一種與油脂含量相關(guān)的GhLPAAT5-like蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與酵母菌油脂含量相關(guān)的GhLPAAT5?like蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明的GhLPAAT5?like蛋白，是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)：a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；b)在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；c)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。通過實驗說明：本發(fā)明的GhLPAAT5?like基因具有提高酵母菌株總脂肪含量、棕櫚酸含量和硬脂酸含量的功能。
【專利說明】
-種與油脂含量相關(guān)的GhLPAATS-I ike蛋白及其編碼基因與 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種與油脂含量相關(guān)的化LPAATS-Iike蛋白 及其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 棉花是世界上最重要的纖維作物和主要的油料作物，棉子是商品棉的主要副產(chǎn) 物，約占子棉總產(chǎn)量的60%，棉子含油量占15.0%~48.7% (劉明等，1994;王彥霞等， 2011)，棉子油中含有大量的人體所必需的脂肪酸，其中油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸的含 量接近80% (宋俊喬等，2010)，使得棉子油具有較強(qiáng)的抗氧化能力。另外，棉子油與菜巧油 和花生油相比含有較高的維生素 E(王延琴等，2014)，維生素 E是一種抗氧化劑，能提高人體 抗細(xì)胞衰老的能力W及降低人體屯、腦血管疾病發(fā)生幾率等功效。此外，棉子發(fā)育時期的脂 肪酸組分不僅是決定其營養(yǎng)品質(zhì)的關(guān)鍵因素而且對棉花纖維的發(fā)育也有重要影響，研究發(fā) 現(xiàn)亞麻酸、棟桐酸在棉花纖維發(fā)育階段有重要調(diào)節(jié)作用(Wanjie et al. ,2005);超長鏈飽 和脂肪酸能促進(jìn)棉花纖維伸長(Qin et al. ,2007);棉花種仁油分與纖維整齊度指數(shù)，伸長 率呈顯著正相關(guān)(郭寶生等，2013)。上述研究結(jié)果表明棉子脂肪酸對棉纖維的發(fā)育具有促 進(jìn)作用。棉子油作為生產(chǎn)生物能源燃料也具有廣闊的應(yīng)用前景，石化柴油的碳鏈長度一般 在C15~C18之間，而棉子油中有99%的脂肪酸碳鏈長度集中在C16~C18之間，和柴油成分 極其相似，棉子油適合轉(zhuǎn)化生產(chǎn)為生物柴油，并且轉(zhuǎn)化為生物柴油的效率高達(dá)95%，另外棉 子油轉(zhuǎn)化而成的生物柴油富含氧而不含硫，因此可使生物柴油的燃燒更為徹底且不污染環(huán) 境(喻樹迅等，2008)。
[0003] 由于我國近10年種植面積從2004年的569.287萬公頃到2013年的434.563萬公頃， 總體呈現(xiàn)逐年下降的趨勢。因此通過利用基因工程手段提高單位面積上棉子的油脂含量， 是維持棉子油產(chǎn)量W至于提高棉花副產(chǎn)品利用效率的必由之路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是提供一種蛋白質(zhì)。
[0005] 本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)是如下a)或b)或C)的蛋白質(zhì)：
[0006] a)氨基酸序列是序列表中序列2所不的蛋白質(zhì)；
[0007] b)在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)； [000引C)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。
[0009] 其中，序列2由263個氨基酸殘基組成。
[0010] 為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或 簇基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[00川表1、標(biāo)簽的序列
[0012]
[0013] 上述c)中的蛋白質(zhì)，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不 超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0014] 上述C)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。
[0015] 上述C)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列1的第1-792位核巧酸序列中缺失一 個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5/端 和/或y端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
[0016] 本發(fā)明的另一個目的是提供與上述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料。
[0017] 本發(fā)明提供的與上述蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料為下述Al)至A12)中的任一種：
[001引Al)編碼上述蛋白質(zhì)的核酸分子；
[0019] A2)含有Al)所述核酸分子的表達(dá)盒；
[0020] A3)含有Al)所述核酸分子的重組載體；
[0021] A4)含有A2)所述表達(dá)盒的重組載體；
[0022] A5)含有Al)所述核酸分子的重組微生物；
[0023] A6)含有A2)所述表達(dá)盒的重組微生物；
[0024] A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；
[00巧]A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；
