Ror1特異性嵌合抗原受體及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種ROR1特異性嵌合抗原受體及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的ROR1特異性嵌合抗原受體，為自氨基端到羧基端依次由抗人ROR1的scFv、CD8α的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)、CD3ζ胞內(nèi)區(qū)串聯(lián)而成的蛋白質(zhì)。該嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞具有特異性殺傷作用，有望在各類實(shí)體瘤和血液腫瘤治療中得到廣泛應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】
R0R1特異性嵌合抗原受體及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物與醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種RORl特異性嵌合抗原受體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著腫瘤免疫學(xué)理論和技術(shù)的發(fā)展，過(guò)繼細(xì)胞免疫治療近年來(lái)取得了長(zhǎng)足的進(jìn) 步，W嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)修飾T細(xì)胞為代表的腫瘤祀向免疫 治療的成就尤為突出，在體外和臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的祀向性、殺傷性和持久性，展示了 巨大的應(yīng)用潛力和發(fā)展前景。雖然如此，但也存在腫瘤特異的祀抗原可選擇性不多，殺傷效 果不顯著，W及"細(xì)胞因子風(fēng)暴"、"脫祀效應(yīng)"等安全性問(wèn)題，因此研究廣譜、高效、安全的新 一代腫瘤祀向免疫治療方法是細(xì)胞免疫治療未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)和必須解決的問(wèn)題。
[0003] CAR-T治療的基本原理是通過(guò)使用特定生物工程方法使得體外培養(yǎng)的T細(xì)胞具有 一個(gè)針對(duì)祀分子的胞外單鏈抗體-跨膜蛋白-胞內(nèi)信號(hào)區(qū)的結(jié)構(gòu)，由于胞外的單鏈抗體直接 與腫瘤細(xì)胞上的祀分子作用，因此無(wú)MH邱良制性，大幅度提升過(guò)繼免疫治療的效果。CAR結(jié)構(gòu) 主要由膜外抗原結(jié)合區(qū)、較鏈區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)=部分構(gòu)成。膜外區(qū)是一段單鏈可變區(qū) 結(jié)構(gòu)域(SCFv)，具有特異性識(shí)別并結(jié)合TAA的功能；較鏈區(qū)通常是由免疫球蛋白超家族組 成，如CD8、CD28等;胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)主要是由CD3復(fù)合體中的a連組成。近年來(lái)，隨著研究的 深入，發(fā)現(xiàn)在胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)中加入共刺激分子如CD28或CD137,可W加強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫 瘤活性，因此，出現(xiàn)了第二代及第S代的CAR。表達(dá)CAR的T細(xì)胞可W直接識(shí)別并結(jié)合腫瘤細(xì) 胞表面的TAA，CA時(shí)尋信號(hào)傳入T細(xì)胞內(nèi)，促使T細(xì)胞合成并分泌細(xì)胞因子，如穿孔素、顆粒酶、 INF-丫和TNF-a等，從而發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞作用。CAR-T細(xì)胞將抗體-抗原特異性結(jié)合的能力 W及T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷功能結(jié)合于一體，發(fā)揮特異性抗腫瘤活性CAR-T技術(shù)應(yīng)用的關(guān)鍵是確 定一種腫瘤相關(guān)的抗原，運(yùn)種抗原在腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，而在正常細(xì)胞表面無(wú)表達(dá)或者 低表達(dá)。
[0004] RORl基因最初是從成神經(jīng)瘤細(xì)胞系中克隆得到的，隨后的研究發(fā)現(xiàn)其在胚胎發(fā)育 過(guò)程中高表達(dá)，尤其在調(diào)節(jié)胚胎的肌肉和骨骼發(fā)育方面起關(guān)鍵作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在脂 肪組織中存在少量表達(dá)，而在膜腺、肺、少量B前體細(xì)胞階段也有極少量表達(dá)，其他正常細(xì)胞 幾乎不表達(dá)，但在多種腫瘤細(xì)胞中卻高度表達(dá)。運(yùn)些腫瘤細(xì)胞包括乳腺癌、黑色素瘤、腎癌、 肺腺細(xì)胞癌、胃癌等實(shí)體瘤細(xì)胞W及某些血液腫瘤細(xì)胞。就血液腫瘤而言，在慢性淋己細(xì)胞 白血病蛋白的腫瘤特異性表達(dá)量最高，在髓細(xì)胞白血病，邊緣區(qū)淋己瘤細(xì)胞中也有較高表 達(dá)，此外，骨髓瘤、彌漫性大B細(xì)胞淋己瘤，兒童B系淋己性白血病等腫瘤細(xì)胞也表達(dá)RORl，因 此RORl是一種腫瘤特異性高，并在各類腫瘤中具有廣譜表達(dá)的較為理想的腫瘤祀抗原。
