一種好氧反硝化假單胞菌及其應(yīng)用
【專利摘要】假單胞菌(Pseudomonas sp.)HC?1，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為CGMCC No.11924，保藏日期為2015年12月24日。本發(fā)明所提供的假單胞菌(Pseudomonas sp.)HC?1具有較高的好氧反硝化性能，用于污水生物脫氮工藝總氮去除率高達(dá)88.2％，這些特點(diǎn)在水處理領(lǐng)域具有重大意義。CGMCC No.1192420151224
【專利說明】
-種好氧反硝化假單胞菌及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程、環(huán)境工程技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種好氧反硝化菌株及其應(yīng)用，同 時(shí)提供運(yùn)種菌株的脫氮效能。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)前，隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)地迅速發(fā)展和城市化進(jìn)程地不斷深入，城市生活和工業(yè)廢水 的排放總量也在逐年增加，農(nóng)藥、化肥和合成洗涂劑等廣泛使用，使得水體中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃 度不斷升高，其中氮是引起水體富營(yíng)養(yǎng)化的主要原因之一。常規(guī)的生化處理工藝可W有效 地降低污水中的BOD和SS，但當(dāng)污水中同時(shí)存在的N、P等營(yíng)養(yǎng)物的時(shí)候，只能去除污水中30- 40 %的N元素，大量含氮污水將直接排入環(huán)境水體。
[0003] 傳統(tǒng)的生物脫氮包括好氧硝化和缺氧反硝化兩個(gè)過程:首先在好氧條件下，亞硝 酸鹽將氨氮氧化為亞硝酸鹽，而后硝酸菌將亞硝酸氮進(jìn)一步氧化為硝酸氮；隨后在缺氧條 件下，反硝化菌將硝酸氮或亞硝酸氮還原成氣體氮或者化0。好氧反硝化具有W下優(yōu)點(diǎn)：（1) 在有氧條件下進(jìn)行反硝化，使得同步硝化反硝化(SND)成為可能；（2)硝化反應(yīng)的產(chǎn)物可直 接成為反硝化反應(yīng)的底物，避免了培養(yǎng)過程亞硝酸鹽和硝酸鹽的積累對(duì)硝化反應(yīng)的抑制， 加速了硝化和反硝化進(jìn)程;同時(shí)，反硝化會(huì)補(bǔ)償硝化反應(yīng)消耗的堿度，維持了反應(yīng)系統(tǒng)pH值 穩(wěn)定，降低了操作難度和運(yùn)行成本；（3)大部分好氧反硝化菌適應(yīng)性較強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)量 高并且對(duì)溶解氧濃度要求較低，反硝化速度快且徹底，適合治理大面積氮污染水域。因此， 好氧反硝化技術(shù)作為一種全新的脫氮技術(shù)備受研究者關(guān)注。
[0004] 然而，到目前為止，好氧反硝化菌株主要集中在Pseudomonas菌屬、Bacillus菌屬 和Aeromonas菌屬，菌種較為單一，且研究多集中在降解基因和降解機(jī)理方面，實(shí)際應(yīng)效果 不佳。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一目的在于提供一種好氧反硝化效果好的假單胞菌。
[0006] 本發(fā)明的第二目的在于提供該假單胞菌在水處理中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第=目的在于提供該假單胞菌在好氧反硝化水處理中的應(yīng)用。
[000引為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一種假單胞菌，其分類命名 為假單胞菌(Pseudomonas SP. )HC-1，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中屯、，保藏單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼 為100101，其保藏編號(hào)為CGMCC No.11924,保藏日期為2015年12月24日。
[0009] 假單胞菌(Pseudomonas SP.)肥-1的生理生化鑒定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八 版操作，生理活性特征如下:假單胞菌(Pseudomonas SP. )HC-1為非發(fā)酵革蘭氏陰性菌，專 性需氧菌，生長(zhǎng)溫度范圍25-42°C，最適生長(zhǎng)溫度為25-30°C，特別是該菌在4°C不生長(zhǎng)而在 42 °C可W生長(zhǎng);菌體長(zhǎng)度為1.5-3. Own,寬度為0.5-0.祉m，單在，成對(duì)或偶爾成短鏈，菌體有 1-3根鞭毛，無(wú)芽抱;該菌株不需要有機(jī)生長(zhǎng)因素；營(yíng)養(yǎng)多樣化:單個(gè)菌株的生長(zhǎng)可利用76- 82種或更多的不同有機(jī)化合物。
