來源于蠶沙的菌株Bacillus megaterium OP6及其應用
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物技術領域，公開了一株來源于蠶沙的菌株Bacillus megaterium OP6及其應用。本發(fā)明的菌株已于2015年12月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.11837。該菌株可用于制備土壤微生物菌劑或生物有機肥。具有顯著的解磷解鉀效果，提高土壤肥力；并可以有效抑制禾谷鐮刀菌等土壤中作物有害病原微生物的生長，起到防治作物病害和提高作物抗病蟲害能力的作用，從而提高作物的產量和品質，具有良好的應用前景。CGMCC NO.1183720151207
【專利說明】
來源于蠶沙的菌株83〇111。5 111巧3*6^圓（^6及其應用
技術領域
[000。 本發(fā)明屬于微生物技術領域，具體設及一株來源于蠶沙的菌株Baci Ilus megaterium 0P6及其應用。
【背景技術】
[0002] 我國大部分±壤憐含量在0.043-0.046%之間，憐含量比較匿乏，且±壤中的憐主 要W固態(tài)的礦物質形式存在，約占全憐含量的70%左右，而作物吸收憐素主要是通過憐酸 根形式吸收，因此±壤中水溶性無機憐酸根離子含量的高低對于作物吸收憐素起著重要的 作用。目前我國現有的種植模式大多采用直接使用無機憐肥來滿足作物對憐素的營養(yǎng)需 求，但是由于無機憐肥的有效作用形式為憐酸根，在±壤中極易與堿性±壤中的巧鹽及酸 性±壤中的鐵等離子發(fā)生反應，從而轉化為不能被作物吸收的難溶性的憐酸鹽，因此無機 憐肥的利用率非常低，一般不高于20%。同樣，±壤中鐘含量一般在0.04-3.0%之間，其中 90%存在于云母和長石等含鐘礦物的晶體結構中，只有經過漫長的風化過程，從晶格結構 中釋放出來才能被作物吸收和利用。隨著我國農業(yè)生產水平的快速增長，作物對±壤鐘的 消耗逐年增加，±壤缺鐘現象嚴重。
[0003] 如何有效利用±壤中的憐、鐘元素，減少化學憐肥和鐘肥的投入，逐漸成為人們關 注的重點。眾所周知，只有在理化因素和微生物的作用下，±壤中的難溶性憐及含鐘礦物晶 格結構中的鐘才能釋放出來，供作物生長需要。因此，有效利用解憐解鐘微生物對±壤憐鐘 的分解，成為提高±壤憐鐘有效化利用的重要途徑之一。
[0004] 蠶沙是養(yǎng)蠶生產中的主要有機廢棄物，不但含有豐富的營養(yǎng)物質，還含有豐富的 微生物菌群，經高通量測序分析，蠶沙中的微生物種類超過3000種，顯示出明顯的微生物多 樣性，其中富含具有固氮、解憐和解鐘的微生物菌群。因此如何分離篩選并有效利用其中的 微生物資源，成為本研究的關注重點。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的首要目的在于提供一株來源于蠶沙的菌株Bacillus megateri皿0P6。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述菌株Bacillus megaterium 0P6在制備±壤微生 物菌劑或生物有機肥中的應用。
[0007] 本發(fā)明目的通過W下技術方案實現：
[000引一株來源于蠶沙的菌株Bacillus megaterium(巨大芽抱桿菌)0P6,已于2015年12 月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏編號為CGMCC NO. 11837。保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編 碼為 100101。
[0009] 上述的巨大芽抱桿菌是從蠶沙中分離純化后得到，其性狀如下：
[0010] 菌落形態(tài):本發(fā)明的巨大芽抱桿菌懸液經涂板與NA培養(yǎng)基后，3(TC生化培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)2天，觀察其菌落形態(tài)特征，結果如圖1所示。由圖1可見，本發(fā)明的巨大芽抱桿菌菌落乳 白色，圓形，表面光滑稍突，不透明，邊緣整齊。