[0026] A9)含有Al)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0027] A10)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[00%] All)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；
[0029] A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。
[0030] 上述生物材料中，Al)所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：
[0031] 1)其編碼序列為序列表中序列1的第1-792位核巧酸分子；
[0032] 2)與1)限定的核巧酸序列具有75%或75% W上同一性，且編碼上述蛋白質(zhì)的CDNA 分子或基因組DNA分子；
[0033] 3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核巧酸序列雜交，且編碼上述蛋白質(zhì)的CDNA分子 或基因組DNA分子。
[0034] 其中，所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也可 W 是 RNA，如 mRNA 或 hnRNA 等。
[0035] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可W很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方 法，對本發(fā)明的編碼上述蛋白質(zhì)的核巧酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有編碼上 述蛋白質(zhì)的核巧酸序列75%或者更高同一性的核巧酸，只要編碼上述蛋白質(zhì)且具有相同功 能，均是衍生于本發(fā)明的核巧酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0036] 運(yùn)里使用的術(shù)語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本發(fā) 明的編碼序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核巧酸序列具有75%或更高，或85%或 更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核巧酸序列。同一性可W用肉眼或計算機(jī)軟件 進(jìn)行評價。使用計算機(jī)軟件，兩個或多個序列之間的同一性可W用百分比（％)表示，其可W 用來評價相關(guān)序列之間的同一性。
[0037] 上述75%或75% W上同一性，可為80%、85%、90%或95% W上的同一性。
[0038] 上述生物材料中，所述嚴(yán)格條件是在2XSSC，0.1 %SDS的溶液中，在68°C下雜交并 洗膜2次，每次5min，又于0.5 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68 °C下雜交并洗膜2次，每次 15min;或，0.1 X SS陽(或0.1 X SSC)、0.1 % SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0039] 上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、隧菌體或病毒載體。
[0040] 上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。
[0041] 上述生物材料中，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織和轉(zhuǎn)基因植物器官均 不包括繁殖材料。
[0042] 本發(fā)明還有一個目的是提供上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料的新用途。
[0043] 本發(fā)明提供了上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料在調(diào)控酵母菌總脂肪含量中的應(yīng) 用。
[0044] 本發(fā)明還提供了上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料在調(diào)控酵母菌脂肪酸含量中的 應(yīng)用。
[0045] 上述應(yīng)用中，所述調(diào)控為提高。
[0046] 本發(fā)明還提供了上述蛋白質(zhì)或上述相關(guān)生物材料在培育總脂肪含量提高和/或脂 肪酸含量提高的轉(zhuǎn)基因酵母中的應(yīng)用。
[0047] 本發(fā)明的最后一個目的是提供一種培育總脂肪含量提高和/或脂肪酸含量提高的 轉(zhuǎn)基因酵母的方法。
[0048] 本發(fā)明提供的培育總脂肪含量提高和/或脂肪酸含量提高的轉(zhuǎn)基因酵母的方法包 括如下步驟:將上述蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)胧荏w酵母中，得到轉(zhuǎn)基因酵母;所述轉(zhuǎn)基因酵母 的總脂肪含量和/或脂肪酸含量高于受體酵母。
[0049] 上述方法中，所述上述蛋白質(zhì)的編碼基因為序列表中序列1的第1-792位核巧酸分 子。
[0050] 上述方法中，所述受體酵母為畢赤酵母;所述畢赤酵母具體為畢赤酵母GS115。
[0051 ]上述應(yīng)用或上述方法中，所述脂肪酸為棟桐酸和/或硬脂酸。
[0052]本發(fā)明首先從棉花中克隆到了加 LPAATS-Iike基因，并在畢赤酵母中異源表達(dá) GliLPAAT5-l ike基因，得到轉(zhuǎn)(ihLPAAl'S-l ike酵母;分別用 BMGY 和BMMY 培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)(ihLPAATS- Iike酵母進(jìn)行2地誘導(dǎo)培養(yǎng)，然后用組織細(xì)胞甘油=醋酶法對誘導(dǎo)培養(yǎng)24h后的酵母菌體進(jìn) 行甘油S醋測定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化LPAATS-Iike酵母的油脂含量明顯高于野生型酵母菌株W及轉(zhuǎn) 巧ic9K酵母菌株。用氣相色譜法(Gas Qiromatogra地y，GC)測定轉(zhuǎn)CihLPAATS-Iike酵母的脂 肪酸含量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化LPAAT5-1化e酵母的棟桐酸(C16:0)含量和硬脂酸(C18:0)含量也明顯 高于野生型酵母GS115菌株及轉(zhuǎn)巧ic9K酵母菌株，說明本發(fā)明的趾LPAA巧-like基因具有提 高酵母菌株油脂含量的功能，具有良好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0化3] 圖1為化LPAATS-Iike基因的克隆。
