在細胞中mClec9a是W非糖基化的單體的形式存在。
[0006]已有研究表明，抗原祀向Clec9a可引發(fā)全面的免疫反應，因而通常都是利用 Clec9a抗體和抗原進行化學偶聯(lián)，但由于抗體-抗原復合物的分子量大，因而具有很多的缺 點，如抗原滲透性差;此外鼠的anti-hClec9a mAb在人上應用時可能會引起很大的免疫原 性。因而迫切需要一種祀向Clec9a的高親和的多膚載體W替代Clec9a抗體，從而可W降低 抗體的免疫原性和改善抗體-抗原復合物的低滲透性的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的是提供一種針對Clec9a的祀向親和膚W胡太，該親和膚利用隧菌體展示 膚庫(phage display library)技術篩選獲得，在腫瘤預防和治療中具有較好的應用前景。
[0008] 本發(fā)明所采取的技術方案如下所述。
[0009] -種祀向Clec9a的親和膚WH膚，該膚包括12個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，具體為：WPRF服SVFHTH，即：化P-Pro-Arg-Phe-His-Ser-Ser-Val-Phe-His-Thr- His。
[0010] 基于現(xiàn)有技術，可對該膚進行多種修飾或改造 W獲得其衍生物，具體改造時，如可 采用非天然氨基酸改造，或者采用聚乙二醇、PAS等修飾方法對其進行修飾改造。
[0011] 所述W胡太衍生物，還包括通過連接子偶聯(lián)或直接偶聯(lián)有抗原的衍生物，所述連接 子具體可采用化GGS)nC、GGSC或GGG等，其中n4~10;所述抗原具體例如OVA抗原。
[0012] 所述祀向Clec9a的親和膚WH膚，可通過Fmoc固相合成法制備獲得。
[0013] 所述祀向Clec9a的親和膚WH膚在腫瘤預防和治療中的應用，具體而言，作為一種 祀向Clec9a+的載體，運載抗原，可增強抗腫瘤免疫反應;所述腫瘤具體例如為B16細胞所致 肺癌腫瘤。
[0014] 現(xiàn)有DC疫苗治療腫瘤的策略主要有兩類：（1)腫瘤抗原刺激的DC疫苗:腫瘤在發(fā)展 的過程中會形成一系列的特異性的抗原，因此利用腫瘤抗原膚刺激DC既具有特異性、祀向 性且不易產(chǎn)生自身免疫反應；（2)基因轉(zhuǎn)染的DC疫苗：與傳統(tǒng)的多膚疫苗相比，核酸疫苗在 一定程度上可W激發(fā)機體全面的免疫反應，可W表達天然構象的抗原，抗原性更強，且可W 引發(fā)全面的T細胞效應。而本發(fā)明中，WH膚能夠與腫瘤抗原融合，進而通過病毒載體直接免 疫生物體，從而在體內(nèi)刺激T細胞的增殖W及發(fā)揮抗腫瘤免疫活性。因而利用本發(fā)明所提供 的WH膚可替代現(xiàn)有的anti-Clec9a祀向Clec9a，從而研制新一代的"多膚祀向疫苗"，而所制 備的新的多膚疫苗則具有明顯的高滲透性、廉價、易于合成和偶聯(lián)抗原等優(yōu)點。
[0015] 總體而言，本申請利用隧菌體展示膚庫技術淘選獲得了一種對Clec9a具有較好親 和性和特異性的W胡太。進一步地，發(fā)明人利用Fmoc固相合成技術制備了該膚，并對其在生物 體內(nèi)和體外的交叉遞呈外源抗原的能力和誘導特異CTL反應情況進行了研究。結果表明，WH 膚作為一種祀向載體，能夠較好誘導特異性CTL應答，提升IFN- 丫和相關細胞殺傷性分子的 表達量，從而增強抗腫瘤效果。進一步地，本發(fā)明中結合計算機模擬分子對接技術，對W胡太 與Clec9a蛋白間可能的對接區(qū)域W及作用位點進行了研究，也為其他相關研究提供了較好 地參考和借鑒意義。
【附圖說明】
[0016] 圖1為Western blotting檢測mClec9a-CTLD表達情況，其中左邊泳道為40h上清， 右邊泳道為6地上清;檢測時Anti-FALG抗體為1:1000稀釋，羊抗鼠二抗為1:8000稀釋； 圖2為WH膚質(zhì)譜圖； 圖3為利用Flt化誘導Clec9a表達情況； 圖4為Clec9a的親和膚與化-DC的親和實驗;其中各種生物素化的Clec9a-CTLD的親和 膚與化-DC在4°C解育30min，而后洗涂3次，加入SA-TO和anti-CDllc-APC再在冰上解育 30min，洗涂2次后流式檢測;GA作為對照膚，Rat IgGl是Clec9a抗體的同型； 圖5為Clec9a親和膚與轉(zhuǎn)染有質(zhì)粒的肥K-293T細胞的親和情況，其中GA作為對照膚， Rat IgGl是Clec9a抗體的同型；（A)為Clec9a抗體和WH膚都不親和轉(zhuǎn)染PIRES2-EGFP的EGFP +肥K293T細胞；（B)為WH膚能夠親和到肥K-293TUeG9a細胞上. 圖6為WH-mClec9a對接模型； 圖7為7個Clec9a的單氨基酸突變體轉(zhuǎn)染后，WH親和轉(zhuǎn)染不同mClec9a突變體的皿K- 293T結果； 圖8為WH-Clec9a殘基結合模型；其中上圖為WH與Clec9a整個蛋白對接模型，下圖為細 化的WH與Clec9a的D248和W250相互作用，它們之間的距離小于4.5 A; 圖9為W胡太親和特異性檢測結果； 圖10為體外實驗時W聞尋0VA257-264祀向至IjFkDC并且將抗原實行MHC class I交叉遞呈 的實驗結果;實驗時，將不同濃度的膚(終濃度為lOyg/mL、扣g/mL、2.扣g/mL、1.25iig/mL) 或者生理鹽水(NS)與化-DC在4°C解育1.5 h，用無血清培養(yǎng)基洗涂3次后備用；將磁珠分選 的OT-I小鼠的CD8+ T細胞用化M CFSE室溫避光解育lOmin，而后用30%的FBS在冰上終止反 應lOmin，用無血清洗涂3次后備用；將100化、1〇5 CFSE標記的CD8+ T cells鋪于Round- buttom 96孔板中，再將荷載或者不荷載膚的1〇4 FkDC鋪于96孔板中培養(yǎng)72h;其中（A) ELISA檢測IFN-丫的含量；（B)刺激naive T細胞增殖；（C)和（D)分別是pedorin和Grz B mRNA的倍數(shù)變化;荷載化-DC的膚的濃度為lOiig/mL提取的總RNA; 圖11為在CpG ODN 1826佐劑存在下抗原祀向到Clec9a刺激CTL priming結果，其中(A) 多膚免疫方案，皮下注射多膚(WH-0VA/ 0VA257-264/WH/GA-0VA，IOOiig/只）和30yg CpG ODN佐劑，每隔7天免疫一次，共免疫3次；（B)IFN-丫含量，3次免疫后的第5天用lOiig/mL OVA 257-264再刺激脾細胞的上清，用化ISA檢測上清中IFN- 丫的量；（C)胞內(nèi)IFN- 丫乂D8+T的頻率， 利用胞內(nèi)因子染色的方法檢測IFN-丫+CD8巧的頻率，左圖為流式代表圖，右圖是每組5只小 鼠的IFN- 丫乂D8+T的頻率統(tǒng)計圖；（D)和(E)分別是perforin和Grz B mRNA的相對變化量； 圖 10、11 中，表示pCO.Ol，"***"表示pCO.OOl。