[0010]革蘭氏染色表現(xiàn)為陰性:對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色、氧化酶、接觸酶、葡萄糖氧化發(fā) 酵，產(chǎn)嗎I噪，V.P.測(cè)定，M.R.測(cè)定，明膠液化，淀粉水解，巧樣酸鹽利用，硝酸鹽還原等主要生 理生化指標(biāo)試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。
[0011 ] 表1假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1的生理生化指標(biāo)
[0012]
[0013] 所述的假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1是在水處理中的應(yīng)用。
[0014] 所述的假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1是在含氮廢水處理中的應(yīng)用。
[0015] 具體應(yīng)用方法，包括W下步驟:將權(quán)利要求1所述的假單胞菌(Pseudomonas sp.) 肥-1菌落接種于培養(yǎng)基中，在25°C-42°C下培養(yǎng)12-4化，得到的發(fā)酵液作為應(yīng)用菌劑。
[0016] 優(yōu)選地，所述好氧反硝化培養(yǎng)基配方為：下二酸鋼4.7g/L、憐酸氨二鋼7.9g/L、憐 酸二氨鐘1.5g/L、氯化錠0.3g/L、硫酸儀0.1 g/L、硝酸鐘1.5g/L、微量元素Iml，余量為水，pH =7.2~7.5;所述微量元素配方為:EDTA 50g/L、硫酸亞鐵5. Og/L、硫酸鋒2.2g/L、鋼酸錠 1. Ig/L、氯化巧5.5g/L、硫酸銅1.57g/L、氯化儘5.06g/L、氯化鉆1.61g/L，余量為水。
[0017]有益效果：
[001引本發(fā)明所提供的假單胞菌(Pseudomonas sp. )HC-1具有較高的好氧反硝化性能， 用于污水生物脫氮工藝總氮去除率高達(dá)88.2%，運(yùn)些特點(diǎn)在水處理領(lǐng)域具有重大意義。
【附圖說明】
[0019] 圖1是假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1的生長(zhǎng)曲線圖；
[0020]圖2是假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1對(duì)總氮的去除效能圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ]下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)例詳細(xì)闡述本發(fā)明假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1的應(yīng)用。
[0022] 本發(fā)明使用的好氧反硝化培養(yǎng)基配方為:下二酸鋼4.7g/L、憐酸氨二鋼7.9g/L、憐 酸二氨鐘1.5g/L、氯化錠0.3g/L、硫酸儀0.1 g/L、硝酸鐘1.5g/L、微量元素Iml，余量為水，pH =7.2~7.5;所述微量元素配方為:EDTA 50g/L、硫酸亞鐵5. Og/L、硫酸鋒2.2g/L、鋼酸錠 1. Ig/L、氯化巧5.5g/L、硫酸銅1.57g/L、氯化儘5.06g/L、氯化鉆1.61g/L，余量為水。
[0023] 所述硝酸鹽還原培養(yǎng)基配方為：牛肉膏3g/L、蛋白陳5g/L、KN03lg/L、pH7.4;經(jīng) 12rC高壓蒸汽滅菌20min。
[0024] 實(shí)施例1
[0025] 假單胞菌，其分類命名為假單胞菌(Pseudomonas sp.化C-1，保藏在中國(guó)微生物菌 種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、，保藏單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó) 科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼為100101，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 11924，保藏日期為2015 年12月24日。
[00%] 所述假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1是通過W下方式獲得的：
[0027] a.取SBR反應(yīng)器運(yùn)行穩(wěn)定運(yùn)行半個(gè)月的缺氧段末的活性污泥作為分離用泥；