[0005] 嵌合抗原受體基因修飾T淋己細(xì)胞（chimeric antigen receptor modified T cell, CAR-T)是通過(guò)取病人自身T細(xì)胞進(jìn)行嵌合抗原受體的基因修飾。CAR-T細(xì)胞能夠特異 識(shí)別腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物，從而引導(dǎo)T細(xì)胞祀向腫瘤。CAR-T細(xì)胞治療方式的優(yōu)點(diǎn)是能夠克服諸 多原因造成的T細(xì)胞不應(yīng)答問(wèn)題，運(yùn)些原因包括腫瘤祀點(diǎn)密度過(guò)低，T細(xì)胞表位HLA類型的限 制或者HLA表達(dá)量太低。而CAR-T細(xì)胞治療的難點(diǎn)在于其對(duì)祀點(diǎn)在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的特異性 要求非常高，否則容易造成T細(xì)胞持續(xù)激活而殺傷正常B細(xì)胞，或釋放大量細(xì)胞因子引起嚴(yán) 重副作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種RORl特異性嵌合抗原受體及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所提供的RORl特異性嵌合抗原受體，為自氨基端到簇基端依次由抗人RORl 的scFv、CD8a的較鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)、CD3C胞內(nèi)區(qū)串聯(lián)而成的蛋白質(zhì)。
[0008] 其中，所述抗人RORl的SCFv中的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列1的第 1-110位所示;所述抗人RORl的SCFv中的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列1的第 111-198位所示。進(jìn)一步，所述抗人RORl的scFv的氨基酸序列如序列表中序列1所示。所述 CDSa的較鏈區(qū)和跨膜區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列2所示。所述CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的 氨基酸序列如序列表中序列3所示。所述CD3C胞內(nèi)區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列4所示。
[0009] 進(jìn)一步，所述RORl特異性嵌合抗原受體的氨基酸序列如序列表中序列5所示。
[0010] 其中，序列5共由449個(gè)氨基酸組成，其中第1-198位為所述抗人RORl的SCFv的氨基 酸序列；第199-267位為所述CDSa的較鏈區(qū)和跨膜區(qū)的氨基酸序列；第268-336位為所述 CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的氨基酸序列;第337-449位為所述CD3C胞內(nèi)區(qū)的氨基酸序列。
[0011] 編碼所述RORl特異性嵌合抗原受體的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0012] 其中，編碼所述抗人RORl的SCFv中的輕鏈可變區(qū)的基因的核巧酸序列如序列表中 序列6的第1-330位所示;編碼所述抗人RORl的SCFv中的重鏈可變區(qū)的基因的核巧酸序列如 序列表中序列6的第331-594位所示。進(jìn)一步，編碼所述抗人RORl的SCFv的基因的核巧酸序 列如序列表中序列6所示。編碼所述CDSa的較鏈區(qū)和跨膜區(qū)的基因的核巧酸序列如序列表 中序列7所示。編碼所述CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的基因的核巧酸序列如序列表中序列8所示。 編碼所述CD3C胞內(nèi)區(qū)的基因的核巧酸序列如序列表中序列9所示。
[0013] 進(jìn)一步，編碼所述RORl特異性嵌合抗原受體的基因的核巧酸序列如序列表中序列 10所示。
[0014] 其中，序列10共由1350個(gè)核巧酸組成，其中第1-594位為編碼所述抗人RORl的SCFv 的基因的核巧酸序列；第595-801位為編碼所述CDSa的較鏈區(qū)和跨膜區(qū)的基因的核巧酸序 列；第802-1008位為編碼所述CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的基因的核巧酸序列；第1009-1350位為 編碼所述CD3gi內(nèi)區(qū)的基因的核巧酸序列。
[0015] 含有所述基因的重組載體、表達(dá)盒、重組病毒或重組細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍。
[0016] 其中，所述重組載體為能夠表達(dá)所述RORl特異性嵌合抗原受體的重組慢病毒表達(dá) 載體;具體為將所述基因克隆到慢病毒表達(dá)載體pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP后得到的重組 質(zhì)粒；更加具體的為將所述基因（序列10)插入到慢病毒表達(dá)載體PCDH-EF1-MCS-T2A- copGFP的多克隆位點(diǎn)XbaI和BamHI之間后得到的重組質(zhì)粒。所述重組細(xì)胞為能夠表達(dá)所述 RORl特異性嵌合抗原受體的免疫效應(yīng)細(xì)胞。所述重組病毒為能夠表達(dá)所述RORl特異性嵌合 抗原受體且能夠侵染免疫效應(yīng)細(xì)胞的病毒。
[0017]具體的，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞可為細(xì)胞毒性T淋己細(xì)胞、NKT細(xì)胞、NK細(xì)胞或輔助性T 細(xì)胞。所述病毒為慢病毒、瘤疹病毒、巨隧細(xì)胞病毒、EB病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒 或艾滋病毒。
[001引本發(fā)明還提供了 RORl特異性CAR-T細(xì)胞的制備方法。
[0019] 本發(fā)明所提供的RORl特異性CAR-T細(xì)胞的制備方法，具體可包括在T細(xì)胞上表達(dá)所 述RORl特異性嵌合抗原受體的步驟。