【具體實施方式】
[0017]下面結合實施例對本申請做進一步介紹說明，在介紹具體實施例前，對本發(fā)明中 所設及部分實驗試劑、實驗設備、實驗材料等情況簡要介紹如下。
[001引主要試劑： IOOmM丙酬酸鋼、IOOmM谷氨酸鋼、100 X非必需氨基酸、鹽酸四環(huán)素 (Tet)、牛血清白 蛋白（BSA)、Hepes，Sigma-Aldrich; Mouse FltSL recombinant proteiruProtein Transport Inhibitor Cocktail(500 X)、Streptavidin-PE、Anti-mouse Clec9a-PE(Clone: 42D2)、Anti-mouse CDllc-APC (Clone: N418)、Rat IgGl K Isotype control PE(Clone: eBRGl)、Rat IgGl K Isotype control APC(Clone: eBRGl)、Anti-mouse CD8a-APC(Clone: 53-6.7)、Anti-mouse CD8a- PE(Clone: 53-6.7)、Anti-mouse CD3-Pe;rCP-F10ur 710(Clone: 17A2)、Anti-mouse V alpha 2 TCR-FITC(Clone: B20.1)、Anti-mouse IFN-丫 -APC(Clone: XMG1.2)、Anti- mouse IFN-丫（Capture Antibody)、Anti_mouse IFN-y biotin(Detection Antibody)、 mouse IFN-丫 protein(Standard Protein)、Avidin-HRP(Enzyme)、I XTMB Solution (Substrate)、5XE：LISA/ELISP0T Dilution Buffer'lOXCoating Buffe;r、F(ab'）2 Anti- Mouse IgG PE(Polyclone),ebioscience; Anti-mouse Clec9a antibody，R&D System； Recombinant Murine GM-CSF、Recombinant Murine IL-4，PEPR0TECH; Fmoc 偶聯(lián)的氨基酸、Fmoc-Lys (biotin )-0H、Rink res in、Wang resin、HoI3t( I-徑基-苯 并S挫）、DIC，吉爾生化(上海)有限公司； PfxSOTM DNA polymerase、 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、2- Mercaptoethanol(55mM)，Invitrogen; 瓊月旨糖、IPTG(sopropyl P-D-1-thio邑曰I曰ctopyr曰noside)、X-邑曰I (5-Brom0-4-chlor0- 3-indolyl 0-D-galactopyranoside)，北京索萊寶有限公司 酵母粉、膜蛋白腺，OXOID Ph.D-12TM phage display peptide library kits、趾oI-HF限制性內(nèi)切酶、E.coRI- H邱良制性內(nèi)切酶、KpnI限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶和連接緩沖液、10 X化tSmad溶液，肥B; DMEM,Life technology； 胎牛血清(FBS) ,Biological Industries; 無內(nèi)毒素質(zhì)粒中提提取試劑盒，康為世紀； DNA表面分子，TakaRa; anti-FLAG ant化ody、一抗抗體稀釋液，碧云天； 羊抗兔二抗抗體，北京博奧森生物技術有限公司； HRP-Anti-MlS抗體，Sino-Biological company； RPMI 1640 medium、DMEM medium，Biological Industries； 膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、Total RNA Isolation Kit,鄭州貝貝生物有限公司； 常用培養(yǎng)基和溶液： 主要有LB培養(yǎng)基、頂層瓊脂、Xgal/IPTG溶液、LB/ IPTG / X-gal平板、Tet母液、LB-Tet 平板、0.1M NaHC03 (pH8.6 )包被液、0.2M G1 y-HC 1 (pH2.2 )洗脫液、封閉液、Tr i S-HC1 (抑9.1)中和液、TBS緩沖液（50mM Tr iS-HCl (pH7.5)，含有150mM化Cl)、TBST洗涂液、終止 液（2M 出S04)、PEG-8000/NaCl沉淀液、2.5M CaCb、2X皿S、FCS buffeW即含有2mM 邸TA和 0.05% Na化的PBS溶液(pH7.4))、PBS7.2溶液、0.25%膜酶、卡納抗生素儲存液化ana IOOmg/ ml)、化ISA wash buffeK即含有0.05% Tween-20的PBS7.2緩沖液）、ELISA終止液（即ImM 出P04溶液)等，均按現(xiàn)有技術制備即可，不再詳細描述； 主要儀器： AKTA 