[0028] b.采用稀釋混合平板法進(jìn)行分離:對(duì)己分離出來的菌株在好氧條件下置于反硝化 培養(yǎng)基中進(jìn)行脫氮試驗(yàn)，同時(shí)輔助進(jìn)行硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)及異染顆粒染色（亞甲基藍(lán)染 色法)檢驗(yàn)。對(duì)于硝酸還原性為陽(yáng)性并產(chǎn)氣，且在好氧條件下能降低T腳農(nóng)度的細(xì)菌即為本發(fā) 明獲得的好氧反硝化菌。
[0029] 具體分離步驟為:從SBR反應(yīng)器缺氧段末取IOmL活性污泥至裝有90mL無(wú)菌水的S 角瓶中，加入無(wú)菌玻璃珠;將=角瓶放入搖床中充分振蕩，使細(xì)菌呈單細(xì)胞狀態(tài)分散于水 中。然后，從S角瓶?jī)?nèi)的污泥菌懸液中取ImL懸液接入裝有9mL無(wú)菌水的試管內(nèi)，得到10^1梯 度的菌懸液，繼續(xù)此步驟，依次得到l(T2、l(r3、l(r4……1(T 7梯度的菌懸液，各取ImL水樣放入 裝有含瓊脂的好氧反硝化培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿種;待培養(yǎng)基快凝卻時(shí)倒入培養(yǎng)皿中，混勻，待培 養(yǎng)基凝固后倒置培養(yǎng)皿于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3天后，分別選取不同形態(tài)、菌落清晰 的典型菌落，標(biāo)記并挑取單個(gè)菌落在平板培養(yǎng)基上進(jìn)行=區(qū)劃線分離，重復(fù)3~4次至菌落 特征一致的單菌落，最后挑取單一菌落，轉(zhuǎn)接到準(zhǔn)備好的試管斜面上W備用;上述所有操作 均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。
[0030] C.對(duì)篩選得到的菌株進(jìn)行分子鑒定，按W下步驟進(jìn)行：
[0031] 提取菌株的DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，然后利用膠回收試劑盒（回收純化PCR產(chǎn)物，之后進(jìn) 行克隆、轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆子菌落，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果位測(cè)得長(zhǎng)度為 1450bp的序列，如序列表Seq ID No: 1所示，其序列提交至GenBank, W確定菌株的種屬關(guān) 系，最終確定為假單胞菌屬(Pseudomonas SP.)。通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長(zhǎng)條件、生理生 化鑒定結(jié)果其為假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1。
[0032] 所述的PCR擴(kuò)增過程的具體步驟為：
[0033] 1化0?體系建立（2貼^:
[0034]
[0035] 2)PCR程序設(shè)定：
[0036] 預(yù)變性 95°C3min
[0037] 95 °C預(yù)變性5min，94°C變性Imin，58 °C復(fù)性30s，72 °C延伸3min，共30個(gè)循環(huán)，最后 72°C 延伸 lOmin;
[003引 3)引物序列：
[0039] 引物 1 5 ' -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3 '
[0040] 引物2 5 ' -AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3 '。
[0041] d.對(duì)篩選得到的菌株進(jìn)行生理生化鑒定，按W下步驟進(jìn)行：
[0042] 菌株的生理生化鑒定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版操作，鑒定結(jié)果為:假單胞 菌(Pseudomonas SP.)肥-1為非發(fā)酵革蘭氏陰性菌，專性需氧菌，生長(zhǎng)溫度范圍25-42°C，最 適生長(zhǎng)溫度為25-30°C，特別是該菌在4°C不生長(zhǎng)而在42°C可W生長(zhǎng);菌體長(zhǎng)度為1.5-3.化 m，寬度為0.5-0.祉m，單在，成對(duì)或偶爾成短鏈，菌體有1-3根鞭毛，無(wú)芽抱;該菌株不需要有 機(jī)生長(zhǎng)因素;營(yíng)養(yǎng)多樣化:單個(gè)菌株的生長(zhǎng)可利用76-82種或更多的不同有機(jī)化合物。