[0020] 具體的，所述方法可包括如下步驟：（1)將能夠表達(dá)所述RORl特異性嵌合抗原受體 的重組表達(dá)載體A和PSPAX2質(zhì)粒W及pMD2. G質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，獲得病毒上清;所述重組表 達(dá)載體A為將所述基因克隆到慢病毒表達(dá)載體pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP后得到的重組質(zhì) 粒；（2)用所述病毒上清感染T細(xì)胞，從感染后的細(xì)胞中獲得表達(dá)所述RORl特異性嵌合抗原 受體的T細(xì)胞。
[0021] 其中，步驟(1)中，所述重組表達(dá)載體A、所述PSPAX2質(zhì)粒和所述PMD2.G質(zhì)粒的摩爾 比具體可為4:2:1。在轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后的48-72小時(shí)可獲得所述病毒上清;得到所述病毒上 清后還可包括對(duì)所述病毒上清進(jìn)行離屯、（如4°C 3000rpm離屯、IOmin)、過(guò)濾(如0.45WI1濾器過(guò) 濾）、再離屯、(如4°C50000g離屯、化)及濃縮(如10倍濃縮)的步驟。
[0022] 步驟(2)中，所述T細(xì)胞的可來(lái)源于外周血單個(gè)核細(xì)胞、腹水、胸腔積液或腫瘤組 織。采用所述病毒上清感染所述T細(xì)胞時(shí)，具體可為按照每1 X IO6T細(xì)胞加入含有1 X IO8P即 的病毒上清的量進(jìn)行感染。在進(jìn)行完所述感染后還可包括如下步驟：向感染體系中加入 Polybrene至終濃度為祉g/ml，然后置于32 °C，ISOOrpm離屯、1.化后轉(zhuǎn)入5 % C0237 °C解箱培 養(yǎng)2地，然后換液并Wl X lOVml的密度接種并加入rhIL-2W200IU/ml刺激培養(yǎng)。
[0023] 所述RORl特異性嵌合抗原受體或基因或重組載體或表達(dá)盒或重組病毒或重組細(xì) 胞在如下任一中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
[0024] (a)制備用于治療腫瘤的產(chǎn)品；
[0025] (b)制備用于殺傷表達(dá)RORl蛋白的腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)品。
[0026] 其中，所述腫瘤具體為與RORl蛋白表達(dá)異常（如RORl蛋白高表達(dá))相關(guān)的腫瘤，具 體可選自如下中任一:乳腺癌、黑色素瘤、腎癌、肺腺細(xì)胞癌、胃癌等實(shí)體瘤細(xì)胞W及某些血 液腫瘤。在本發(fā)明中，所述腫瘤細(xì)胞具體為RORl陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞，如MDA-MB-231、Raji和 K562/R0R1 細(xì)胞。
[0027] 在本發(fā)明中，所述產(chǎn)品具體可為藥物。
[0028] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明采用抗人RORl SCFv基因序列，將其進(jìn)行密碼子優(yōu)化， 從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中捜索到人CDSa信號(hào)膚基因，人CDSa較鏈膚基因、人CD28跨膜區(qū)和 胞內(nèi)區(qū)基因，W及人CD3C胞內(nèi)區(qū)基因序列信息，全基因合成嵌合抗原受體hRORl SCFv- hinge-TM-CD8a-CD28-CD3C 化 R0R1-CAR)基因片段，插入到慢病毒表達(dá)載體 pCDH-EFl-MCS- T2A-COPGFP中，構(gòu)成抗人RORl-CAR表達(dá)質(zhì)粒(pCDH-CAR質(zhì)粒），利用該質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì) 粒PSPAX2和PMD2.G在293T細(xì)胞中包裝病毒并感染T細(xì)胞，使T細(xì)胞表達(dá)該嵌合抗原受體。獲 得的CAR-T細(xì)胞在體外與RORl陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231、Raj巧日K562/R0R1共培養(yǎng)，通過(guò) 流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞毒性分析實(shí)驗(yàn)W及化ISA檢測(cè)T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，W證實(shí)該嵌合抗原 受體修飾的T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷作用。利用該技術(shù)，可W將CAR分子精確地整合 到人T細(xì)胞基因組特定的"安全港"位點(diǎn)，不影響任何人體正?；虻慕o功能，因此本發(fā)明所 述的嵌合抗原受體hRORl scFv-hinge-TM-CD8a-CD28-CD3C可在各類實(shí)體瘤和血液腫瘤治 療中得到廣泛應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[OO巧]圖1為慢病毒表達(dá)載體pCDH-EF 1-MCS-T2A-COPGFP的質(zhì)粒圖譜。
[0030]圖2為巧光顯微鏡觀察慢病毒感染T細(xì)胞后的綠色巧光表達(dá)情況。
[0031 ]圖3為流式細(xì)胞儀檢測(cè)慢病毒感染T細(xì)胞后的GFP陽(yáng)性率。
[0032] 圖4為流式細(xì)胞儀檢測(cè)慢病毒感染后T淋己細(xì)胞的比例及表面CAR蛋白的表達(dá)情 況。
[0033] 圖5為CAR-T細(xì)胞的體外殺傷作用測(cè)定結(jié)果。