[0011] 將本發(fā)明的巨大芽抱桿菌按1%比例接種于NB培養(yǎng)基，3(TC搖床中培養(yǎng)1她后，取 懸液，點樣到載玻片、烤片，經革蘭氏染色，油鏡觀察菌株的形態(tài)特征，結果如圖2所示。由圖 2可見，本發(fā)明的巨大芽抱桿菌為革蘭氏陽性菌，芽飽楠圓形，菌體為長桿狀。
[0012] 本發(fā)明巨大芽抱桿菌的ISsrDNA鑒定：菌株懸液為模板，ISsrDNA通用引物27F/ 1492R，PCR 反應體系為 50 化，反應條件為:94°C 預變性 5111111;941：3〇3,561：3〇3,721：2111111，循 環(huán)30次;72°C延伸IOmiriDPCR產物純化后送樣測序。
[0013] 本發(fā)明巨大芽抱桿菌的ISsrDNA的部分可變區(qū)序列測序結果通過NCBI/blast比對 后發(fā)現與49-￥1412同源性最高，達99.8%^上，為巨大芽抱桿菌。
[0014] 上述菌株Bacillus megaterium 0P6在制備±壤微生物菌劑或生物有機肥中的應 用。
[0015] 上述菌株Bacillus megaterium 0P6用于制備巨大芽抱桿菌原粉，包括如下制備 步驟：
[0016] (1)活化菌種
[0017] 活化Bacillus megaterium 0P6菌株，從斜面中挑取菌落并在NA固體培養(yǎng)基劃線 培養(yǎng)，培養(yǎng)條件32°C，待0P6在NA固體培養(yǎng)基上生長18-24h后，挑取單菌落，用于一級種子液 的制備；
[0018] (2)-級種子液的制備
[0019] 選取NA固體培養(yǎng)基上的單菌落，接種于一級種子搖瓶中，將一級種子搖瓶在32°C、 20化/min下培養(yǎng)12h，得到一級種子液；
[0020] (3)二級種子液的制備
[0021] 種子罐中的培養(yǎng)基為NB液體培養(yǎng)基，12rC下，滅菌20min，將一級種子液接入種子 罐中，接種量體積比為0.5~1 % ;培養(yǎng)條件為:通氣比1:1，攬拌轉速為250~40化/min，培養(yǎng) 溫度32°C，罐壓0.05MPa，培養(yǎng)時間為12小時，培養(yǎng)結束時得到二級種子液，其活菌含量為1 ~3 X IO8C化/mL,OD值在0.7~0.8左右，此時菌種活力強；
[0022] (4)巨大芽抱桿菌0P6的菌液發(fā)酵
[0023] 發(fā)酵培養(yǎng)基配方按重量百分比：玉米淀粉1.5~3.0% ;豆巧粉1.0~2.5% ;蠶蛹粉 0.1~1.0%，酵母膏0.5~1 %，氯化鋼0.1~0.5% ;碳酸巧0.1~0.5% ;硫酸儀0.05~ 0.15% ;憐酸二氨鐘0.0 l~0.05%，硫酸儘0.0 l~0.05%，碳酸氨鋼0.05~0.15% ;pH7.0~ 7.4，121°(：滅菌3〇111111;
[0024] 將巨大芽抱桿菌0P6的二級種子液，按照接種量體積比為0.5~1 %接入發(fā)酵罐中， 培養(yǎng)條件為:通氣比為1:0.7,攬拌轉速為18化/min、罐壓0.05MPa、培養(yǎng)溫度32°C、培養(yǎng)時間 為4她，發(fā)酵過程中根據泡沫情況流加消泡劑；下罐時間W取樣鏡檢芽抱90% W上釋放為 準，成熟發(fā)酵液中巨大芽抱桿菌0P6活芽抱含量為30~40 X IO8C化/mL，得到發(fā)酵成熟菌劑；
[0025] (5)巨大芽抱桿菌原粉的制備
[0026] 步驟(4)所得的發(fā)酵成熟菌劑經碟片離屯、機或微濾設備濃縮后，加入輕質碳酸巧， 濃縮成熟發(fā)酵菌劑與輕質碳酸巧的重量比為100:3,得到液固混合物，將該液固混合物攬拌 SOmin后，利用輸料累將液固混合物送入離屯、式噴霧塔中干燥，得到巨大芽抱桿菌0P6原粉。
[0027] 所得巨大芽抱桿菌0P6原粉中活菌濃度為3~4億/克干粉。
[00巧]本發(fā)明的巨大芽抱桿菌(Bacillus megateri皿)0P6具有如下優(yōu)點及有益效果：
[0029] (1)本發(fā)明的巨大芽抱桿菌菌株來源于蠶沙，為蠶沙堆肥過程中的自生菌，與蠶沙 有機肥的配合性好；
[0030] (2)本發(fā)明的巨大芽抱桿菌0P6菌株耐高溫性好，在60度高溫下培養(yǎng)和運輸均可W 存活，在±壤微生物菌劑制備方面具有相當的優(yōu)勢；