[0054] 圖2為PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，Ianel和lane 2為目的片段；M: DL2000Marke;r。
[0055] 圖3為巧ic9K載體的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0化6] 圖4為巧ic9K-Aox: :(ihLPAAT5-like的PCR驗證。其中Jane 1和lane 5有目的片段 (紅色箭頭標(biāo)識）；M:DLSOOOMarker。
[0化7] 圖5為化ic9K-Aox: :(ihLPAAT5-like的酶切驗證。其中，lane 1和lane 5單克隆所 提質(zhì)粒含有目的片段(紅色箭頭標(biāo)識）;M:化2000Marker。
[005引圖6為轉(zhuǎn)趾LPAATS-Iike酵母單克隆的PCR檢測結(jié)果。圖6a為AOXl-F和AOXl-R引物 的鑒定結(jié)果，其中，M:DL2000Marker;lane 1:畢赤酵母GS115;lane 2~12:不同克隆。圖6b 為a-factor-F和AOXl-R 3'引物的鑒定結(jié)果，其中，M:DL2000Marker;lane 1:畢赤酵母 GSl 15; lane 2~12:不同克隆。圖6c為a-factor-F/AOXl-R 3 ' 引物和A0X1-F/A0X1-R引物對 轉(zhuǎn)巧i c9K酵母菌株巧i C9K/GS115的鑒定結(jié)果，其中，M: DL2000Marker。
[00別圖7為轉(zhuǎn)(ihLPAAT5-like酵母的RNA檢測。其中，M = MarkerIII ,lane 1:畢赤酵母 GS115，lane 2:轉(zhuǎn)化ic9K酵母菌株，lane 3、lane 4和lane 5分別代表轉(zhuǎn)(ihLPAAl'S-l化e酵 母陽性株5-2、5-11和5-12。
[0060]圖8為轉(zhuǎn)(ihLPAAT5-like酵母的RT-PCR檢測。其中，M = MarkerIII ,lane 1:畢赤酵母 GS115，lane 2:轉(zhuǎn)化ic9K酵母菌株，lane 3、lane 4和lane 5分別代表轉(zhuǎn)(ihLPAAl'S-l化e酵 母陽性株5-2、5-11和5-12。
[0061 ]圖 9 為(ihLPAAT5-like 純化蛋白的 SDS-PAGE 檢測。
[0062] 圖 10為(ihLPAAT5-like純化蛋白的Western Blot檢測。
[0063] 圖11為轉(zhuǎn)GhLPAATS-Iike酵母的總脂肪含量的檢測。其中，GS115為畢赤酵母 65115.65115- 91(為轉(zhuǎn)巧^91(酵母菌株，5-2、5-11和5-12均為轉(zhuǎn)(；化?4415-111?5酵母陽性株。
[0064] 圖12為轉(zhuǎn)GhLPAATS-Iike酵母的脂肪酸成分的檢測。其中，GS115為畢赤酵母 65115.65115- 91(為轉(zhuǎn)巧^91(酵母菌株，5-2、5-11和5-12均為轉(zhuǎn)(；化?4415-111?5酵母陽性株。
【具體實施方式】
[0065] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0066] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0067] 下述實施例中的定量試驗，均設(shè)置=次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。
[0068] 下述實施例中的KOD-Plus-Neo高保真PCR擴(kuò)增酶、Target Clone-Plus平末端加 A 酶、T4DNA Ligase和SYBR?Green Realtime PCR qRT-PCR巧光定量酶均是TOYOBO生物公 司的產(chǎn)品。
[0069] 下述實施例中的Gel Extraction Kit膠回收試劑盒是Omega生物公司的產(chǎn)品。
[0070] 下述實施例中的DNA Purification Kit PCR產(chǎn)物純化試劑盒、PrimeScriptTM ITTase RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒均是TaKaRa生物公司的產(chǎn)品。
[0071] 下述實施例中的DNA MarkerIII和GelStain邸替代物均是化ansGen生物公司的 產(chǎn)品。
[0072] 下述實施例中的RNApr邱pure植物總RNA提取試劑盒是Tiangen公司的產(chǎn)品。
[0073] 下述實施例中的RNApr邱pure酵母總RNA提取試劑盒是Promega公司的產(chǎn)品。
[0074] 下述實施例中所用的引物由北京GE肥WIZ生物公司合成。
[00巧]下述實施例中的大腸桿菌感受態(tài)菌體化scherichia coli)D冊a是上海生工的產(chǎn) 品。
[0076] 下述實施例中的限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI均是肥B公司的產(chǎn)品。
[0077] 下述實施例中的組織細(xì)胞甘油S醋酶是普利萊公司的產(chǎn)品。
[0078] 下述實施例中的瓊脂糖是全式金生物公司的產(chǎn)品。
[0079] 下述實施例中的AGPAT2抗體是上海研生公司的產(chǎn)品。
[0080] 下述實施例中的蛋白腺、酵母提取物、氯仿、異戊醇、乙醇、異丙醇、氯化鋼等為國 產(chǎn)分析純，5-漠-4-氯-3-嗎I噪半乳糖巧(X-gal)、異丙基-P-D-硫代化喃半乳糖巧（IPTG)和 氨節(jié)青霉素等均是寶生物工程大連有限公司的產(chǎn)品。
[0081] 下述實施例中的溶液的配制:本文中提到的但未列出的各種試劑均按《分子克隆 實驗指南》第=版上的方法配制，生化試劑為分析純或W上級。
[0082] 下述實施例中的LB液體培養(yǎng)基：膜蛋白腺（化yptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化鋼(化Cl)10g/L;LB固體培養(yǎng)基:膜蛋白腺lOg/L、酵母提取物5g/L、氯化 鋼lOg/L、瓊脂粉15g/L，定容至1L; LB選擇培養(yǎng)基:在LB鋪平板前，待培養(yǎng)基高壓滅菌冷卻至 55°C時加入相應(yīng)濃度抗生素，搖勻后鋪平板。