[0043] 革蘭氏染色表現(xiàn)為陰性:對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色、氧化酶、接觸酶、葡萄糖氧化發(fā) 酵，產(chǎn)嗎I噪，V.P.測(cè)定，M.R.測(cè)定，明膠液化，淀粉水解，巧樣酸鹽利用，硝酸鹽還原等主要生 理生化指標(biāo)試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。
[0044] 素^ W段巧.胞苗 T PcPiiHnmrmg C cn HP-1 的化巧化仆；
[0045]
[0046] e.脫氮試驗(yàn)
[0047] 對(duì)己分離出來的假單胞菌(Pseudomonas sp. )HC-1在好氧條件下在反硝化培養(yǎng)基 中進(jìn)行脫氮試驗(yàn)，同時(shí)輔助進(jìn)行硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)及異染顆粒染色(亞甲基藍(lán)染色法)檢 驗(yàn);對(duì)于硝酸還原性為陽(yáng)性并產(chǎn)氣，并在好氧條件下能降低T腳農(nóng)度的細(xì)菌，證明其為好氧反 硝化菌。
[004引具體試驗(yàn)如下:將假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1按常規(guī)方法活化、富集培養(yǎng)。
[0049] 富集培養(yǎng)完成后，移取IOmL懸濁液至IOOmL好氧反硝化培養(yǎng)基中30°C 16化pm/min 條件下培養(yǎng)24h;培養(yǎng)完成后SOOOrpm離屯、IOmin，取上清液測(cè)定氨氮、硝態(tài)氮、亞硝氮及TN的 含量，結(jié)果見表2。
[0050] 表2含量測(cè)定結(jié)果
[0化1 ]
[0化2] 硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)：取假單胞菌(Pseudomonas sp. )HC-1在固體瓊脂斜面上進(jìn) 行培養(yǎng)后的菌種，接種在帶杜氏小管的硝酸鹽還原培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株作2個(gè)平行試驗(yàn)，同 時(shí)另外留2管不接種做對(duì)照。
[0053] 30°C恒溫培養(yǎng)，分別在I天、3天、5天后檢測(cè)結(jié)果:檢查杜氏小管內(nèi)是否產(chǎn)氣，如有 氣泡表明有氮?dú)猱a(chǎn)生;在比色瓷盤中加入少量培養(yǎng)液，滴入1-2滴格里斯試劑A液(對(duì)氨基苯 橫酸0.5g; 10%左右稀醋酸150ml)和B液(a-苯胺0.1 g; 10%左右稀醋酸150ml;此0 20ml); 在對(duì)照管中同樣加入A液和B液各1-2滴。若溶液變?yōu)榧t色、澄色或棟色等，表示有亞硝酸鹽 存在，為硝酸鹽還原陽(yáng)性;如無(wú)紅色出現(xiàn)則可加入1-2滴二苯胺試劑(0.5g二苯胺溶于100mL 濃出S〇4,并加20ml蒸饋水稀釋，存于棟色瓶中），如不呈藍(lán)色反應(yīng)則仍為陽(yáng)性反應(yīng)，若呈藍(lán)色 反應(yīng)則為陰性反應(yīng)。
[0化4] 實(shí)施例2假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1脫氮效能測(cè)定
[0055]本發(fā)明假單胞菌(Pseudomonas SP.)肥-1能W多種有機(jī)物為碳源，可用于污水生 物脫氮。對(duì)假單胞菌（Pseudomonas sp. )HC-1生物脫氮能力進(jìn)行檢測(cè)，本發(fā)明假單胞菌 (Pseudomonas sp.)肥-1菌株進(jìn)行如下功能驗(yàn)證：
[0化6] 1)假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1生長(zhǎng)曲線測(cè)定。
[0化7] 按照測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)假單胞菌(Pseudomonas sp.化C-I的生長(zhǎng)曲 線進(jìn)行測(cè)定，每隔化取培養(yǎng)液，采用光電比濁法，在660nm波長(zhǎng)處測(cè)定菌液的0D66Q(0ptical Density),然后經(jīng)0.22pm微孔濾膜過濾，檢測(cè)濾液TN，pH值等指標(biāo)。獲得假單胞菌 (Pseudomonas sp.)肥-1生長(zhǎng)曲線如圖1所示。
[0化引從圖1中可W看出，假單胞菌(Pseudomonas sp. )HC-1的生長(zhǎng)曲線比較典型，潛伏 期較短，為化左右，運(yùn)可能是因?yàn)榧賳伟?Pseudomonas sp.)HC-l的活性較強(qiáng)，且接種前 后的培養(yǎng)條件相似，接入后在較短時(shí)間內(nèi)即可適應(yīng)新的環(huán)境。菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期約為4- 1化，1化W后開始進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期。