[0031] (3)本發(fā)明的巨大芽抱桿菌0P6菌株可W高效分解±壤中無機憐和礦物質鐘，制備 成±壤微生物菌劑或添加到蠶沙有機肥后，具有顯著的解憐解鐘效果，提高±壤肥力，該菌 株可用于制備單一微生物菌劑、復合微生物菌劑、生物有機肥等；
[0032] (4)本發(fā)明的巨大芽抱桿菌0P6菌株可W有效抑制禾谷鑲刀菌（Fusarium 8曰1111311(3；[]1111]1)等±壤中作物有害病原微生物的生長，起到防治作物病害和提高作物抗病蟲 害能力的作用，從而提高作物的產量和品質。
【附圖說明】
[0033] 圖1為本發(fā)明巨大芽抱桿菌(Bacillus megateri皿)0P6的菌落形態(tài)特征圖；
[0034] 圖2為本發(fā)明巨大芽抱桿菌(Bacillus megateri皿)0P6的菌株形態(tài)特征圖。
【具體實施方式】
[0035] 下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0036] 實施例1
[0037] 巨大芽抱桿菌(Bacillus megate;rium)0P6的分離及鑒定
[0038] (1)樣品稀釋:從發(fā)酵腐熟的蠶沙堆肥中取樣，稱取5g溶解到裝有45ml無菌水的= 角瓶中，150rp振蕩器振蕩成均勻的l(Ti稀釋液，然后用Iml移液槍吸取該稀釋液Iml至裝有 9ml無菌水的試管中，充分搖勻，即制成1(T2的樣品稀釋液，并依次稀釋至1(T6;
[0039] (2)培養(yǎng)基準備：
[0040] 無機憐篩選培養(yǎng)基：葡萄糖 10.0g、Ca3(P〇4)2 5.0g、（NH4)2S〇4 0.5g、化Cl 0.2邑、 KC10.2g、MgS04?7H20 0.1g、FeS04?7出0 0.03g、MnS04?4H200.03g、酵母粉0.5g、瓊脂粉 20邑、蒸饋水10001111^、抑6.8~7.2。
[0041] 有機憐篩選培養(yǎng)基:葡萄糖 10.0g、（NH4)2S〇4 0.5g、KCl 0.3g、化Cl 0.3g、FeS〇4 ? 7出0 0.03g、MgS〇4 ? 4出0 0.03g、CaC0巧.Og、卵憐脂0.2g、瓊脂粉20g、蒸饋水 1000mL、pH7.0 ~7.5。
[0042] 解鐘培養(yǎng)基：葡萄糖10.0邑，畑4顯33.0邑，化此？041.0邑少6504*7此0 1.0邑，]\%504* 7出0 l.Og，鐘長石 1.5g，蒸饋水 1000ml，瓊脂20.0g，pH 7.0~7.4,滅菌20min。
[0043] NA培養(yǎng)基:蛋白腺IOg，牛肉膏Sg，化化5g，瓊脂粉20g，蒸饋水1000 ml，PH7.0; 121°C 滅菌20min，于45°C-55°C傾倒至無菌的培養(yǎng)皿；
[0044] (3)菌種分離、篩選:分別吸取不同稀釋倍數的稀釋液0.1ml，均勻涂布于冷卻好的 有機憐、無機憐和解鐘培養(yǎng)基，放置3(TC培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)5天，觀察并挑選長勢良好、解 憐、解鐘圈顯著的菌落于NA培養(yǎng)基培養(yǎng)；
[0045] (4)菌種純化:將所挑選出菌于NA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，再分別涂板與有機憐、無機憐和 解鐘培養(yǎng)基培養(yǎng)，選取在S種培養(yǎng)基上長勢良好、且溶憐、解鐘圈都顯著的1個菌與NA培養(yǎng) 基上培養(yǎng)純化，并命名菌株0P6;
[0046] (5)菌株的鑒定
[0047] A、形態(tài)鑒定：巨大芽抱桿菌0P6的菌落形態(tài)為乳白色，圓形，表面光滑稍突，不透 明，邊緣整齊。革蘭氏染色結果表明巨大芽抱桿菌0P6為革蘭氏陽性菌，芽飽楠圓形，菌體為 長桿狀。
[004引 B、分子生物學鑒定:0P6的16S rDNA系列分析，結果通過NCBI/blast比對后發(fā)現與 49-Y1412同源性最高，達99.8% W上，為巨大芽抱桿菌。具體序列見序列表。
[0049] (6)菌株0P6鑒定結論