[0034] 圖6為化ISA檢測(cè)各祀細(xì)胞與CAR-T細(xì)胞共培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IFN-丫、TNF-CUlk 2的水平。其中，A為T(mén)NF-a檢測(cè)結(jié)果;B為IL-2檢測(cè)結(jié)果;C為IFN-丫檢測(cè)結(jié)果。
[0035] 圖7為CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)殺瘤活性檢測(cè)結(jié)果(腫瘤大小）。
[0036] 圖8為CAR-T細(xì)胞的體內(nèi)殺瘤活性檢測(cè)結(jié)果(小鼠存活率）。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0038] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0039] 慢病毒表達(dá)載體pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP:普如汀生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn) 品。該質(zhì)粒能表達(dá)GFP，產(chǎn)生綠色巧光。該載體的質(zhì)粒圖譜如圖1所示。
[0040] PSPAX2質(zhì)粒:為優(yōu)寶生物產(chǎn)品，產(chǎn)品貨號(hào):VT1444。
[0041 ] pMD2.G質(zhì)粒:為優(yōu)寶生物產(chǎn)品，產(chǎn)品貨號(hào):VT1443。
[0042] 293T細(xì)胞:為ATCC產(chǎn)品，其產(chǎn)品編號(hào)為CRk3216?。
[0043] MDA-MB-231細(xì)胞:為ATCC產(chǎn)品，其產(chǎn)品編號(hào)為HTB-26?。
[0044] Raji細(xì)胞:為ATCC產(chǎn)品，其產(chǎn)品編號(hào)為C化-86?。
[0045] K562細(xì)胞:為ATCC產(chǎn)品，其產(chǎn)品編號(hào)為C化-243?。
[0046] 實(shí)施例UhRORl scFv-hinge-TM-CD8a-CD28-CD3C表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0047] 一、hRORl scFv-hinge-TM-CD8a-CD28-CD3C基因序列的確定
[004引從美國(guó)國(guó)立醫(yī)學(xué)圖書(shū)館網(wǎng)站化ttp: //www. ncbi . nlm. nih. gov/entrez )GenBank數(shù) 據(jù)庫(kù)中捜索到人CD8a較鏈區(qū)和跨膜區(qū)基因、人CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)基因，人CD3C胞內(nèi)區(qū)基 因序列信息，W及抗人RORl SCFv基因序列，并將其進(jìn)行密碼子優(yōu)化，W保證在編碼氨基酸 序列不變情況下更適合人類細(xì)胞表達(dá)。
[0049] 其中，抗人RORl SCFv基因的核巧酸序列如序列表中序列6所示。人CDSa較鏈區(qū)和 跨膜區(qū)基因的核巧酸序列如序列表中序列7所示。人CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)基因的核巧酸序 列如序列表中序列8所示。人CD3C胞內(nèi)區(qū)基因的核巧酸序列如序列表中序列9所示。
[0050] 將上述基因序列依次按人CDSa信號(hào)膚基因、抗人RORl SCFv基因、人CDSa較鏈區(qū)和 跨膜區(qū)基因、人CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)基因W及人CD3C胞內(nèi)區(qū)基因序列進(jìn)行連接，形成最終 完整的hRORl-CAR基因序列信息，具體如序列表中序列10所示。序列10共由1350個(gè)核巧酸組 成，其中第1-594位為編碼所述抗人RORl的SCFv的基因的核巧酸序列；第595-801位為編碼 所述CDSa的較鏈區(qū)和跨膜區(qū)的基因的核巧酸序列；第802-1008位為編碼所述CD28跨膜區(qū)和 胞內(nèi)區(qū)的基因的核巧酸序列;第1009-1350位為編碼所述CD3C胞內(nèi)區(qū)的基因的核巧酸序列。
[0化1]二、hRORl scFv-hinge-TM-CD8a-CD28-CD3C表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0052] 全基因合成步驟一優(yōu)化后的完整的hRORl-CAR序列(序列10,克隆到慢病毒表達(dá)載 體pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP(簡(jiǎn)稱pCDH-空載體）中，獲得抗人CD19-CAR表達(dá)質(zhì)粒(命名為 pCDH-CAR質(zhì)粒)和含有該質(zhì)粒的D冊(cè)a菌液。具體操作如下：用限制性內(nèi)切酶Xba巧郵amHI雙 酶切hRORl-CAR序列Ttctaga+序列10+GGATCC")，與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的慢病毒表達(dá)載體 pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP相連，得到重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒送上海英俊生物技術(shù)有限公司 進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與擬合成的hROR 1 -CAR序列比對(duì)W證實(shí)序列正確。測(cè)序引物為Sen S e 和Anti-sense。將經(jīng)測(cè)序表明，在慢病毒表達(dá)載體pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP的酶切位點(diǎn) 甜a巧郵amHI之間插入序列表中序列10所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為pCDH-CAR。