[0083] 下述實施例中的BMGY培養(yǎng)基：酵母提取物1 % (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、蛋白腺(Peptone)2 % (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、pH為6.0的憐酸鐘緩沖液(將K2HP化與K此K)4按照5.1:1的質(zhì)量比混勻得到的溶 液，其中，K2HPO4購買于aladdin公司，貨號：G1522036;KH2P04購買于sigma公司，貨號： P5655)、100mmol/L、YNB(購買于索萊寶公司，貨號為：Y8040)l.：34% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、生物素 (Biotin,購買于索萊寶公司，貨號為:D8150)(4X1(T5)% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、甘油(Glycerol)l% (體積分?jǐn)?shù)）。
[0084] 下述實施例中的腿MY培養(yǎng)基：酵母提取物1 % (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、蛋白腺(Peptone)2 % (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）、憐酸鐘緩沖液(pH6.0)100mmol/L、YNB1.34%、生物素(Biotin)(4X10-5)%、 甲醇（Methanol)0.5%。
[00化]下述實施例中的主要儀器：PCR擴(kuò)增儀（BIO-RAD)、高速離屯、機(jī)（Hettich MIKR0200R)、電泳設(shè)備(BIO-RAD)、凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)、巧光定量PCR儀(ABI7500)、真 空冷凍干燥儀(ALPHA 1-5)、酶標(biāo)儀(BI0-TEC KC4)。
[0086] 下述實施例中的棉花品種徐州142在文獻(xiàn)"佚名.棉花新品種徐州142[J].農(nóng)業(yè)科 技資料，1976(3)"中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院棉花研究所獲得。
[0087] 實施例1、棉花中(ihLPAAT5-like基因的克隆
[008引 URNA的提取
[0089] 取徐州142的根、莖、葉、花、蕾、下胚軸、不同發(fā)育時期的胚珠和纖維，并將所取材 料迅速投入液氮中冷凍，保存于-80°C冰箱備用。采用改良的CTAB法提取所取材料的總RNA， 總RNA提取采用TIANGEN公司試劑盒。
[0090] 2、CDNA 的獲得
[0091] W200ng步驟I獲得的總RNA為模板，采用TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為 CDNA，并將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物CDNA溶液稀釋4倍作為PCR反應(yīng)模板。
[0092] 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系見表1。反應(yīng)過程在PCR儀器內(nèi)先37°C溫育15min，然后85°C反應(yīng) 5s，最后-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0093] 親1、掉異化累
[0094]
[00巧]3、PCR擴(kuò)增
[0096] W步驟2獲得的cDNA為模板，采用(ihLPAAT5-like-F和(ihLPAAT5-like-R引物進(jìn)行 擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。引物序列如下：
[0097] (ihLPAAT5-l ike-F: 5^ATGTACCTGTGGGACCTTGC-3';
[009引（ihLPAAT5-like-R:5' -TTACAACAAAGTTGATATCTGAAAATAGC-3'。
[0099] PCR反應(yīng)體系如表2所示;PCR反應(yīng)條件如表3所示。
[0100] 表2、PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系
[0104] 4、(ihLPAAT5-like 基因的獲得[0105] PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4°C保存，用1 %的瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測，條帶大小
[0101] 12 2 符合預(yù)期設(shè)計的電泳結(jié)果如圖I所示。對目的片段運(yùn)用膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收，并將上 述膠回收的產(chǎn)物連接PMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，37°C過夜培養(yǎng)從抗性LB培養(yǎng)基上挑取 單克隆到60化L含有Amp的LB培養(yǎng)基中，37°C搖菌培養(yǎng)4h后進(jìn)行菌液PCR驗證，送含有目的基 因片段大小條帶的菌液測序。
[0106] 測序結(jié)果表明：PCR擴(kuò)增得到大小為IOlSbp的條帶，其核巧酸序列如序列1所示，將 序列1所示的基因命名為化LPAATS-Iike基因，自5'端1-792位為0RF，G化PAATS-Iike基因編 碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所不，將序列2所不的蛋白命名為化LPAATS-Iike 蛋白。
[0107] 實施例2、轉(zhuǎn)化LPAAT5-1 ike酵母的獲得及其功能驗證
[0108] 一、轉(zhuǎn)(ihLPAAT5-like 酵母的獲得
[0109] 1、巧ic9K-Aox: :(ihLPAAT5-like畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
[0110] (1)目的基因 ORF序列的擴(kuò)增
[0111] W實施例1中的步驟2獲得的CDNA為模板，采用In-GhLPAATS-Iike-F和In- GliLPAAT5-like-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即為目的基因 (ihLPAAT5-like的ORF 序列。引物序列如下：
[0112] In-(ihLPAAT5-like-F:5' -GGAATTCATGTACCTGTGGGACCTTGCAT-3'(含酶切位點(diǎn) EcoRI);
[。…]In-GhLPAATS-Iike-R: 5'- ATAGTTTAGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGAAGACTAGTTTTGACAAAGT-3'(含酶切位點(diǎn)No。）。