[0050] 根據菌株ZFH-3的形態(tài)學及16rDNA基因系列分析，鑒定0P6為巨大芽抱桿菌 ((Bacillus megaterium)，于2015年12月7日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中屯、，保藏編號為CGMCC NO. 11837。保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中 國科學院微生物研究所，郵政編碼為100101。
[0051 ] 本實施例所得巨大芽抱桿菌(Bacillus megateri皿)0P6解憐解鐘效果測定：
[0052] 采用全氮比色法在硫酸銅或硫酸鐘存在下，濃硫酸中加入菌液，并加熱使試樣中 的氮元素全部轉化為氨態(tài)氮，與奈氏試劑反應，于420nm波長處進行比色測定，根據標準曲 線計算固氮量。
[0053] 采用鋼錬抗比色法測定發(fā)酵上清液中的有效憐含量?？扇苄詰z酸鹽在酸性條件下 可與鋼酸錠結合生產憐鋼酸酷胺，運種化合物經對苯二酪還原成藍色化合物，用可見光分 光光度計在波長720nm處測定鋼錬抗的吸光值，W定量分析可溶性憐的含量。
[0054] 與對照菌相比，本發(fā)明的巨大芽抱桿菌0P6的解憐效果與溶憐菌相當，而解鐘效果 顯著高于解鐘對照菌。
[0055] 本實施例所得巨大芽抱桿菌(BaciIlus megateri皿)0P6括抗鑲刀菌效果測定：
[0056] 采用平板對時法，在平板中央接種鑲刀菌病原菌，在距其約1-1.5cm處放置濾紙片 (去除表面活性劑，肥皂水浸泡，沖洗干凈，烘干，滅菌），點5-6ul巨大芽抱桿菌0P6的發(fā)酵 液，待完全吸收后，倒置培養(yǎng)2-3天，觀察結果。發(fā)現巨大芽抱桿菌0P6對禾谷鑲刀菌 (Fusarium sambucinum)，雙抱鑲刀菌（Fusarium catenulatum)，接骨木鑲刀菌（Fusarium graminear皿)有較好的括抗效果。
[0化7]實施例2
[0化引巨大芽抱桿菌(8日(3；[11118 1]1日旨日1日1'；[皿)0?6菌劑原粉的制備
[0059] (1)活化菌種
[0060] 活化巨大芽抱桿菌0P6菌株，從斜面中挑取菌落并在NA固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，培養(yǎng) 條件32°C，待0P6在NA固體培養(yǎng)基上生長18-24h后，挑取單菌落，用于一級種子液的制備；
[0061] (2)-級種子液的制備
[0062] 選取NA固體培養(yǎng)基上的單菌落，接種于一級種子搖瓶中，搖瓶體積為250mL，一級 種子NB液態(tài)培養(yǎng)基（12rC下，滅菌20min)的裝液量100ml，將一級種子搖瓶在32°C、200r/ min下培養(yǎng)12h，得到一級種子液；
[0063] (3)二級種子液的制備
[0064] 種子罐中的培養(yǎng)基仍為NB液體培養(yǎng)基，12rC下，滅菌20min，將一級種子液接入種 子罐中，接種量為0.5-1% (V/V);培養(yǎng)條件為:通氣比1:1，攬拌轉速為250-40化/min,培養(yǎng) 溫度32°C，罐壓0.05MPa，培養(yǎng)時間為12小時，培養(yǎng)結束時得到二級種子液，其活菌含量為1- 3 X IO8C化/mL，OD值在0.7-0.8左右，此時菌種活力強；
[0065] (4)巨大芽抱桿菌0P6的菌液發(fā)酵
[0066] 發(fā)酵培養(yǎng)基配方(重量百分比）：玉米淀粉1.5-3.0 % ;豆巧粉1.0-2.5 % ;酵母膏 0.5-1 %，氯化鋼0.1-0.5 % ;碳酸巧0.1-0.5 % ;硫酸儀0.05-0.15 % ;憐酸二氨鐘0 . Ol- 0.05%，硫酸儘0.01-0.05%，碳酸氨鋼0.05-0.15%。抑7.0-7.4，121°(：滅菌30111111;
[0067] 將巨大芽抱桿菌0P6的二級種子液，按照接種量為0.5-1% (V/V)接入發(fā)酵罐中，培 養(yǎng)條件為:通氣比為1 :〇. 7，攬拌轉速為18化/min、罐壓0.05MPa、培養(yǎng)溫度32°C、培養(yǎng)時間為 4化左右，發(fā)酵過程中根據泡沫情況流加消泡劑;下罐時間W取樣鏡檢芽抱90% W上釋放為 準，成熟發(fā)酵液中巨大芽抱桿菌0P6活芽抱含量為30~40 X IO8C化/mL，得到發(fā)酵成熟菌劑；