[0053] Sense:5 ' 一ctccac邑Cttt邑CCt邑accct邑ctt-3 '；
[0054] Anti-sense:5'一邑邑t邑at邑C邑邑cactc邑atctccat邑一3' O
[0055] S、包裝質(zhì)粒和目的質(zhì)粒的提取
[0化6] 將步驟二構(gòu)建的pCDH-CAR質(zhì)粒，W及pCDH-空載體、PSPAX2和pMD2 .G包裝質(zhì)粒的菌 株在LB培養(yǎng)基中大量培養(yǎng)，采用北京天根生化科技有限公司的無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒 (DP117)提取質(zhì)粒，W備感染。具體操作步驟如下：
[0057] 1、柱平衡步驟：向吸附柱CP6中（吸附柱放入50ml收集管中）加入2.5ml的平衡液 化，80(K)rpm離屯、2min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（用平衡液處理 過(guò)的柱子最好立即使用）。
[0058] 2、取100mL(根據(jù)培養(yǎng)菌體的濃度選擇合適的量，低拷貝推薦用200ml)過(guò)夜培養(yǎng)的 菌液加入離屯、管，室溫8000巧m離屯、3min收集細(xì)菌，盡量吸除上清。
[0059] 注意：菌液較多時(shí)可W通過(guò)幾次離屯、將菌體沉淀收集到一個(gè)離屯、管中，菌液量W 能夠充分裂解為佳，菌液過(guò)多會(huì)導(dǎo)致裂解不充分從而降低質(zhì)粒的提取效率。
[0060] 3、盡量吸除上清，為確保上清液全部吸取，請(qǐng)用干凈的吸水紙吸去瓶壁上的水滴。
[0061] 4、向留有菌體沉淀的離屯、管中加入8ml溶液PU請(qǐng)先檢查是否已加入RNase A)，使 用移液器或滿旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。
[0062] 注意:請(qǐng)務(wù)必徹底懸浮細(xì)菌沉淀，如果有未徹底混勻的菌塊，會(huì)影響裂解效果，導(dǎo) 致提取量和純度偏低。對(duì)于低拷貝質(zhì)粒，加大菌體用量的同時(shí)按比例增加Pl、P2、P4的用量。
[0063] 5、向離屯、管中加入8ml溶液P2,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，室溫放置5min。注意： 溫和地混勻，不要?jiǎng)×艺鹗帲琖免污染基因組DNA。此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，如果未變得清 亮，可能由于菌體過(guò)多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。
[0064] 6、向離屯、管中加入8ml溶液P4,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，至溶液出現(xiàn) 白色分散絮狀沉淀。然后室溫放置IOmin左右。800化pm離屯、5-lOmin，使白色沉淀離至管底 (可適當(dāng)增加離屯、時(shí)間），將全部溶液小屯、倒入過(guò)濾器CSl中（請(qǐng)避免倒入大量沉淀而阻塞過(guò) 濾器），慢慢推動(dòng)推柄過(guò)濾，濾液收集在干凈的50ml的管中（自備）。
[0065] 注意：加入溶液P4后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果離屯、后倒入過(guò)濾器CSl 中的溶液有白色沉淀也不會(huì)影響過(guò)濾。如果菌體過(guò)多（MOOml)，推薦延長(zhǎng)離屯、時(shí)間至20- 30min。
[0066] 7、向?yàn)V液中加入0.3倍濾液體積的異丙醇(加入異丙醇過(guò)多容易導(dǎo)致RNA污染），上 下顛倒混勻后轉(zhuǎn)移到吸附柱CP6中（吸附柱放入50ml收集管中）。
[0067] 注意:過(guò)濾后濾液會(huì)損失，根據(jù)損失的不同請(qǐng)加入不同體積的異丙醇。吸附柱CP6 的最大容積為15ml，所W需要分2次過(guò)柱。
[0068] 8、室溫8000巧m離屯、2min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP6重新放回收集管中。
[0069] 注意:將第7步中所得溶液分2次過(guò)柱，每次均按W上條件操作。
[0070] 9、向吸附柱CP6中加入IOml漂洗液PW(請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），SOOOrpm離 屯、2min，棄掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0071] 10、重復(fù)操作步驟9。
[0072] 11、向吸附柱CP6中加入3ml無(wú)水乙醇，室溫8000巧m離屯、2min，倒掉廢液。
[0073] 12、將吸附柱CP6重新放回收集管中，800化pm離屯、5min，目的是將吸附柱中殘余的 漂洗液去除。
[0074] 注意:漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶促反應(yīng)(酶切、PCR等)實(shí)驗(yàn)。為確保下 游實(shí)驗(yàn)不受殘留乙醇的影響，建議將吸附柱CP6開(kāi)蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，W徹底驚干吸 附材料中殘余的漂洗液。
[0075] 13、將吸附柱CP6置于一個(gè)干凈的50ml收集管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加1- 2ml洗脫緩沖液TB，室溫放置5min，然后室溫8000巧m離屯、2min。將50ml離屯、管中的洗脫液全 部移入一個(gè)干凈的1.5ml離屯、管，-20°C保存。
[0076] 注意:為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，重復(fù)步驟 13。