[0114] PCR反應(yīng)體系（50iil):2XPCR Buffer for KOD FX Neo 2化L、dNTP(2mM)10iiL、5' primer(lOiiM)化L、3'primer(10yM)化L、模板DNA IiiUKOD FX Neo(lU/ul)liiL、d地2〇 9化。
[0115] PCR反應(yīng)程序：98°C預(yù)變性5min;循環(huán)為98。(：變性1〇3,60。(：退火3〇3,68。(：延伸 Imin,共30個循環(huán)；68°C延伸5min。
[0116] PCR產(chǎn)物在1.8%瓊脂糖凝膠電泳，調(diào)節(jié)電壓至90V，電泳化，照相記錄電泳結(jié)果（圖 2)，在紫外燈下觀察，迅速切下目的條帶。用膠回收試劑盒回收目的片段，具體方法按試劑 盒說明書進(jìn)行。
[0117] (2)巧ic9K-Aox: :(ihLPAAT5-like的獲得
[0118] 用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI對上述步驟（1)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，回 收大小為792bp的目的片段，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI對化ic9K載體（圖3,購買于 Invi化Ogen公司，貨號:V175-20)進(jìn)行雙酶切，回收大小為9263bp的骨架載體，連接大小為 792bp的目的片段和大小為9263bp的骨架載體，16°C連接化(連接體系如表4)，得到巧ic9K- Aox::化LPAATS-Iike并對其進(jìn)行測序。
[0119] 測序結(jié)果表明：Ppic9K-Aox: :(ihLPAAT5-like為將序列1自5'端第1-792位所示的 DNA分子插入巧ic9K載體的EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)間，且保持化ic9K載體的其他序列不變得 到的載體。
[0120] 表4、目的基因與巧ic9K載體的連接體系
[0121]
[0122] (3)巧ic9K-Aox: :(ihLPAAT5-like的PCR驗證
[0123] 將上述步驟(2)獲得的連接產(chǎn)物巧ic9K-Aox::化LPAA巧-I化e轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，并 對其進(jìn)行PC閲金證。具體步驟如下：
[0124] a.超凈工作臺滅菌30min，從-70°C超低溫冰箱中取出10化L的感受態(tài)細(xì)胞，放于冰 上，預(yù)冷IOmin;
[0125] b.取出一個化管，標(biāo)上記號，置于冰上，加入SOiiL的感受態(tài)細(xì)胞(冰上操作）
[01 %] C.然后加入10化的連接產(chǎn)物，用移液槍吸打混勻后冰浴30min;
[0127] d.冰浴結(jié)束后，放在42°C的恒溫水浴鍋中熱激90s，然后迅速放入冰塊中，冰浴 2min;
[012引 e.吸50化L不含Amp的LB液體培養(yǎng)液到Ep管中，混勻，置于搖床中16化pm，37°C搖 Ih;
[01巧]f.取出搖床結(jié)束的化管，2000~3000rmp離屯、5min，棄上清30化L，剩余的菌液輕柔 吸打混勻后加在含Amp的LB固體培養(yǎng)皿中，用玻璃涂棒涂勻，涂干；
[0130] g.37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16~20h。
[0131] h.隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行PC閲金證。結(jié)果如圖4所示，從圖中可W看出，1和5號單克隆 獲得大小為989bp的條帶。PC閲金證所用引物序列為：
[0132] 日-化。1〇尸尸引物：5'-14口'41760：46〔4176口'6(：-3'；
[0133] 3'40乂1-巧|物：5'-60〔444160〔41'1'押64〔410：1'-3'。
[0134] i.將1和5號單克隆在含有Amp的LB培養(yǎng)基進(jìn)行20ml擴(kuò)繁，37°C條件下19化mp的搖 床過夜，提取質(zhì)粒后用EcoRI和NotI對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，得到酶切產(chǎn)物。酶切產(chǎn)物的電泳結(jié) 果如圖5,從圖中可W看出，1和5號單克隆的酶切產(chǎn)物均獲得了大小為79化P和9263bp的條 帶，證明得到陽性重組載體。
[0135] 2、轉(zhuǎn)(ihLPAAT5-like 酵母的獲得
[0136] (I)GS 115感受態(tài)細(xì)胞的制備
[0137] A、挑取活化后的畢赤酵母GS115(購買于Invitrogen公司，貨號為：ST1030)單菌 落，接種至含有5mL YPDA培養(yǎng)基的SOmLS角瓶中，30°C、300r/min，過夜培養(yǎng)。
[0138] B、取Iml的培養(yǎng)物接種至含有IOOmL新鮮培養(yǎng)基的SOOmLS角搖瓶中，30°C、300r/ min培養(yǎng)過夜，至ODso日達(dá)到I. I~1.3。
[0139] C、將細(xì)胞培養(yǎng)物于4°C，5000g離屯、lOmin，用50mL的冰預(yù)冷的無菌水將菌體沉重 懸。
[0140] D、同步驟C，用25mL的冰預(yù)冷的無菌水將菌體沉淀重懸。
[0141] E、同步驟C，用20mL的冰預(yù)冷的Imol/L的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸。
[0142] F、同步驟C，用ImL的冰預(yù)冷的Imol/L的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，制備成GS115 酵母感受態(tài)細(xì)胞。
[0143] (2)轉(zhuǎn)(ihLPAAT5-l ike 酵母的獲得
[0144] 將化ic9K-Aox::化LPAATS-Iike重組質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化至步驟（1)制備的新鮮的 GS115酵母感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組菌巧ic9K-Aox: :(ihLPAAT5-like/GS115。具體過程如下：
[0145] A、將已構(gòu)建好的化ic9K-Aox: :(ihLPAAT5-like重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SacI酶切 后，得到線性化DNA片段，膠回收所需要的片段后備用。