[0059] 2)假單胞菌(Pseudomonas sp.)肥-1脫氮效能測(cè)定
[0060] 將假單胞菌(Pseudomonas SP.)肥-1按照常規(guī)方法活化，富集培養(yǎng)。富集培養(yǎng)完成 后移取IOml懸濁液至含有100mL不含瓊脂的好氧反硝化培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，在30°C 160巧m/min條件下培養(yǎng)24h。每隔化取培養(yǎng)液，800化pm離屯、IOmin，取上清液測(cè)定氨氮、硝態(tài) 氮、亞硝氮及TN的含量，結(jié)果如圖2所示。
[0061] 從圖2可W看出，菌株HC-I有良好的好氧反硝化效果。
[0062] -般來說傳統(tǒng)反硝化理論認(rèn)為，由于溶解氧會(huì)與硝酸鹽氮競(jìng)爭(zhēng)電子受體，溶解氧 (DO)的存在會(huì)對(duì)反硝化過程起到抑制作用，從而抑制反硝化的進(jìn)行。但是，好氧反硝化理論 的提出轉(zhuǎn)變了傳統(tǒng)觀念，其理論認(rèn)為由于菌體中存在周質(zhì)硝酸鹽還原酶，因此菌株可利用 硝態(tài)氮和氧氣同時(shí)作為電子受體進(jìn)行協(xié)同呼吸。綜上所述，假單胞菌(Pseudomonas sp.) HC-I為局效的好氧反硝化菌。
[0063] 本
【發(fā)明內(nèi)容】
不僅限于上述各實(shí)施方式的內(nèi)容，其中一個(gè)或幾個(gè)【具體實(shí)施方式】的組 合同樣也可W實(shí)現(xiàn)發(fā)明的目的。
[0064] 實(shí)施例3
[0065] 挑取假單胞菌(Pseudomonas sp.化C-I菌落，菌落接種于好氧反硝化培養(yǎng)基中，在 25°C下培養(yǎng)2地，得到的發(fā)酵液作為應(yīng)用菌劑。該應(yīng)用菌劑應(yīng)用于含氮廢水處理，24h TN去 除率:87.2%。
[0066] 實(shí)施例4
[0067] 挑取假單胞菌(Pseudomonas sp. )HC-1菌落，菌落接種于好氧反硝化培養(yǎng)基中，在 42°C下培養(yǎng)4她，得到的發(fā)酵液作為應(yīng)用菌劑。該應(yīng)用菌劑應(yīng)用于含氮廢水處理，24h TN去 除率:88.5%。
[006引實(shí)施例5
[0069]挑取假單胞菌(Pseudomonas SP. )HC-1菌落，菌落接種于好氧反硝化培養(yǎng)基中，在 30°C下培養(yǎng)12h，得到的發(fā)酵液作為應(yīng)用菌劑。該應(yīng)用菌劑應(yīng)用于含氮廢水處理，24h TN去 除率:88.0%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 假單胞菌(Pseudomonas sp . )HC_1，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中心，其保藏編號(hào)為CGMCC No. 11924,保藏日期為2015年12月24日。2. 權(quán)利要求1所述的假單胞菌在水處理中的應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述的假單胞菌在含氮廢水處理中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:包括以下步驟:將權(quán)利要求1所述的假單胞菌 (Pseudomonas sp. )HC_1菌落接種于好氧反硝化培養(yǎng)基中，在25°C_42°C下培養(yǎng)12_48h，得 到的發(fā)酵液作為應(yīng)用菌劑。5. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述好氧反硝化培養(yǎng)基配方為：丁二酸鈉 4.78/1、磷酸氫二鈉7.98/1、磷酸二氫鉀1.58/1、氯化銨0.38/1、硫酸鎂0.4/1、硝酸鉀 1.5g/L、微量元素 Iml，余量為水，pH = 7.2~7.5;所述微量元素配方為:EDTA 50g/L、硫酸亞 鐵5.0g/L、硫酸鋅2.2g/L、鉬酸銨l.lg/L、氯化鈣5.5g/L、硫酸銅1.57g/L、氯化錳5.06g/L、 氯化鈷1.61 g/L，余量為水。
【文檔編號(hào)】C12R1/38GK105925508SQ201610396898
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月7日
【發(fā)明人】尹安偉, 范必平, 查正飛, 宋麗明
【申請(qǐng)人】揚(yáng)州市海誠(chéng)生物技術(shù)有限公司