[0077] 實(shí)施例2、嵌合抗原受體hR0RlscFv-Mnge-TM-CD8a-CD28-CD3。區(qū)病毒修飾T細(xì)胞 的制備及其鑒定
[007引一、嵌合抗原受體hR0RlscFv-hinge-TM-CD8a-CD28-CD3。區(qū)病毒修飾T細(xì)胞的制備
[0079] l、將實(shí)施例l構(gòu)建的pCDH-CAR質(zhì)粒W及包裝質(zhì)粒pSPAX2和pMD2.G按4:2:l比例用 聚乙締亞胺轉(zhuǎn)染試劑(Sigma公司）轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，具體方法見(jiàn)PEI轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)。分別于 轉(zhuǎn)染后72小時(shí)收取病毒上清，于4°C，300化pm離屯、10分鐘后經(jīng)0.45皿濾器過(guò)濾后，采用4°C SOOOOg化超速離屯、后進(jìn)行10倍濃縮，將收集的病毒濃縮液轉(zhuǎn)入-80°C保存。
[0080] 2、T細(xì)胞的制備
[0081 ]取健康供者新鮮外周血，用Ficoll分離液和人T細(xì)胞富集抗體混合物(StemCell公 司）分離獲得較純的CD3+T cell(約占95% W上），具體操作步驟詳見(jiàn)RosetteSep T cell enrichment Cocktai 1說(shuō)明書(shū)。用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1 X lOVml， 將細(xì)胞Wlml/孔接種至預(yù)先用抗人CD3和CD28抗體(eBioscience，用量為扣g/ml)包被的24 孔板，再加入500IU/ml重組人白細(xì)胞介素2(rhIL-2)，刺激培養(yǎng)2地后進(jìn)行病毒感染。
[0082] 3、慢病毒感染T細(xì)胞及感染后T細(xì)胞的培養(yǎng)
[0083] 從-80°C中取出步驟1獲得的病毒濃縮液，按每IX IO6T細(xì)胞加入10化1病毒上清 (相當(dāng)于1 X IO8PFU)，后加入化Iybrene至終濃度為祉g/mr混勻后，置于32°C，ISOOrpm離屯、 l.化后轉(zhuǎn)入5%C02,37°C解箱培養(yǎng);將培養(yǎng)24h后的細(xì)胞W100 0巧ml0min離屯、換液，WlX l(yVml的密度接種于六孔板中，加入rhIL-2W200IU/ml刺激培養(yǎng)后，每2-3天換液一次，細(xì) 胞生長(zhǎng)密度和rhIL-2用量同前;感染后96h，用巧光顯微鏡觀察T細(xì)胞的綠色巧光表達(dá)情況 并照相，結(jié)果見(jiàn)圖2。收集細(xì)胞后，1000巧m離屯、IOmin，PBS洗涂1次，用適量PBS重懸細(xì)胞置于 流式檢測(cè)管仲，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP陽(yáng)性率，結(jié)果見(jiàn)圖3。
[0084] 二、流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染后T淋己細(xì)胞的比例及表面CAR蛋白的表達(dá)
[0085] 離屯、收集感染后9加的待檢測(cè)細(xì)胞及對(duì)照組（WpCDH-空載體替代實(shí)施例1構(gòu)建的 pCDH-CAR質(zhì)粒），PBS洗涂1次后棄上清，按照抗體說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)檢測(cè)量的單抗(CD3由APC anti-human CD3標(biāo)記，購(gòu)自ebioscience，貨號(hào)：17-0037;CAR由Biotin anti-mouse IgG,F (ab'）2和APC/切TStr邱tavidin標(biāo)記，其中CAR即為序列5所示的嵌合抗原受體hRORl scFv- hinge-TM-CD8a-CD28-CD3C)，用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染后T淋己細(xì)胞的比例及表面CAR蛋白 的表達(dá)情況。
[0086] 結(jié)果見(jiàn)圖4,由圖可見(jiàn)經(jīng)重組慢病毒表達(dá)載體pCDH-CAR表達(dá)產(chǎn)物刺激后的T淋己細(xì) 胞成功獲得了表達(dá)RORl特異性嵌合抗原受體的T細(xì)胞，即為CAR-T細(xì)胞。
[0087] 實(shí)施例3、嵌合抗原受體hRORl scFv-hinge-TM-CD8a-CD28-CD3。區(qū)病毒修飾T細(xì)胞 的體外殺瘤活性檢測(cè)
[008引一、多種腫瘤細(xì)胞系中RORl表達(dá)水平
[0089] 供試腫瘤細(xì)胞系：Ra j i、K562、K562/R0R1 (轉(zhuǎn)染了RORl 的K562細(xì)胞）、MDA-MB-231。
[0090] 將各供試腫瘤細(xì)胞系分別培養(yǎng)后，各取5 X IO5個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，PBS洗涂2次后， 加入APC標(biāo)記的抗人RORl單抗（eBioscience公司），W標(biāo)記APC-isotype(eBioscience公司 產(chǎn)品）為對(duì)照組，冰上解育30min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各種細(xì)胞系的RORl表達(dá)的水平。實(shí)驗(yàn) 重復(fù)=次，結(jié)果取均值。
[0091] 結(jié)果顯示：1?3^'1、1(562/1?01?1、]\?^-]\?-231細(xì)胞系表達(dá)1?0則的百分率分別為69%、 90 % 和95 % ;而K562不表達(dá)RORl。