[0146] B、將IOng的線性化DNA片段溶解在20化的TE溶液中，與80化的新鮮GSl 15畢赤酵母 感受態(tài)細(xì)胞混勻，轉(zhuǎn)至0.2cm預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中。
[0147] C、根據(jù)電轉(zhuǎn)化儀說明書提供的資料，參考其他文獻(xiàn)及多次摸索，確定合適的電壓、 電流、電容、電阻等參數(shù)，按優(yōu)化的參數(shù)進(jìn)行電擊。
[0148] D、電擊完畢后，加入ImL冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)至1.5mL離屯、管中。
[0149] E、將I(K)化的菌體懸液涂布于MD平板上。
[0150] F、將平板置于3(TC培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)2-3天，至單菌落出現(xiàn)。
[0151] 按照上述方法，將巧ic9K載體轉(zhuǎn)化GS115酵母感受態(tài)細(xì)胞中，得到轉(zhuǎn)化ic9K酵母菌 株巧 ic9K/GS115。
[0152] (3)轉(zhuǎn)(ihLPAAT5-like 酵母的鑒定
[0153] 挑取酵母單克隆，在盛有ImL的YPDA培養(yǎng)基中30°C，300rmp/min過夜培養(yǎng)。分別用 A0X1-F、A0X1-R和日寸日(3*〇'斗、4(^-巧廣增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，如果兩 對引物在某一酵母單克隆中分別擴(kuò)增得到約1302bp和IOOSbp的條帶，說明化LPAATS-Iike 基因已整合到酵母基因組中，該酵母單克隆為轉(zhuǎn)化LPAA巧-1化e酵母陽性株。酵母陽性株篩 選引物序列：
[0154] 40乂1斗引物：5'-64口'6617〇：441764〔446(：-3'；
[0155]
[0156] 酵母陽性株篩選引物序列：
[0157] 日-化。1〇尸尸引物：5'-14口'41760：46〔4176口'6(：-3'；
[0158] 3'40乂1-巧|物：5'-60〔444160〔41'1'押64〔410：1'-3'。
[0159] 鑒定結(jié)果如圖6所示，圖6a為AOXl-F和AOXl-R引物的鑒定的結(jié)果；圖6b為a- factor-F和AOXl-R引物的鑒定結(jié)果，其中，M:DL2000Marker;l:對照酵母菌株（畢赤酵母 GS115); 2~12:不同克隆。從兩圖中可W看出，除4號單克隆外，其余11個轉(zhuǎn)趾LPAA巧-like 酵母均為轉(zhuǎn)化LPAAT5-1 ike 酵母陽性株系（5-2、5-3、5-5、5-6、5-7、5-8、5-9、5-10、5-11、5- 12)。
[0160] 轉(zhuǎn)化ic9K酵母菌株化ic9K/GS115的PCR鑒定結(jié)果和質(zhì)粒化ic9K對照的PCR鑒定結(jié) 果如圖6c所示，從圖中可W看出，兩者無顯著性差異。
[0161] 3、轉(zhuǎn)(ihLPAAT5-like酵母的誘導(dǎo)表達(dá)及RT-PCR檢測
[0162] (1)轉(zhuǎn)(ihLPAAT5-like酵母的誘導(dǎo)表達(dá)
[0163] 隨機(jī)選取S個陽性轉(zhuǎn)(ihLPAAl'S-like酵母菌株(5-2、5-11和5-12)、對照酵母菌株 (畢赤酵母GS115)和轉(zhuǎn)巧ic9K酵母菌株巧ic9K/GS115,分別接種至含20mL BMGY培養(yǎng)基的無 菌S角瓶。在搖床中30 °C，300巧m/min搖床生長至0〇6。。= 20-25(約24h)。室溫5000巧m離屯、 Smin，收集沉淀物，棄除上清，用50mL BMMY培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，30°C，300巧m/min搖床繼續(xù)培 養(yǎng)，隔12h加入甲醇至終濃度為0.5% (體積分?jǐn)?shù)），繼續(xù)誘導(dǎo)到24h，分別得到酵母菌體5-2、 5-11和5-12、對照酵母菌體和轉(zhuǎn)巧ic9K酵母菌體。
[0164] (2)轉(zhuǎn)(ihLPAAT5-like 酵母的 RT-PCR檢測
[0165] 用promega公司的酵母RNA提取試劑盒分別對步驟（1)獲得的酵母菌體5-2、5-11和 5-12、對照酵母菌體和轉(zhuǎn)化i c9K酵母菌體進(jìn)行總RNA的提取。將提取的RNA用濃度為1 %瓊脂 糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果如圖7所示，表明RNA質(zhì)量提取合格。將提取的各個酵母菌體的 RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并把反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物最終稀釋成化g/ul，W此為模版分別用巧光定量特異引物 RT-趾 LPAAl'5-likeF、RT-GliLPAAT5-likeRW 及內(nèi)參基因 18S 引物 RT-18SF、RT-18SR 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。引物序列如下：
[0166] RT-GhLPAAl'S-l ikeF: CGAGATCCCCTTTGGCTTGT;
[0167] RT-GhLPAAl'S-l ikeR: CAGGGTAACACGCCTGATGT;
[0168] RT-18SF:TTAGTTGGTGGAGTGATTTG;
[0169] RT-18SR:GGTGGCTCTGTCAGTGTAG。
[0170] 結(jié)果如圖8所示，其中，1號為對照酵母菌株(GS115)，2號為轉(zhuǎn)化ic9K酵母菌株，3、 4、5分別為轉(zhuǎn)化LPAATS-Iike酵母菌株5-2、5-11和5-12。從圖中可W看出：對照酵母菌株 GS115和轉(zhuǎn)化ic9K酵母菌株均沒有擴(kuò)增得到大小為285bp的條帶，說明對照菌株GS115和轉(zhuǎn) 巧ic9K酵母菌株中均沒有化LPAATS-Iike基因的表達(dá)，而轉(zhuǎn)化LPAATS-Iike酵母菌株5-2、5- U和5-12中均擴(kuò)增得到大小為28化P的條帶，說明轉(zhuǎn)化LPAATS-Iike酵母菌株5-2、5-U和5- 12中均表達(dá)了 (ihLPAAT5-like基因。
[0171 ]二、GhLP AATS-Iike 蛋白純化及 Western-blot 檢測
[0172] 1、酵母小量表達(dá)