町ime、Superdex G200,GE 公司； 電泳儀，Bio-Rad; 切向超濾系統(tǒng)及IOKDa膜包，賽多利斯公司； 多膚合成儀，海南建邦制藥科技有限公司； UV2450型號分光光度計、RP-HPLC高效液相系統(tǒng)、制備柱，日本島津； 巧光定量PCR儀、酶標儀、Nano化op 2000 ,ThermoScientific; 凝膠成像系統(tǒng)，天能； FACS Calibur流式細胞儀，抓； 生物材料： 皿K-293T細胞、B16細胞、B16F10細胞、S180細胞、H22細胞、CT26細胞、C冊-Kl細胞，來 源于上海細胞庫； p3XFLAG-mClec9a-CTLD質(zhì)粒，化etano Reis e Sousa 教授惠贈； PIRES2-EGFP質(zhì)粒，生物風； E.COli D冊a感受態(tài)細胞、E.COli Xkl blue感受態(tài)細胞，實驗室自制； 巧7BL/6J小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；OT-I小鼠由王盛典教授惠贈 (中科院生物物理研究所）;所有實驗動物均為SPF動物，6~8周齡，飼養(yǎng)在獨立的IVC籠具內(nèi)； CpG ODN 1826、相關引物和測序工作均由北京金唯智生物工程有限公司提供和完成。 [0019]實施例1 由于隧菌體展示膚庫篩選前需要W相應蛋白為基礎，因而發(fā)明人制備了 mClec9a-CTLD 蛋白作為篩選前提，相關制備過程簡要介紹如下。
[0020] 第一，W憐酸巧轉(zhuǎn)染法將p3 X化AG-mClec9a-CTLD質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肥K-293T細胞，轉(zhuǎn)染后 采用含有0.3%FBS的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)至適當時間后，過濾，取上清，上清液中即 含有所表達的mClec9a-CTLD蛋白； 第二，采用Western Blotting對上清液中所表達的mClec9a-CTLD蛋白進行檢測，W確 保上清液中含有目的蛋白；分別對轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)40h和64h的上清液進行檢測，結果如圖1所 示，從圖中可W看出，上清液中均有mClec9a-CTLD蛋白的表達，另外，Western blotting驗 證結果表明，所表達的mClec9a-CTLD蛋白的分子量為18KDa，與理論分子量相符； 第S，利用Viva- flow200 10邸a的切向超濾系統(tǒng)對上清液進行濃縮，W提高上清液中 mClec9a-CTLD蛋白的濃度； 第四，利用anti-FLAG M2 Affinity Gel 親和含有3XFLAG標簽的mClec9a-CTLD蛋白， 進一步洗脫、透析后獲得初步純化和富集的mClec9a-CTLD蛋白； 第五，利用Superdex G200預裝柱進行分子篩純化獲得純度較高的mClec9a-CTLD蛋白， W便進一步用于隧菌體膚庫篩選工作。
[0021] 實施例2 W實施例1所制備的mClec9a-CTLD蛋白為基礎，利用固相隧菌體展示12膚庫篩選祀向 到mClec9a-CTLD蛋白具有高親和力的親和隧菌體，通過5輪的淘選，隧菌體得到富集，隨機 挑取第五輪洗脫下來的隧菌體進行測序，得到1條具有重復序列的親和隧菌體，命名為WH號 隧菌體。篩選過程按照肥B標準流程進行淘選，相關過程簡要介紹如下。
[0022] ( - )固相親和淘選流程 將實施例1所制備mClec9a-CTLD蛋白溶于0.1 M化肥03(p冊.6)包被液中，包被于96孔 板孔中，在密閉的濕盒中4 °C解育過夜；然后將包被液棄盡，加入含5%BSA的0 . IM NaHCOS (抑8.6)封閉液，濕盒中4 °C解育化;TBST buffer洗涂后，加入TBST稀釋的隧菌體，緩慢搖動 化，此過程中隧菌體會親和到祀蛋白mClec9a-CTLD上;親和過程結束后，采用TBST洗涂，并 采用0.2M的Gly-HCl洗脫液(pH2.2)進行洗脫，將含有隧菌體的洗脫液采用中和液中和后， 利用E. COli邸2738對隧菌體進行擴增(采用含0. l%Tet的LB液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng))和純化； 對擴增后隧菌體重復上述步驟進行淘洗，W最終獲得親合力最強的隧菌體。
[0023] 本發(fā)明中，利用固相隧菌體展示技術為篩選手段，WmClec9a-CTLD為祀蛋白，通過 不斷的"結合-洗涂-洗脫-擴增"的實驗流程，同時不斷增加洗涂強度，縮短隧菌體與祀蛋白 的結合時間來獲得親和力更強的隧菌體。篩選過程中，統(tǒng)計投入隧菌體的回收率(結果如下 表所示），結果表明，經(jīng)過5次反復淘選，隧菌體回收率逐漸增加，親和祀蛋白mClec9a-CTLD 的隧菌體得到富集，而且到第五輪時回收率略有下降，說明隧菌體已經(jīng)富集完畢，可W進行 后期的隧菌體克隆插入基因測序分析工作。
[0024] WmClec9a-CTLD為祀蛋白的固相淘選回收率結果，表中，回收率=洗脫隧菌體的數(shù) 目/投入隧菌體的數(shù)目；
&：*pfu：ph3ge formin邑 unitso [00巧](二)親和隧菌體克隆DNA序列測定和親和膚序列分析 對經(jīng)過5輪淘洗后親和的隧菌體克隆進行測序，測序時W96gIII為測序引物，由北京金 唯智生物科技有限公司進行測序，依據(jù)測序結果按照肥B隧菌體展示膚庫說明書推導獲得 插入基因的所編碼的氨基酸序列，即獲得與mClec9a-CTLD蛋白的具有較高親合力的親和膚 序列； 推導所獲得的WH膚氨基酸序列為:WPR即SSV即TH。