[0092] 根據(jù)不同的祀細(xì)胞分為四個(gè)實(shí)驗(yàn)組:]\?^-]\?-231、1?曰^'1、1(562/1?01?1組(轉(zhuǎn)染了1?0尺1 的K562細(xì)胞)和K562細(xì)胞組，設(shè)置效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組和祀細(xì)胞對(duì)照組。調(diào)整效應(yīng)細(xì)胞CAR-T(實(shí) 施例2制備)和各組相應(yīng)的祀細(xì)胞密度，分別為1 X 106/m巧日1 X lOVml，在各實(shí)驗(yàn)組中按效祀 比化/T) 10:1往96孔板中加入效應(yīng)細(xì)胞懸液和祀細(xì)胞懸液，總體積為20化L，放入37 °C，5 % 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4她后每孔加入20化CCK-8，繼續(xù)解育化后上酶標(biāo)儀檢測(cè)，于450nm波長(zhǎng)處 讀取OD值，殺傷率=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組OD值)/祀細(xì)胞對(duì)照組OD值]X 100%。
[0093] 實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置W pCDH-空載體替代實(shí)施例1構(gòu)建的pCDH-CAR質(zhì)粒的對(duì)照組(NTD-T 組)。
[0094] 結(jié)果如圖 5 所示，由圖可見(jiàn) WMDA-MB-231、Raji、K562/R0Rl(轉(zhuǎn)染了 RORl 的 K562 細(xì) 胞)為祀細(xì)胞時(shí)，CAR-T細(xì)胞對(duì)其殺傷作用明顯高于NTD-T組。而WK562為祀細(xì)胞時(shí)，CAR-T細(xì) 胞對(duì)其殺傷作用與NTD-T組類似，均較低。
[0095] 二、ELISA檢測(cè)各祀細(xì)胞與CAR-T細(xì)胞共培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IFN-丫、TNF-a、化-2 的水平
[0096] 實(shí)驗(yàn)分組同上，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。取出已包被抗體（IFN-丫，購(gòu)自Abcam公司，貨號(hào)： (ab46551); TNF-a，購(gòu)自Abcam公司貨號(hào)：181421;比-2，購(gòu)自Abcam公司貨號(hào)：174444)的酶標(biāo) 板，設(shè)置TMB空白顯色孔，依次加入0.1ml按一定倍數(shù)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及用樣品稀釋液稀釋的 樣品。酶標(biāo)板加上蓋，37°C反應(yīng)90min。反應(yīng)后用自動(dòng)洗板機(jī)吸棄酶標(biāo)板內(nèi)的液體。分別將生 物素化的抗人IFN-丫、TNF-a、化-2抗體（同上)工作液按每孔0.1ml依次加入(TMB空白顯色 孔除外），37°C反應(yīng)60min，0.01M PBS洗涂3次。將ABC工作液按每孔0.1 ml依次加入(TMB空白 顯色孔除外），37°C反應(yīng)30min，0.0IM PBS洗涂5次。按每孔90山依次加入TMB顯色液，37°C避 光反應(yīng)20-25min，按每孔O. Iml依次加入TMB終止液，用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定OD值。根據(jù)標(biāo) 準(zhǔn)曲線計(jì)算共培養(yǎng)上清中IFN-丫、TNF-a、比-2細(xì)胞因子水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)S次，結(jié)果取均值。
[0097] 結(jié)果表明：各祀細(xì)胞與CAR-T細(xì)胞共培養(yǎng)上清中TNF-a(圖6中A)、化-2(圖6中B)、 IFN-丫（圖6中C)細(xì)胞因子水平不表達(dá)RORl的K562細(xì)胞的共培養(yǎng)上清中的IFN-丫、TNF-a、 IL-2細(xì)胞因子水平相比較有顯著性升高（均P<0.01)。該結(jié)果表明，嵌合抗原受體hRORl scFv-hinge-TM-CD8a-CD28-CD3C修飾的T細(xì)胞（即CAR-T細(xì)胞)在表達(dá)RORl細(xì)胞系刺激下，能 夠分泌化1類細(xì)胞因子。
[0098] 實(shí)施例4、嵌合抗原受體hRORl scFv-hinge-TM-CD8a-CD28-CD3。區(qū)病毒修飾T細(xì)胞 體內(nèi)殺瘤活性檢測(cè)
[0099] 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231腫瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度于每只小鼠右側(cè)背部皮下 接種5 X IO6個(gè)細(xì)胞;待腫瘤體積達(dá)到300-400mm3時(shí)，計(jì)數(shù)CAR-T細(xì)胞(實(shí)施例2制備)濃度調(diào)整 至1 X IO8個(gè)/ml，尾靜脈注射小鼠 10化1/只，對(duì)照組注射未經(jīng)嵌合抗原受體修飾的T淋己細(xì) 胞，于接種腫瘤細(xì)胞30天后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)和寬，計(jì)算腫瘤體積并統(tǒng)計(jì)生存率。
[0100] 實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置W pCDH-空載體替代實(shí)施例1構(gòu)建的pCDH-CAR質(zhì)粒的對(duì)照組(NTD-T 組)和未處理組。
[0101] 具體結(jié)果如圖7和圖8所示，由圖可見(jiàn)，與NTD-T組和未處理組相比，CAR-T組小鼠的 腫瘤大小得到有效控制，并且其存活率得到顯著提高。在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的30天內(nèi)，NTD-T組和未 處理組小鼠均全部死亡，而CAR-T組小鼠仍100 %存活。