[0173] A、挑取單克隆，接種至5ml BMGY中，28-30°C，250-300rpm搖至00600 = 2-6(對數(shù)生 長，大約16-18小時）。
[0174] B、室溫1500-3000g離屯、5min，收集細(xì)胞，去除上清，用BMMY重懸細(xì)胞至0D600 = 1.0,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)(大約25ml)。
[0175] C、每24小時，加甲醇至終濃度為0.5 % W繼續(xù)誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)2地和4她時，取Iml培養(yǎng) 基至1.5ml離屯、管。室溫用水平離屯、機(jī)最大轉(zhuǎn)速離屯、2-3min，收集菌體沉淀。
[0176] 2、酵母蛋白純化
[0177] A、酸洗玻璃珠高速震蕩破碎菌體。
[0178] B、按每克濕重菌體2~5ml平衡緩沖液的比例充分懸浮離屯、收集的菌體;600W功 率，每循環(huán)超聲5s，冷卻5s，循環(huán)99 X 3次，破碎菌體;4°C、ISOOOrpm離屯、15mim，收集上清液， 或用0.45]im濾膜過濾。
[0179] C、用10倍介質(zhì)體積緩沖液A過柱，平衡介質(zhì)(介質(zhì)為Ni瓊脂糖凝膠）；上樣；
[0180] D、用5~10倍介質(zhì)體積緩沖液A過柱，洗去層析柱中剩余上樣液并重新平衡介質(zhì)；
[0181] E、用5~10倍介質(zhì)體積緩沖液B洗脫，收集洗脫液，得到純化后的化LPAAT5-1 ike蛋 白，用SDS-PAGE檢測洗脫液中(ihLPAAT5-like蛋白的純度。
[0182] 結(jié)果如圖9所示:GhLPAATS-Iike蛋白大小為35Kda左右，與預(yù)測大小基本一致。
[0183] 3、Weste;rn blot檢測
[0184] 將LPAA邱兔抗體按照1: 200的比例稀釋后，對純化后的化LPAAT5-1 ike蛋白進(jìn)行 Western blot檢測。結(jié)果顯示所獲得的蛋白為化LPAAT5-like蛋白（圖10)。
[0185] S、轉(zhuǎn)化LPAATS-Iike酵母的總脂肪含量及脂肪酸成分含量的測定
[01化]1、轉(zhuǎn)化LPAATS-Iike酵母的誘導(dǎo)表達(dá)
[0187] 將S個陽性轉(zhuǎn)化LPAATS-Iike酵母菌株5-2、5-11和5-12、對照酵母菌株(畢赤酵母 GS115)和轉(zhuǎn)巧ic9K酵母菌株巧iC9K/GS115 (GS115-9K)分別接種至含20mL BMGY培養(yǎng)基的無 菌S角瓶。在搖床中30 °C，300巧m/min搖床生長至0〇6。。= 20-25(約24h)。室溫5000巧m離屯、 Smin，收集沉淀物，棄除上清，用50mL BMMY培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，30°C，300巧m/min搖床繼續(xù)培 養(yǎng)，隔1化加入甲醇至終濃度為0.5% (體積分?jǐn)?shù)），繼續(xù)誘導(dǎo)到2地，用50ml離屯、管在5000g的 離屯、機(jī)中離屯、Imin,分別收集沉淀菌體。用O.lmol/L的PBS緩沖液洗涂兩次菌體，最后放入 冷凍真空干燥儀進(jìn)行24h干燥，分別得到轉(zhuǎn)加 LPAATS-Iike酵母菌株5-2的菌體沉淀、轉(zhuǎn) 化LPAA巧-1 ike酵母菌株5-11的菌體沉淀、轉(zhuǎn)化LPAAT5-1 ike酵母菌株5-12的菌體沉淀、對 照酵母菌株的菌體沉淀和轉(zhuǎn)巧ic9K酵母菌株的菌體沉淀。
[018引2、總脂肪含量檢測
[0189] 采用組織細(xì)胞甘油S醋酶法測定試劑盒(購買于普利萊公司，貨號:E1013-105)并 按照試劑盒中的說明分別對步驟1獲得的轉(zhuǎn)化LPAAT5-1 i ke酵母菌株5-2的菌體沉淀、轉(zhuǎn) 化LPAA巧-1 ike酵母菌株5-11的菌體沉淀、轉(zhuǎn)化LPAAT5-1 ike酵母菌株5-12的菌體沉淀、對 照酵母菌株的菌體沉淀和轉(zhuǎn)巧ic9K酵母菌株的菌體沉淀中的脂肪含量進(jìn)行測定。
[0190] 結(jié)果如圖11所示:轉(zhuǎn)化LPAATS-Iike酵母菌株5-2的菌體沉淀、轉(zhuǎn)化LPAATS-Iike酵 母菌株5-11的菌體沉淀、轉(zhuǎn)化LPAATS-Iike酵母菌株5-12的菌體沉淀中的總脂肪含量分別 為112.2皿〇1/1，151.0皿〇1/1和110.2皿〇1/1，對照酵母菌株65115和轉(zhuǎn)化^91(酵母菌株的 菌體沉淀的總脂肪含量分別為74.3皿ol/L和96.0皿ol/L。轉(zhuǎn)(ihLPAAT5-l ike酵母菌株5-2的 菌體沉淀、轉(zhuǎn)化LPAATS-Iike酵母菌株5-11的菌體沉淀、轉(zhuǎn)化LPAA巧-like酵母菌株5-12的 菌體沉淀中的總脂肪含量與對照酵母菌株GS115的菌體沉淀相比，分別提高了51.0%、 103.2%和48.3 % ;轉(zhuǎn)(ihLPAAl'S-like酵母菌株5-2的菌體沉淀、轉(zhuǎn)(ihLPAAT5-l ike酵母菌株 5-11的菌體沉淀、轉(zhuǎn)化LPAATS-Iike酵母菌株5-12的菌體沉淀中的總脂肪含量與轉(zhuǎn)化ic9K 酵母菌株的菌體沉淀相比分別提高了 16.9%、57.3%和14.8%。
[0191] 3、脂肪酸成分含量檢測
[0192] 將步驟1獲得的轉(zhuǎn)化LPAA巧-1化e酵母菌株5-2的菌體沉淀、轉(zhuǎn)化LPAATS-Iike酵母 菌株5-11的菌體沉淀、轉(zhuǎn)化LPAAT5-1 ike酵母菌株5-12的菌體沉淀、對照酵母菌株的菌體沉 淀和轉(zhuǎn)化ic9K酵母菌株的菌體沉淀分別用研鉢研磨成粉末狀，取IOmg干菌體放入5mL具塞 離屯、管中，然后加入2(K)化的90~120°C的石油酸，在IOOW超聲波45°C的條件下浸提1.化;然 后加入100化的0.5mol/L的KOH-C出OH溶液，高速振蕩甲醋化;然后加入扣L飽和化Cl溶液， 400化pm離屯、IOmin后，將上清轉(zhuǎn)入1.5血進(jìn)樣瓶用Agi Ien巧890A氣相色譜儀對菌體中的脂 肪酸成分棟桐酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)的含量進(jìn)行檢測，檢測步驟參照文獻(xiàn)"張軍平，= 角褐指藻LPAAT基因在酵母中表達(dá)對脂肪酸的影響，2012"中的方法。色譜分析的參數(shù)具體 如下：色譜柱:DB-23毛細(xì)管色譜柱(60mX0.25mmX 0.25皿），柱溫采用程序升溫：100°C保 持Imin, W25°C/min速率升溫到175°C，再W4°C/min的速率升溫到230°C，保持2min;FID檢 測器溫度280°C ;進(jìn)樣口溫度250°C ;載氣為高純氮?dú)?純度99.999% )，流速30血/min;氨氣 流速40mL/min;空氣流速400mL/min;進(jìn)樣量1. 分流比60:1。其中，12.106保留時間對應(yīng) 的峰為棟桐酸(Cl6:0); 14.357保留時間對應(yīng)的峰為硬脂酸(Cl8:0)。