[0026] (S化LISA鑒定隧菌體克隆與蛋白mClec9a-CTLD的親和性 為確保淘洗過程中所獲得的隧菌體克隆的準確性，采用化ISA法對所獲得的隧菌體與 mClec9a-CTLD蛋白的親和性重新進行了檢測，過程簡要描述如下： 首先，將mClec9a-CTLD蛋白進行包被，并與隧菌體進行結合，相關過程參考前述固相親 和淘洗過程;在此過程中，設置包被祀蛋白mClec9a-CTLD并加入插入隨機氨基酸序列的M13 隧菌體克隆樣品作為陰性對照，設置只包被祀蛋白mClec9a-CTLD并且不加入任何隧菌體克 隆的TBST buffer作為空白對照； 其次，對親和結束后樣品采用含0.3% Tween-20的TBST進行洗涂，然后加入HRP-anti- Ml 3抗體，室溫振蕩化； 再其次，加入1 X TMB顯色15min，顯色結束后加入2M的肥S04終止反應； 最后，測0D450吸光度值，W0D450高于空白對照的2.1倍W上者定義為陽性克隆。結果 表明，篩選所得隧菌體與祀蛋白mClec9a-CTLD具有較好的親和力。
[0027] 實施例3 本發(fā)明主要介紹一下對實施例2篩選所獲得的WH多膚采用Fmoc固相合成法的人工制備 過程。
[002引化OC固相合成法制備W胡太時，首先溶脹樹脂，洗涂并脫保護后，將第一個Fmoc-氨 基酸和化化進行縮合，洗涂后測取代值，然后封頭，脫保護并洗涂后，巧檢確認脫保護完全， 然后縮合第二個氨基酸，重復上述步驟，直至多膚鏈合成完成;最后將合成完成的多膚鏈切 割并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，用乙酸沉淀獲得粗膚，再進一步通過冰乙酸洗涂和離屯、沉淀方式對粗膚 進一步純化，最后制得純度較高的WH多膚產(chǎn)品。詳細制備過程描述如下： (一) 縮合第一個氨基酸 1、 溶脹樹脂:稱取0.4g Rink resin倒入合成儀中，用適量的DMF溶脹30min(若樹脂為 Wang resin,DMF洗涂后直接進入步驟巧）； 2、 洗涂:加入DMF洗涂2次，每次洗涂2min; 3、 脫保護:加入脫保護液(含20%贓晚的DMF溶液)2次，每次脫保護15min; 4、 洗涂:依次加入W下洗涂液洗涂樹脂，DMF 2次-MeOH 3次-DCM 3次-DMF 2次，每次洗 涂2min; 5、 縮合:將第一個化OC-氨基酸和化化用少量的DMF溶解，加入到合成儀中，IOmin后加 入2.5倍當量的01(：，震蕩1.化； 6、 洗涂:洗涂同步驟3; 7、 測定取代值:取1~1.5mg烘干后樹脂，加入3mL脫保護液，震蕩IOmin，在29化m處讀取 吸光度值;取代值=樣品0D29日值/(1.65 X樹脂質(zhì)量）,Rink resin或者Wang resin都是高取 代值樹脂，取代值都應在0.5 W上； 8、 封頭：用封頭液（乙酸酢/化晚溶液1:1)封掉沒有縮合氨基酸的樹脂，封頭3次， 15m in/次； 9、 洗涂:洗涂過程同步驟4; (二) 添加后續(xù)氨基酸 10、 脫保護:加入脫保護液，脫保護2次，20min/次； 11、 洗涂:洗涂過程同步驟4; 12、 巧檢:取少許樹脂于巧檢管中，滴加 Kaiser Test溶液，沸水浴中2min，樹脂成藍色 (除Pro,化S和Ser脫保護后成紅棟色)說明脫保護完全，否則需要重復脫保護； 13、 縮合氨基酸:按照取代值計算需要添加的氨基酸和化化，待完全溶解后加入到合成 儀中，加入DIC，震蕩2~2.化； 14、 洗涂:洗涂過程同步驟4; 15、 巧檢:巧檢方法同步驟12,巧檢后若樹脂呈亮黃色，且樹脂無藍色斑點，則說明縮合 完全，若出現(xiàn)大量藍斑，需要重新縮合此氨基酸； 16、 重復步驟10~15至整條膚連制備完成； (=)切割和純化多膚 17、 脫保護：同步驟10; 18、 洗涂:洗涂過程同步驟4; 19、 巧檢：同步驟12; 20、 切割:配置切割試劑51111^82.5%了。4,5%(1地20,5%苯酪，5%苯甲硫酸和2.5%乙二硫 醇），混合均勻后，倒入合成儀中，緩慢攬拌切割化;待反應完成后，抽濾切割反應溶液于= 角瓶中，用適量的DCM洗涂樹脂3次，與抽濾液混合于圓底燒瓶中；此步驟在通風廚中進行； 21、 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā):用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除低沸點的溶液如TFA，DCM等，待溶液成為粘稠狀時(若 有膚鏈中含有切割的側(cè)鏈保護基團時，如Pbf基團和Boc基團，需要加入5mL TFA和少量的 DCM在冰上冰切30min，而后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)），加入1/3燒瓶體積的無水乙酸，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)5次； 22、 乙酸沉淀:加入100血冰鹽浴的無水乙酸，沉淀粗膚40min; 23、 離屯、和洗涂:將步驟22中混合物2000rpm離屯、2min，棄上清，收集沉淀，再用新的冰 乙酸洗涂5次，W去除難揮發(fā)的切割試劑，若不洗涂或洗涂次數(shù)太少，粗膚里有難聞的乙二 硫醇和苯甲硫酸的氣味； 24、 自然揮發(fā)和標記:在通風楓中過夜揮發(fā)干燥，讓乙酸揮發(fā)干凈，稱量，標記，即得到 所制備的WH多膚產(chǎn)品。
[0029] 對所制備的WH多膚采用ESI-MS(高效液相色譜-質(zhì)譜）進行驗證，W驗證其分子量 是否正確。WH多膚理論分子量為1536.73,而從圖2中可W看出，其值為768.8(ESI-MS(M+ 2H)/2 or (M+H))，與預期結果符合較好，表明所制備的WH多膚符合預期，可W用于實際實 驗或應用研究。
[0030] 需要說明的是，為便于后續(xù)實驗研究，同樣采用固相合成技術，發(fā)明人制備了對照 膚GA膚(序列為:GAGAAGGAGGGG)和0VA2日7-264表位膚(SIIN陽KL)，同時制備了在簇基端含有- GGGKbiutin的GA膚和WH膚的衍生物，另外制備了由連接子（3個甘氨酸，-GGG-)連接的含有 0VA257-264 表位膚 WH 膚和 GA 膚的衍生物 WH-OVA(WH-GGG-SIINFEK)和 GA-〇VA(GA-GGG- SIIN 陽 KU。
