一種生物降解脫氧雪腐鐮刀烯醇的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種生物降解脫氧雪腐鐮刀烯醇的方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域和食品安全技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的降解脫氧雪腐鐮刀烯醇的微生物是從太湖湖底泥中經(jīng)梯度稀釋分離、篩選得到的，經(jīng)鑒定為青霉JS2(Penicillium sp.JS2)，在培養(yǎng)基中，DON的初始濃度為2mg/L，pH 6.0，經(jīng)32?35℃培養(yǎng)96h，DON的降解率為62％。該菌種降解嘔吐毒素的穩(wěn)定性很好，在培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)5代，DON的降解率均在60％以上。CCTCC NO：M 201523720150416
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種生物降解脫氧雪腐鐮刀烯醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種生物降解脫氧雪腐鐮刀烯醇的方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域和食品安全技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]真菌毒素對(duì)食品尤其是對(duì)糧食的危害極大，真菌可在糧食作物田間生長(zhǎng)、收獲后及儲(chǔ)藏過(guò)程中對(duì)毒素的生物合成及代謝。嘔吐毒素(vomitoxin)又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenolDON)，是由鐮刀菌屬等產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，它對(duì)糧谷類(lèi)的污染非常普遍，家畜食用了 DON污染的飼料會(huì)引起拒食，嘔吐，生長(zhǎng)延遲，生殖紊亂等癥狀;而人類(lèi)誤食了 DON污染的糧食會(huì)引起免疫抑制，貧血，頭痛，嘔吐，厭食和腹痛等癥狀。
[0003]嘔吐毒素的性質(zhì)非常穩(wěn)定，耐熱、耐壓，在弱酸中部不分解，一般的方法很難破壞其化學(xué)結(jié)構(gòu)。目前，嘔吐毒素降解的方法有物理法、化學(xué)法和生物法，但是由于成本、環(huán)境污染、原料營(yíng)養(yǎng)成分破壞等原因，推廣起來(lái)不易。因此，尋找一種安全快速有效的方法來(lái)降解污染糧食中的嘔吐毒素是十分必要的。
[0004]微生物降解嘔吐毒素有以下優(yōu)點(diǎn):專(zhuān)一、有效且條件溫和:不會(huì)引入有害化學(xué)物質(zhì)，對(duì)谷物及飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的損失少，沒(méi)有環(huán)境污染而受到廣大關(guān)注。真菌毒素微生物防治方法作為一種常用方法，具有安全、高效、經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用性強(qiáng)、環(huán)境友好型等優(yōu)勢(shì)，成為近年來(lái)備受推崇的防治方法。
[0005]目前，生物降解嘔吐毒素包括一些黑曲霉、枯草芽孢桿菌、米曲霉米根霉及一些腸道厭氧微生物，雖然已有報(bào)道一些青霉菌可以降解嘔吐毒素，但是存在降解效率低的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一株能降解嘔吐毒素的菌株及與其適合的有效發(fā)酵培養(yǎng)條件。
[0007]本發(fā)明的菌株為青霉JS2，已于2015年4月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2015237。
[0008]本發(fā)明的青霉JS2，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，DON濃度為2mg/L，pH為6.0，經(jīng)32°C培養(yǎng)96h，傳代5次，青霉JS2對(duì)DON的降解率均在60 %以上。
[0009]所述的能降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的青霉菌JS2，是從太湖湖底泥中以DON毒素為唯一碳源分離篩選出來(lái)，其保藏條件如下:從生長(zhǎng)良好的固態(tài)平板培養(yǎng)基上接取3環(huán)降解菌到搖瓶培養(yǎng)基中，32°C搖床(120rpm)培養(yǎng)96h，取0.65mL移入含有0.3mL無(wú)菌甘油的甘油管中，放入-70°C超低溫冰箱保存。
[0010]所述固態(tài)平板培養(yǎng)基為(w/v):D0N毒素 0.2mg，KH2P04 0.5g,MgSO4.7H20 0.lg，(NH4)2SO4 0.3g,CaCl2.2H20 0.2g，瓊脂2.0g，蒸餾水 100mL，pH自然。121°C滅菌20min，滅菌后加入DON毒素。
[0011]本發(fā)明還提供一種所述能降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的培養(yǎng)方法，是將青霉菌JS2接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，pH 6.0，培養(yǎng)溫度32-35°(:，搖床轉(zhuǎn)速120印111/1^11，搖床培養(yǎng)96h0
[0012]所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基為(w/v):D0N毒素2mg/L，KH2P040.5%,MgSO4.7H20 0.1%,(NH4)2SO4 0.3-0.4% ,CaCl2.2H20 0.2%，瓊脂2.0 %，蒸餾水 100mL，pH自然。121°C滅菌20min，滅菌后加入DON毒素。
[0013]將能降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的青霉菌JS2菌發(fā)酵后的發(fā)酵液，5000rpm離心1min后上清液為粗酶液，經(jīng)高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)結(jié)果顯示DON經(jīng)粗酶降解，降解效果明顯，降解率達(dá)60%以上。
[0014]本發(fā)明還提供了一種降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的方法，是利用青霉JS2發(fā)酵得到的粗酶液降解DON。
[0015]生物材料保藏:
[0016]青霉JS2，分類(lèi)學(xué)命名為青霉JS2Penicillium sp.JS2，已于2015年4月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2015237，保藏地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)。
[0017]本發(fā)明的有益效果:
[0018]本發(fā)明自太湖湖底泥中篩選出一株能降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的青霉JS2(Penicillium sp.JS2)，該菌株可產(chǎn)生酶能降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，該菌種降解嘔吐毒素的穩(wěn)定性很好，傳代培養(yǎng)5代，在培養(yǎng)基中，D0N的初始濃度為2mg/L，pH 6.0，經(jīng)32-350C培養(yǎng)96h，DON的降解率均在60 %以上。
【具體實(shí)施方式】
[0019]毒素檢測(cè)方法:
[0020]25ml發(fā)酵液過(guò)濾后取5ml再通過(guò)DON免疫親和柱凈化，然后將凈化液3ml以氮?dú)獯蹈?，用Iml流動(dòng)相甲醇:水(8:2)復(fù)溶，然后用UPLC進(jìn)行檢測(cè)。
[0021 ]實(shí)施例1:降解嘔吐毒素菌株的篩選方法
[0022]采取的一定量的太湖湖底泥，放入裝有10mL無(wú)菌水及玻璃珠的250mL三角瓶中，振蕩，稀釋不同濃度梯度，將不同濃度梯度稀釋好的樣品分別涂布到以DON毒素為唯一碳源的PH值為6.0的固體培養(yǎng)基平板上，32 °C培養(yǎng)72h。反復(fù)進(jìn)行平板劃線分離，重復(fù)三次得到純化的單菌落，供下一步鑒定用。
[0023]鑒定主要通過(guò):I)菌落特征觀察:在含有DON毒素的固體培養(yǎng)基平板上，用肉眼直接觀察，在菌落周?chē)械矸劢到馔该魅Φ木辍?)個(gè)體形態(tài)觀察:用光學(xué)顯微鏡觀察，挑起有變形菌形態(tài)的菌株。將滿足鑒定條件的菌株挑出甘油管保藏。
[0024]以3%接種量取-70 °C甘油管保藏液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，32 °C，120rpm搖瓶培養(yǎng)。取32 0C搖床培養(yǎng)的96h的發(fā)酵液，5000rpm，4 °C離心1min。離心結(jié)束后，取上清液，過(guò)濾后用HPLC方法測(cè)定降解率。
[0025]所述發(fā)酵培養(yǎng)基為(》八):0(^毒素0.211^，腿2?040.5%，]\%504.7H20 0.1%, (NH4)2SO4 0.4%,CaCl2.2H20 0.2%，瓊脂2.0%，蒸餾水 100mL，pH自然。121°C滅菌20min，滅菌后加入DON毒素。
[0026]通過(guò)利用HPLC法對(duì)降解菌的降解率進(jìn)行測(cè)定，篩選出一株可高效降解DON毒素的菌株(降解率為67 % )，通過(guò)16S rDNA鑒定，序列分析可知該菌株為青霉菌JS2(PeniciIliumsp.JS2)，于2015年4月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2015237。
[0027]實(shí)施例2:青霉菌JS2(Penicillium sp.JS2)產(chǎn)酶最適反應(yīng)pH的測(cè)定
[0028]采用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，配置不同梯度pH緩沖液(5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，)的方法測(cè)定降解酶最適反應(yīng)pH。分別將粗酶液與不同pH的緩沖液在試管中混合，在350C水浴鍋內(nèi)保溫24h ο該降解酶的最適反應(yīng)pH為6.0，在該pH條件下可以高效降解DON。在卩!15.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5下的降解率分別是50%，64%，66%，62%，55%，47%。
[0029]粗酶液制備方法:取32°C搖床培養(yǎng)的96h的發(fā)酵液，5000rpm、4°C離心lOmin。離心結(jié)束后，取上清液，過(guò)濾備用。
[0030]降解體系:粗酶液添加量為lml，將粗酶液與不同pH的緩沖液在試管中混合，加入DON毒素的量為2mg/L，反應(yīng)時(shí)間為30分鐘。
[0031]實(shí)施例3:青霉菌JS2(Penicillium sp.JS2)產(chǎn)酶最適反應(yīng)溫度的測(cè)定
[0032]采用不同梯度溫度(25°C，30°C，35°C，40°C，45°C，50°C)的方法測(cè)定降解酶最適反應(yīng)溫度，25°(:、30°(:、35°(:、40°(:、45°(:、50°(:下的降解率分別49%，57%，65%，52% ,46%，39%。分別將粗酶液放置在不同溫度條件下進(jìn)行反應(yīng)，在水浴鍋內(nèi)保溫24h，該降解酶的最適反應(yīng)溫度為35°C，在該溫度條件下可以高效降解DON。
[0033]粗酶液制備方法:取32°C搖床培養(yǎng)的96h的發(fā)酵液，5000rpm、4°C離心lOmin。離心結(jié)束后，取上清液，過(guò)濾備用。
[0034]降解體系:粗酶液添加量為Iml，加入DON毒素的量為2mg/L，反應(yīng)時(shí)間為30分鐘。
[0035]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一株降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的青霉JS2，于2015年4月16日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2015237。2.權(quán)利要求1所述的青霉JS2在降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇方面的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是用于降解糧食中的降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。4.一種發(fā)酵培養(yǎng)權(quán)利要求1所述青霉JS2的方法，其特征在于，所述方法是將青霉菌JS2接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，pH 6.0，培養(yǎng)溫度32°C，搖床轉(zhuǎn)速120rpm/min，搖床培養(yǎng)96h，得到發(fā)酵液。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，含有DON毒素2mg/L，KH2PO4 0.5% ,MgSO4.7H20 0.1 % , (NH4)2SO4 0.3-0.4% ,CaCl2.2H20 0.2%，瓊脂 2.0%。6.根據(jù)權(quán)利要求4-5的方法得到的發(fā)酵液。7.權(quán)利要求6所述的發(fā)酵液在降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇方面的應(yīng)用。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是利用發(fā)酵液離心后得到的粗酶液降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。
【文檔編號(hào)】C12N9/00GK105925492SQ201610404034
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月8日
【發(fā)明人】孫秀蘭, 孫超, 紀(jì)劍, 張銀志, 孫嘉笛
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)