[0193] 結(jié)果如圖12所示:轉(zhuǎn)化LPAATS-Iike酵母菌株5-2的菌體沉淀、轉(zhuǎn)化LPAATS-Iike酵 母菌株5-11的菌體沉淀、轉(zhuǎn)化LPAATS-Iike酵母菌株5-12的菌體沉淀中的棟桐酸(C16:0)含 量分別為24.1%，18.6%和21.5%，對照酵母菌株GSl 15的菌體沉淀的棟桐酸含量為 15.6%，轉(zhuǎn)(ihLPAAT5-like酵母菌株5-2的菌體沉淀、轉(zhuǎn)(ihLPAAT5-like酵母菌株5-11的菌體 沉淀、轉(zhuǎn)化LPAATS-Iike酵母菌株5-12的菌體沉淀與對照酵母菌株的菌體沉淀相比，分別提 高了54.5%、19.0%和38.0%;轉(zhuǎn)(}化?4415-1146酵母菌株5-2的菌體沉淀、轉(zhuǎn)(；化?4415- Iike酵母菌株5-11的菌體沉淀、轉(zhuǎn)化LPAATS-Iike酵母菌株5-12的菌體沉淀中的硬脂酸 (C18:0)含量分別為44.6%，28.0%和27.9%，對照酵母菌株GSl 15的菌體沉淀中的硬脂酸 含量為20.6%，轉(zhuǎn)化LPAAT5-1 ike酵母菌株5-2的菌體沉淀、轉(zhuǎn)化LPAA巧-1化e酵母菌株5-11 的菌體沉淀、轉(zhuǎn)化LPAAT5-1 ike酵母菌株5-12的菌體沉淀與對照酵母菌株的菌體沉淀相比， 分別提高了 117.0%、36.1 %和36.0%。
[0194] 轉(zhuǎn)化ic9K酵母菌株的菌體沉淀中的棟桐酸含量和硬脂酸含量與對照酵母菌株的 菌體沉淀中的棟桐酸含量和硬脂酸含量無顯著性差異。
[01M]上述結(jié)果說明：本發(fā)明的化LPAATS-Iike基因具有提高酵母菌株總脂肪含量、棟桐 酸含量和硬脂酸含量的功能。
【主權(quán)項】
1. 蛋白質(zhì)，是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)： a) 氣基酸序列是序列表中序列2所不的蛋白質(zhì)； b) 在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)； c) 將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。2. 與權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)相關(guān)的生物材料，為下述Al)至A12)中的任一種： Al)編碼權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的核酸分子； A2)含有Al)所述核酸分子的表達(dá)盒； A3)含有Al)所述核酸分子的重組載體； A4)含有A2)所述表達(dá)盒的重組載體； A5)含有Al)所述核酸分子的重組微生物； A6)含有A2)所述表達(dá)盒的重組微生物； A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物； A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物； A9)含有Al)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系； A10)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系； Al 1)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系； A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的相關(guān)生物材料，其特征在于:A1)所述核酸分子為如下1)或2) 或3)所示的基因： 1) 其編碼序列為序列表中序列1的第1-792位核苷酸分子； 2) 與1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且編碼權(quán)利要求1所述的蛋白 質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子； 3) 在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的 cDNA分子或基因組DNA分子。4. 權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2或3所述的相關(guān)生物材料在調(diào)控酵母菌總脂肪 含量中的應(yīng)用。5. 權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2或3所述的相關(guān)生物材料在調(diào)控酵母菌脂肪酸 含量中的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求2或3所述的相關(guān)生物材料在培育總脂肪含量提 高和/或脂肪酸含量提高的轉(zhuǎn)基因酵母中的應(yīng)用。7. -種培育總脂肪含量提高和/或脂肪酸含量提高的轉(zhuǎn)基因酵母的方法，包括如下步 驟:將權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)胧荏w酵母中，得到轉(zhuǎn)基因酵母;所述轉(zhuǎn)基因 酵母的總脂肪含量和/或脂肪酸含量高于受體酵母。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述蛋白質(zhì)的編碼基因為序列表中序列1 的第1-792位核苷酸分子。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于:所述受體酵母為畢赤酵母。10. 根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的應(yīng)用或權(quán)利要求7-9中任一所述的方法，其特征在 于:所述脂肪酸為棕櫚酸和/或硬脂酸。
【文檔編號】C12R1/84GK105924512SQ201610545294
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年7月12日
【發(fā)明人】于霽雯, 馬建江, 王諾菡, 吳嫚, 裴文鋒, 翟紅紅, 李興麗, 張金發(fā), 喻樹迅
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所