[0031] 實施例4 W實施例3所制備的W胡太為基礎，對其進行了進一步地親和實驗和抗原交叉呈遞實驗， 親和實驗主要是通過對所制備的WH膚與表達Clec9a的DC細胞的親和程度來檢驗WH膚的親 和性，抗原交叉呈遞實驗主要是通過對所制備的W胡太與過表達Clec9a蛋白的細胞系的親和 程度來驗證W胡太與Clec9a蛋白間的依賴性，相關實驗過程簡要介紹如下。
[00創(chuàng)（一咸和實驗 由于足夠量的表達Clec9a的DC細胞的獲得是相關實驗開展前提，因而首先需要誘導DC 細胞表達Clec9a蛋白。常規(guī)誘導DC的方法有巧巾，一種是利用GM-CSF/化-4聯(lián)合誘導的骨髓 來源的DC，稱之為GM-DC;另一種是由Fl口L誘導骨髓來源的DC，稱之為淋己系來源的DC(Fk DC)。流式細胞檢測表明，只有化-DC上表達Clec9a，而在GM-DC上不表達，相關實驗過程詳細 介紹如下： 1、化-DC的誘導（即獲得表達Clec9a的DC細胞） (1) 獲得骨髓來源的DC:脫頸處死巧7BL/6J小鼠，在75%的酒精中浸泡5~IOmin，用無菌 的眼科剪和綴子，解剖小鼠，取其大腿骨和腔骨，去凈其附屬肌肉，在75%的酒精中浸泡骨頭 Imin，用無菌的PBS沖洗骨頭； 在骨頭關節(jié)處剪斷，用ImL注射器吸取無血清的RPMI1640培養(yǎng)基，將針頭鉆進骨頭空 腔，推動注射器，沖出骨髓，骨頭空腔由紅色變成白色，將所有骨髓沖洗干凈； 用70yM的濾網(wǎng)過濾，去掉其較大的組織或骨頭； 4°C、150化pm離屯、5min，棄上清，加入2血紅細胞裂解液，用移液器吹勻，4°C裂解5min; 4°C、ISOOrpm離屯、Smin，再用10血的PBS7.2洗涂2次； 加入10血含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，重懸，細胞計數(shù)，調(diào)成3X 106cells/mL鋪到 無菌的一次性菌用培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)； (2) 誘導化-DC:加 Flt化細胞因子，終濃度為200ng/mL，而后每4天半量換培養(yǎng)液一次 (即化巧和化y9)，并補加 Fl 口 L細胞因子，培養(yǎng)至10天~12天用于實驗； (3)流式檢測化-DC上Clec9a蛋白的表達情況 獲取誘導的化-DC，用FCS buffer洗涂，并計數(shù)巧X l05cells/test); 流式抗體標記：用10化L的FCS buffer重新細胞，用大鼠血清4°C封閉15min后，加入 anti-CDl Ic-APC抗體，而后加入Rat IgGl K -PE，4°C 解育30min; 用FCS buffer洗涂2次，流式檢測，W確定化-DC上Clec9a蛋白表達情況。
[0033] 流式檢測結果如圖3所示，從圖中可W看出，F(xiàn)lt化成功誘導骨髓來源的化-DC表達 了 mClec9a，因此可利用化-DC替代CD8a+DC來研究多膚祀向性和體外交叉遞呈活性研究。
[0034] 、流式檢測WH膚與化-DC的親和性 獲取誘導的化-DC，用FCS buffer洗涂，并計數(shù)巧X l〇5cells/test); 用90化的FCS buffer重懸細胞，加入10化ImM生物素化WH膚至終濃度為100iiM，4°C解 育30min; 用FCS buffer洗涂2次，洗去非特異性結合； 加入 anti-CDl Ic-APC 抗體和 Str 邱 tavidin-PE，4°C 解育 30min; 用FCS buff er洗涂2次，流式檢測。
[0035] 檢測結果如圖4所示，從圖中可W看出，只有W胡太能夠親和化-DC，其余的膚不具有 親和化-DC的能力化A作為對照膚，參考實施例3步驟自行制備，序列為GAGAAGGAGGGG)。
[0036] 、流式檢測WH膚與過表達mClec9a蛋白的HEK-293T細胞的親和性 為了進一步確認WH膚與化-DC細胞的親和性依賴于mClec9a蛋白的表達，因而發(fā)明人制 備了pIRES2-mClec9a重組質(zhì)粒并將其過表達于皿K-293T細胞中，然后進一步通過流式細胞 檢測方法檢測WH膚與過表達mClec9a蛋白的皿K-293T細胞間的親和性，相關實驗過程介紹 如下。
[0037] (1)獲取cDNA:由于mClec9a主要表達脾臟中的CD8a+DC上，因此W脾臟的總RNA為 模板，再利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成CDNA，用于后續(xù)構建mCl ec9a載體。
[003引（2)構建pIRES2-mClec9a重組質(zhì)粒：W上述所制備的CDNA為模板，進行PCR擴增獲 得mClec9a基因序列，PCR擴增時引物序列設計如下： 正向引物:5 ' -CCCTCGAGATGCATGCGGAAGAAATATATACCTC-3 '（其中 TCGAG部分為趾OI 酶切 位點）； 反向引物:5 '-CGGAATTCTCAGATGCAGGATCCAAATGC-3'（其中GAATTC部分為E. coRI酶切位 點）； 對PCR擴增獲得的mClec9a目的條帶進行1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠并回收目的片段； 對切膠回收目的片段和PIRES2-EGFP質(zhì)粒分別采用趾Ol-HF和E. CORI-HF進行雙酶切， 酶切產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收； 將回收酶切產(chǎn)物采用DNA連接酶進行連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. COli DH5a感受態(tài)細 胞，LB液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，卡那霉素抗性篩選，并進行雙酶切驗證，驗證正確的質(zhì)粒再進 行測序驗證； (3) 轉(zhuǎn)染:將步驟(2)中測序驗證正確質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肥K-293T細胞，并進行mClec9a蛋白的表 達(同時設置轉(zhuǎn)染PIRES2-EGFP的空質(zhì)粒作為對照）； (4) 檢巧U:檢測步驟參考上述WH膚與化-DC親和性檢測步驟。