[0068] (5)巨大芽抱桿菌原粉的制備
[0069] 步驟(4)所得的發(fā)酵成熟菌劑(活芽抱含量為30~40 X 108c化/mL)經碟片離屯、機 或微濾設備濃縮后，加入輕質碳酸巧，濃縮成熟發(fā)酵菌劑與輕質碳酸巧的重量比為100:3， 得到液固混合物，將該液固混合物攬拌30min后，利用輸料累將液固混合物送入離屯、式噴霧 塔中干燥，得到巨大芽抱桿菌0P6原粉。
[0070] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一株來源于蠶沙的菌株Bacillus megaterium 0P6,于2015年12月7日保藏于中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 11837。2. 權利要求1所述的菌株Bacillus megaterium 0P6在制備土壤微生物菌劑或生物有 機肥中的應用。3. 根據權利要求2所述的應用，其特征在于:所述菌株BaciIlus megaterium 0P6用于 制備巨大芽孢桿菌原粉，包括如下制備步驟： (1) 活化菌種 活化Bacillus megaterium 0P6菌株，從斜面中挑取菌落并在NA固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件32°C，待0P6在NA固體培養(yǎng)基上生長18-24h后，挑取單菌落，用于一級種子液的制 備； (2) -級種子液的制備 選取NA固體培養(yǎng)基上的單菌落，接種于一級種子搖瓶中，將一級種子搖瓶在32°C、 200r/min下培養(yǎng)12h，得到一級種子液； (3) 二級種子液的制備 種子罐中的培養(yǎng)基為NB液體培養(yǎng)基，121°C下，滅菌20min，將一級種子液接入種子罐 中，接種量體積比為〇. 5~1 % ;培養(yǎng)條件為:通氣比1:1，攪拌轉速為250~400r/min，培養(yǎng)溫 度32°C，罐壓0.05MPa，培養(yǎng)時間為12小時，培養(yǎng)結束時得到二級種子液，其活菌含量為1~3 X 108cf u/mL，OD值在0 · 7~0 · 8左右，此時菌種活力強； (4) 巨大芽孢桿菌0P6的菌液發(fā)酵 發(fā)酵培養(yǎng)基配方按重量百分比：玉米淀粉1.5~3.0 % ;豆柏粉1.0~2.5 % ;蠶蛹粉0.1 ~1.0%，酵母膏0.5~1 %，氯化鈉0.1~0.5% ;碳酸鈣0.1~0.5%;硫酸鎂0.05~0.15% ; 磷酸二氫鉀0.01~0.05%，硫酸錳0.01~0.05%，碳酸氫鈉0.05~0.15% ;ρΗ7·0~7.4,121 °C 滅菌 30min; 將巨大芽孢桿菌0P6的二級種子液，按照接種量體積比為0.5~1%接入發(fā)酵罐中，培養(yǎng) 條件為：通氣比為1:〇.7，攪拌轉速為18(^/11^11、罐壓0.0510^、培養(yǎng)溫度32°(：、培養(yǎng)時間為 48h，發(fā)酵過程中根據泡沫情況流加消泡劑；下罐時間以取樣鏡檢芽孢90%以上釋放為準， 成熟發(fā)酵液中巨大芽孢桿菌0P6活芽孢含量為30~40X10 8cfu/mL，得到發(fā)酵成熟菌劑； (5) 巨大芽孢桿菌原粉的制備 步驟(4)所得的發(fā)酵成熟菌劑經碟片離心機或微濾設備濃縮后，加入輕質碳酸鈣，濃縮 成熟發(fā)酵菌劑與輕質碳酸鈣的重量比為100: 3,得到液固混合物，將該液固混合物攪拌 30min后，利用輸料栗將液固混合物送入離心式噴霧塔中干燥，得到巨大芽孢桿菌0P6原粉。4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于:所得巨大芽孢桿菌0P6原粉中活菌濃度為3 ~4億/克干粉。
【文檔編號】A01P3/00GK105925502SQ201610303583
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月9日
【發(fā)明人】李慶榮, 楊瓊, 廖森泰, 邢東旭, 肖陽, 葉明強
【申請人】廣東省農業(yè)科學院蠶業(yè)與農產品加工研究所