[0102] 綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實(shí)施例中，其中一個(gè)或更多個(gè)技術(shù)方 案中所記載的技術(shù)特征可W與任意的一個(gè)或多個(gè)技術(shù)方案相組合，運(yùn)些經(jīng)組合而得到的技 術(shù)方案也在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. RORl特異性嵌合抗原受體，為自氨基端到羧基端依次由抗人RORl的scFv、CD8a的鉸 鏈區(qū)和跨膜區(qū)、CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)、CD3G胞內(nèi)區(qū)串聯(lián)而成的蛋白質(zhì)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的RORl特異性嵌合抗原受體，其特征在于:所述抗人RORl的scFv 中的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列1的第1-110位所示;所述抗人RORl的scFv中 的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列1的第111-198位所示;和/或 所述抗人RORl的scFv的氨基酸序列如序列表中序列1所示;和/或 所述CDSa的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列2所示;和/或 所述CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列3所示;和/或 所述CD3G胞內(nèi)區(qū)的氨基酸序列如序列表中序列4所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的RORl特異性嵌合抗原受體，其特征在于：所述RORl特異性 嵌合抗原受體的氨基酸序列如序列表中序列5所示。4. 編碼權(quán)利要求1-3中任一所述RORl特異性嵌合抗原受體的基因。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于:編碼所述抗人RORl的scFv中的輕鏈可變區(qū) 的基因的核苷酸序列如序列表中序列6的第1-330位所示;編碼所述抗人RORl的scFv中的重 鏈可變區(qū)的基因的核苷酸序列如序列表中序列6的第331-594位所示;和/或 編碼所述抗人RORl的scFv的基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示;和/或 編碼所述CDSa的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)的基因的核苷酸序列如序列表中序列7所示;和/或 編碼所述CD28跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)的基因的核苷酸序列如序列表中序列8所示;和/或 編碼所述⑶3ζ胞內(nèi)區(qū)的基因的核苷酸序列如序列表中序列9所示。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的基因，其特征在于：編碼所述RORl特異性嵌合抗原受體的 基因的核苷酸序列如序列表中序列10所示。7. 含有權(quán)利要求4-6中任一所述基因的重組載體、表達(dá)盒、重組病毒或重組細(xì)胞。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組病毒或重組細(xì)胞，其特征在于:所述重組細(xì)胞為能夠表達(dá) 權(quán)利要求1-3中任一所述RORl特異性嵌合抗原受體的免疫效應(yīng)細(xì)胞； 所述重組病毒為能夠表達(dá)權(quán)利要求1-3中任一所述RORl特異性嵌合抗原受體，且能夠 侵染免疫效應(yīng)細(xì)胞的病毒； 具體的，所述免疫效應(yīng)細(xì)胞為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、NKT細(xì)胞、NK細(xì)胞或輔助性T細(xì)胞;所 述病毒為慢病毒、皰疹病毒、巨噬細(xì)胞病毒、EB病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或艾滋病 毒。 9. RORl特異性CAR-T細(xì)胞的制備方法，包括在T細(xì)胞上表達(dá)權(quán)利要求1-3中任一所述 RORl特異性嵌合抗原受體的步驟； 具體的，所述方法包括如下步驟：（1)將能夠表達(dá)所述RORl特異性嵌合抗原受體的重組 表達(dá)載體A和pSPAX2質(zhì)粒以及pMD2. G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293Τ細(xì)胞，獲得病毒上清;所述重組表達(dá)載 體A為將權(quán)利要求4-6中任一所述基因克隆到慢病毒表達(dá)載體pCDH-EFl-MCS-T2A-copGFP后 得到的重組質(zhì)粒；（2)用所述病毒上清感染T細(xì)胞，從感染后的細(xì)胞中獲得表達(dá)所述RORl特 異性嵌合抗原受體的T細(xì)胞。10. 權(quán)利要求1-7中任一所述的RORl特異性嵌合抗原受體或基因或重組載體或表達(dá)盒 或重組病毒或重組細(xì)胞在如下任一中的應(yīng)用： (a)制備用于治療腫瘤的產(chǎn)品； (b)制備用于殺傷表達(dá)RORl蛋白的腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)品。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK105924533SQ201610550998
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年7月13日
【發(fā)明人】盧戌, 劉靜維, 楊照敏, 鄧麗娟, 劉雪松, 李京坡, 黃彩庭
【申請(qǐng)人】北京康愛(ài)瑞浩生物科技股份有限公司