[0039] 結果如圖5所示。從圖5中可W看出，WH膚不親和EGFP+293r°ek (轉(zhuǎn)染PIRES2-EGFP 的空質(zhì)粒)細胞，但是WH膚能夠親和到肥K-293T UeeSa(轉(zhuǎn)染piRES2-mClec9a重組質(zhì)粒)上， 因而可W認為WH膚能夠特異性的親和到表達mClec9a的細胞上。
[0040] 、WH膚的親和特異性 基于上述實驗可W看出，WH膚能夠特異的親和mClec9a蛋白或表達mClec9a的細胞系， 那么對于不表達mClec9a的細胞系能否親和則需進一步實驗驗證。
[0041] 為了驗證W胡太與mClec9a蛋白親和的特異性，發(fā)明人檢測了 W胡太與鼠源細胞系或 中國倉鼠細胞的親和性，細胞系包括腫瘤細胞株(816,816斗10，別26,5180和肥2)、巨隧細 胞株(RAW264.7)和非鼠源的細胞株(C冊-K1);相關實驗操作參考前述WH膚與FkDC親和性 檢測步驟。
[0042] 具體結果如圖9所示。由于運些細胞株都不表達mCl ec9a，從圖中可W看出，運些細 胞株與W胡太只有微弱的親和性。運一結果說明W胡太與mClec9a蛋白具有很好的特異性。
[0043] (二)抗原交叉呈遞實驗 由于mClec9a是一個內(nèi)吞性的受體，祀向到mClec9a后能夠引起mClec9a的內(nèi)吞效應和 交叉遞呈作用。為了驗證運一特性，發(fā)明人將刪拔通過連接子(-GGG-)將與0VA2日7-26康位相 連，與化-DC解育后，再與來源于OT-I小鼠的CD8+T細胞解育，W此來檢測WH膚的交叉遞呈作 用。相關實驗過程簡要介紹如下。
[0044] a)FレDC荷載peptide-OVA或者對照膚：獲取誘導第12天的化-DC，用無血清的 RPMI1640培養(yǎng)基洗涂2次；將l化g/mL的WH-0VA、GA-0VA、WH膚和0VA257-264膚與2X105的化- DC在4 °C解育1.化，同時設立不荷載膚的化-DC組;解育完后，150化pm離屯、5min，洗涂2次后， 計數(shù)調(diào)成IO5CellsAiL備用；需要說明的是，相關膚或其衍生物(WH-〇VA、GA-〇VA、WH膚和 0VA257-264膚)參考實施例3制備步驟制備或按現(xiàn)有技術制備即可； (2) 分選獲得來源于OT-I小鼠的CD8+ T細胞:脫頸處死OT-I小鼠，取其脾臟和淋己結 (腹股溝、蔽下和面部淋己結），參考EasySepTM mouse naive CD8+T細胞分選試劑盒說明 書，分選得到的CD8+T細胞； (3) CFSE標記CD8+T細胞:對步驟(2)中分許得到的CD8+T細胞進行CFSE標記，并最終調(diào) 節(jié)細胞密度為lXl〇6 cells/mL備用； (4) 荷載膚的化-DC與CD8+T細胞的共解育：將步驟(3)中CFSE標記（染色）的CD8+T細胞 鋪于96孔板中，按化-DC: CD8+T細胞=1:10(數(shù)量比）的比例，加入步驟（1)中荷載膚的化-DC， 二氧化碳培養(yǎng)箱中37 °C培養(yǎng)72h; 培養(yǎng)結束后，利用CFSE標記來檢測T細胞的增殖，采用化ISA法對細胞培養(yǎng)的上清液中 的IFN-丫的量進行檢測，利用qRT-PCR檢測perforin和Grz B mRNA的相對表達量。
[0045] 相關實驗結果如圖10所示。對于相關結果簡要解釋如下。
[0046] 由于CFSE是一個小分子化合物，能夠穿透細胞膜，在細胞內(nèi)能夠與細胞骨架蛋白 相偶聯(lián)，形成穩(wěn)定的化合物，發(fā)出巧光，并且能夠隨著細胞的增殖將巧光平均分配到兩個子 細胞中（CD8+ T細胞分裂是平均分裂），故CFSE可W用來標記細胞的增殖。從圖IOA可W看 出， 與對照組GA-OVA組相比，WH-OVA能夠強烈刺激naive T細胞的增殖;作為陽性對照膚 0VA2日7-264,由于能夠直接與MHC class I分子結合，能夠直接刺激T細胞的增殖;而陰性不帶 有抗原的膚或空載的DC則不具有刺激T細胞的增殖能力。運一結果表明，W胡太祀向DC后，能 夠?qū)⒖乖庸ず蟠碳細胞的增殖。
[0047]為了驗證T細胞的功能，進一步檢測了培養(yǎng)液上清中IFN- 丫的含量。結果表明，WH- OVA組刺激T細胞分泌IFN- 丫的含量達到了4.5ng/mL，非常明顯的高于GA-OVA組和陽性 0VA257-264組，運一結果表明，WH-OVA能夠強烈的刺激T細胞并且激活了T細胞，并導致其分泌 大量的IFN-丫。
[004引對T細胞兩個殺傷性分子（即穿孔素 perforin和顆粒酶granzyme B)在mRNA水平上 的表達水平的檢測結果表明，WH-OVA組明顯的刺激了peWorin和Grz B mRNA的表達， perforin的量高于GA-OVA約3.5倍，而GrZ B高于對照組的5倍。
[0049] 綜上結果可W看出，WH膚能夠作為一個運載體將抗原運載到DC，而后由DC加工遞 呈給特異性的CTL細胞，刺激CTL細胞(細胞毒性淋己細胞，巧totoxic T Iympho巧tes)分泌 因子和提高T細胞殺傷性分子mRNA的表達。
[0050] (S)WH膚與mClec9a相互作用模式分析 發(fā)明人對W胡太與mClec9a的相互作用模式進行了進一步分析，相關分析過程及結果簡 要介紹如下。
[0化1]二級結構分析： 利用陽P-FOLD Peptide St;ruc1:ure Prediction Server在線軟件生成了WH膚的二級 結構，從結果可W看出，W胡太是一個a螺旋結構。
[0052] 空間作用模型分析： 利用In Silico的方法，通過加氨、缺失片段修補和質(zhì)子化等優(yōu)化手段，生成了mClec9a (UniProt?。篞8B抓4)的3D空間結構，然后通過ZDOCK將50個WH膚的二級結構與mClec9a進 行分子對接，模擬，從而產(chǎn)生了 50個WH膚可能與mClec9a的復合物結構（WH-Clec9a complexes)。
[0053] 對運50個復合物結構進行統(tǒng)計，結果如圖6所示。從圖中可W看出，大部分W胡太對 接到mClec9a的Sl區(qū)和S2區(qū)，Sl區(qū)：R 1日4，E 1日6，M 1日7，N159，Iis日，Sisi，k163，s164，k167， 〔247，口248 和胖25〇說區(qū)：6153，胖155，1("1如94,5249 和￥252。
[0054] 基于上述分析，可W進一步進行單氨基酸突變W對W胡太與mClec9a蛋白的具體的 親和區(qū)域進行分析。為便于分析，選取了 W胡太與Sl區(qū)和S2區(qū)相互作用最多的7個氨基酸殘基 進行丙氨基酸替換(RiM,Wiss,Miw Jiw,D248，W25哺Y252)，相關實驗過程簡要介紹如下。
[0055] 對mClec9a進行單個氨基酸突變時主要利用Quich化ange的方法進行，過程為:設 計特定引物（引物設計原則為:對突變前后的堿基各取20~30個堿基，前后堿基片段GC含量 打分在60~70之間，且相差不超過2°，并且兩邊都是WG/C堿基結尾），PCR擴增時將mClec9a 的單個氨基酸的堿基替換成丙氨酸的密碼子（GCX，X為任意堿基），然后再WpIRES2- mClec9a重組質(zhì)粒為模板，擴增含有突變的載體;利用KpnI酶將pIRES2-mClec9a進行酶切， 并轉(zhuǎn)化含有卡納霉素抗性的平板(轉(zhuǎn)化怎.化-1 Blue),最后測序驗證其質(zhì)粒的正確 性，驗證正確質(zhì)粒再轉(zhuǎn)染皿K-293T細胞;具體操作可參考前述pIRES2-mClec9a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染HEK-293T細胞的相關過程。
[0056] 對單個氨基酸突變后所表達的mClec9a蛋白與W胡太親和性進行檢測，結果如圖7所 示。從圖7中可W看出，當mClec9a的D248和突變成Ala時，大大削弱了WH膚親和Clec9a+ HEK-293T細胞的能力，而其他的突變對于WH的親和性影響不大。
[0057] 基于上述結果，再通過In Silico方法分析D248和與W胡太親和相互作用的氨基 酸，其中與W胡太作用的氨基為Arg3,陸e4，Ser7,化I 8和T虹11;而D248與W胡太作用的氨基 為Arg3和Phe4。進而利用計算機模擬了mClec9a與W胡太相互作用的示意圖，結果表明，它們 原子之間的距離小于4.5A。相關模擬圖如圖8所示。運一結果表明，W胡太的第S位的Arg和第 四位的Phe在親和Clec9a中起著非常重要的作用，換言之，mClec9a的D248和W25D是W胡太親和 mClec9a的關鍵殘基。
[0化引實施例5 基于實施例4的體外親和性研究和抗原交叉遞呈實驗結果，可W看出，W胡太具有很好的 祀向性，具有祀向運輸功能W及攜帶抗原、誘導抗原的交叉遞呈能力，而對其在生物體內(nèi)的 祀向性、免疫活性W及是否能夠增強抗原的抗腫瘤活性尚需進一步實驗檢驗。相關實驗過 程簡要介紹如下。
[0化9] (一）Wra CTL priming 為進一步研究WH膚偶聯(lián)抗原能夠在體內(nèi)也具有刺激CTL priming的能力，將不同的膚 通過皮下免疫小鼠3次（圖11A)，而后再在體外刺激脾細胞5天后，觀察CTL priming的一系 列指標的變化情況:上清IFN-丫、胞內(nèi)IFN-丫 W及T細胞殺傷性分子pe計orin和Grz B mRNA 的相對表達量。相關實驗過程如下所述。
[0060] 選取6~8周齡的巧7BL/6J小鼠，每組5只；尾基根部皮下多點注射多膚藥物和CpG ODN 1826，每隔7天給藥一次，給藥3次，實驗分別設W下5組： NS組： 生理鹽水組(NS)+ SOiig/只CpG 0DN1826; WH-OVA組： IOOiig/只 WH-OVA+ SOiig/只CpG 孤N1826; WH組： IOOiig/只 WH + SOiig/只CpG 0DN1826; 0VA257-264組：IOOiig/只0VA257-264+30yg/只CpG 孤N1826; GA-OVA組： IOOiig/只 GA-0VA+30yg/只CpG 孤N1826; 3次免疫后的第五天，處死小鼠，取其脾臟，研磨，裂紅，洗涂并計數(shù)； 將細胞密度調(diào)整為5 X 106cells/mL，取5mL細胞鋪于6孔板中，用lOiig/mL的0VA2日7-264膚 刺激5天； 取其上清保存于-80°C冰箱，ELISA檢測IFN- 丫的含量(0VA257-264抗原膚刺激5天后脾細 胞的上清）。誘導的細胞一部分用于檢測胞內(nèi)的IFN-丫，另一部分提取總RNA，檢測perforin 和G口 S的mRNA的相對表達量。
[0061 ]需要說明的是，為確定特異性的IFN- 丫 +CD8+T細胞的頻率，還利用胞內(nèi)因子染色的 方法檢測了 IFN- T的相對含量，W間接的反應特異性CTL的含量，相關實驗過程為： (1) 加入阻斷劑:將培養(yǎng)第五天前的7~IOh的細胞收集，調(diào)整細胞密度為2 X IO6Cells/ mL，取ImL加入化L SOOXprotein transport inhibitor cocktail,混合均勻放置于37°C 繼續(xù)培養(yǎng)7~l〇h;4°C、700g離屯、5min; (2) 表面分子染色：用100化的含有2%FBS的FCS buffer(PBS7.4)重懸，加入anti-CD3- PerCP-eflo腳710和anti-CD8a-PE，同時設立CD3單陽管和CD8單陽管在4°C解育30min;用 FCS buffer洗涂2次，4°C、700g離屯、5min; (3) 固定和破膜：用200化、I XFixation buffer重懸細胞，室溫固定30min;用200化I Xpermeablization wash buffer洗涂2次，4°C、700g離屯、5min; (4)IFN- 丫染色：加入anti-IFN- 丫 -APC抗體或者同型Rat IgG2a-APC，4°C避光解育 30min;利用1 Xpermeablization wash buffer洗涂2次，4°C、700g離屯、5min，并用400化 FCS buffer重懸，流式檢測。
[0062] 實驗結果如圖11所示。從圖11B中可W看出，與GA-OVA對照組相比，WH-OVA膚能夠 明顯的刺激細胞分泌大量IFN- 丫；通過胞內(nèi)IFN- 丫細胞因子染色，IFN- 丫陽性的細胞的頻 率明顯的高于GA-OVA組和0VA257-264組IFN- T 乂D8+T頻率，運表明祀向膚能夠明顯在體內(nèi)刺 激T細胞分泌IFN-丫（圖11C);另外CTL殺傷性分子pe計orin和Grz B較GA-OVA組明顯成倍 增加（圖11D、E);運一體內(nèi)免疫結果表明，WH膚能夠增強0VA2日7-264抗原刺激的CTL priming 的能力。
[0063] (二)治療性 B16-0VA 模型 基于mClec9a的抗腫瘤疫苗能夠?qū)⒖乖禺愳胂虻紺D8a+DC膜上誘導特異性的抗腫瘤 免疫反應，W胡太也是同樣能夠祀向到mClec9a上，那么抗原祀向能否刺激機體特異性的抗腫 瘤免疫應答則需進一步驗證。因此發(fā)明人建立了表達OVA蛋白的B16黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型， W驗證WH-OVA對B16腫瘤的治療性作用。具體實驗過程簡要介紹如下。
[0064] 培養(yǎng)B16-0VA細胞，消化，洗涂，將細胞密度調(diào)整為3 X IO6CelIs/mL選取6~8周齡 的C57BL/6J小鼠，每組5只，尾靜脈注射0.3mL B16-0VA細胞，即9 X IO5Cells/只，此時定義 為第0天； 荷瘤后的第3天，尾基根部皮下多點注射多膚藥物和CpG ODN 1826,每隔7天給藥一次， 給藥3次;實驗分別設W下5組： NS組： 生理鹽水組(NS)+ SOiig/只CpG 0DN1826; WH-OVA組： IOOiig/只 WH-OVA多膚 + SOiig/只CpG 0DN1826; WH組： IOOiig/只 WH多膚 + SOiig/只CpG 0DN1826; 0VA257-264組：IOOiig/只0VA257-264多膚+30yg/只CpG 0DN1826; GA-OVA組： IOOiig/只 GA-OVA多膚+30yg/只CpG 0DN1826; 給藥3次后的第五天，處死小鼠，取出肺，觀察各組的肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目； 同時取其脾臟，研磨，裂紅，洗涂并計數(shù)，將細胞濃度調(diào)整為5X106cells/mL，取5mL細 胞鋪于6孔板中，用1 Ojig/mL的0VA2日7-264膚刺激5天； 細胞培養(yǎng)上清保存于-8(rC冰箱，ELISA檢測IFN-丫的含量(0VA257-264抗原膚刺激5天后 脾細胞的上清）。誘導的細胞一部分用于檢測胞內(nèi)的IFN-丫，另一部分提取總RNA，檢測 perforin和Grz B的mRNA的相對表達量。
[0065] 同樣，為確定特異性的IFN-丫+CD8+T細胞的頻率，利用胞內(nèi)因子染色的方法檢測了 IFN-丫的相對含量，相關操作參考前述內(nèi)容。
[0066] 相關實驗結果可W看出，WH-OVA祀向膚的治療組腫瘤轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目明顯的低于 GA-OVA組;利用0VA2日7-264抗原膚再刺激脾臟5天后，WH-OVA組上清IFN- 丫的分泌量明顯高于 對照組，平均值約15ng/mL，也明顯的高于單獨0VA2日7-264組；與體內(nèi)多膚免疫實驗一致，WH- OVA組明顯的增加了perforin和Grz B mRNA的相對表達量。換言之，抗腫瘤實驗結果表明利 用祀向膚偶聯(lián)0VA257-264抗原膚能夠引發(fā)CTL反應，并且能夠明顯增強抗原的抗腫瘤活性； 良P，W胡太可W作為疫苗的運載體。
[0067]綜上所述，發(fā)明人在將0VA257-264抗原偶聯(lián)到WH膚后，通過3輪免疫實驗，可較好誘 導特異性CTL的應答，并且能夠刺激T細胞分泌大量的IFN-丫和提高T細胞殺傷性分子 perforin和Grz B mRNA的相對表達量。進一步的作為治療性腫瘤疫苗的實驗表明，可大幅 降低肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目，可W作為一種像抗體一樣的祀向載體，運載抗原，增強抗腫瘤免疫反 應。
【主權項】
1. 一種靶向Clec9a的親和肽WH肽，其特征在于，該肽包括12個氨基酸，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1所示，具體為：WPRFHSSVFHTH，即：Trp-Pro-Arg-Phe-His-Ser-Ser-Val-Phe-His-Thr-His 02. 權利要求1所述靶向Clec9a的親和肽WH肽的衍生物。3. 如權利要求1所述靶向Clec9a的親和肽WH肽的衍生物，其特征在于，與抗原偶聯(lián)。4. 如權利要求3所述靶向Clec9a的親和肽WH肽的衍生物，其特征在于，與抗原偶聯(lián)時采 用連接子為(GGGS)nC、GGSC或GGG，其中n=l~10。5. 如權利要求3或4所述祀向Clec9a的親和肽WH肽的衍生物，其特征在于，所述抗原為 OVA抗原。6. 權利要求1所述革El向Clec9a的親和肽WH肽的制備方法，其特征在于，通過Fmoc固相合 成法制備獲得。7. 權利要求1所述靶向Clec9a親和肽WH肽在腫瘤預防和治療中的應用。8. 如權利要求7所述靶向Clec9a親和肽WH肽在腫瘤預防和治療中的應用，其特征在于， 作為運載抗原的載體用于制備多肽疫苗。9. 如權利要求7或8所述靶向Clec9a親和肽WH肽在腫瘤預防和治療中的應用，其特征在 于，用于B16細胞所致腫瘤。
【文檔編號】C07K7/08GK105924501SQ201610272341
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月28日
【發(fā)明人】高艷鋒, 閆中義, 祁元明, 李國棟, 曹文鵬
【申請人】鄭州大學