一種油菜專用溶磷細菌及其菌劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種油菜專用溶磷細菌及其菌劑。一種油菜專用溶磷細菌的菌株被命名為YP206，分類命名為葡萄牙雙頭菌（Labrys portucalensis），2016年5月23日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國.武漢.武漢大學(xué)；保藏編號為CCTCC M 2016274；將所述油菜專用溶磷細菌擴大培養(yǎng)得到菌劑；將菌劑用于拌種、或包衣、或澆根、或蘸根以實現(xiàn)有效接種，為油菜提供高濃度的速效磷營養(yǎng)。本發(fā)明的油菜專用溶磷細菌可與油菜凝集素發(fā)生凝集反應(yīng)，因此與目標作物具有親和性，可在油菜根部長期定居存活，發(fā)揮促進油菜生長、提高植株含磷量、增加油菜抗逆性。本發(fā)明可以降低油菜栽培磷肥用量，提高磷肥的利用率，改變現(xiàn)有生物肥料專一性不強、使用效果不明顯的弊病，有利生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展。CCTCC NO:M 201627420160523
【專利說明】
-種油菜專用溶磯細菌及其菌劑
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種油菜專用溶憐細菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 油菜是一種重要的經(jīng)濟作物，憐素影響到油菜產(chǎn)量和質(zhì)量。憐素是生命重要的組 成元素，參與多種代謝途徑，對于油菜尤其具有重要意義。憐參與脂肪代謝，促進油菜花芽 分化，增加油脂合成量，改善油菜巧的品質(zhì)，增加油菜巧含油量;縮短油菜生育期，促進植株 健壯生長;增強油菜的抗倒伏、抗寒和抗旱能力，抵抗±壤pH的波動；能較好地增強油菜抗 御多種病蟲害的能力。因此，油菜栽培需要大量施用的化學(xué)憐肥?；适┯么龠M了油菜的生 產(chǎn)，但作物對憐肥的平均利用率只有30~40%左右，約有大量的憐肥流失、或被固定于±壤。 因此過量使用憐肥造成大量能源和資源的浪費，并產(chǎn)生嚴重的環(huán)境污染。
[0003] 實際上農(nóng)田±壤中的總憐含量很高，一般占±壤重量的0.1%~0.25%;但±壤中作 物可直接吸收利用的速效憐濃度一般在5mg/kg~50mg/kg之間，只占總憐的0.5%~2%，不能 滿足作物的需要?！廊乐写嬖谝恍┛扇軕z的細菌，運類細菌可將不溶態(tài)的憐素轉(zhuǎn)化為作物 可吸收利用的水溶性憐素營養(yǎng)，促進植物生長。已有一些研究者利用溶憐細菌制作微生物 肥料施到田間，增加±壤中速效憐濃度，減少憐肥的施用量。但是，由于普通使用的溶憐細 菌和油菜之間缺乏特異性，不能在作物根部有效地定居，使用效果波動，無法發(fā)揮預(yù)期促生 增產(chǎn)效應(yīng)，運種困境限制了溶憐細菌肥料制劑的應(yīng)用。
[0004] 生態(tài)環(huán)境中可發(fā)生相互作用的生物之間都具備一定的親和性，運樣兩者才能夠相 互識別，進而產(chǎn)生穩(wěn)定互作的關(guān)系。欲有效地利用溶憐細菌，必須要篩選到與油菜具有特異 親和性、可W高效促生的菌株，利用運種親和性菌株才可W制作油菜專用的溶憐細菌制劑。 到目前為止尚沒有關(guān)于對油菜具有特異親和性的專用溶憐細菌菌株的研究和應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對上述存在的問題，本發(fā)明提供一種油菜專用溶憐細菌及其菌劑。
[0006] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下： 一種油菜專用溶憐細菌的菌株被命名為YP206,所述油菜專用溶憐細菌的分類命名為 葡萄牙雙頭菌jOortt/caJaosis)，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，地址：中國.武 漢.武漢大學(xué);保藏日期為2016年5月23日，保藏編號為CCTCC M 2016274; 將所述油菜專用溶憐細菌在牛肉膏蛋白腺液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)得到油菜專用溶憐 菌劑;將油菜專用溶憐菌劑用于拌種、或包衣、或誘根、或薩根W實現(xiàn)有效接種，增加±壤中 速效憐濃度。
[0007] 油菜專用溶憐菌劑的具體制備操作步驟如下： 將1環(huán)葡萄牙雙頭菌(YP206)斜面菌種接種于40 mL~120 mL牛肉膏蛋白腺液體培養(yǎng)基 中，溫度25~35°C、轉(zhuǎn)速80 r/min~180 r/min條件下，震蕩培養(yǎng)1她~60h，即得到液體培養(yǎng) 物； 所述液體培養(yǎng)物即為油菜專用溶憐液體菌劑； 油菜專用溶憐液體菌劑的施用劑量為IL/畝~化/畝。
[000引在40 mL~120 mL所述液體培養(yǎng)物中加入干燥的泥炭50g~150g混勻，即制得油菜 專用溶憐固體菌劑； 油菜專用溶憐固體菌劑的施用劑量為化g/畝~3kg/畝。
[0009] 本發(fā)明的有益技術(shù)效果體現(xiàn)在W下方面： 1.本發(fā)明的油菜專用溶憐細菌可與油菜凝集素發(fā)生凝集反應(yīng)，因此與油菜具有特異親 和性，可在油菜根部長期定居存活，發(fā)揮促進油菜生長、提高產(chǎn)量的作用。
[0010] 2.采用本發(fā)明油菜專用溶憐細菌制備的液體菌劑或固體菌劑具有顯著的溶憐效 果，利用自身的代謝能力將不溶態(tài)的憐素釋放出來，大幅度提高菌液中、或±壤中速效性憐 的含量，為油菜提供高濃度的速效憐養(yǎng)分。
[0011] 3.采用本發(fā)明油菜專用溶憐細菌制備的液體菌劑或固體菌劑具有多項優(yōu)良的生 理活性，分泌高濃度的鐵載體，促進油菜對鐵素營養(yǎng)的吸收;合成適當濃度的植物生長激素 IAA，促進植物生長。
[0012] 4.本發(fā)明的液體菌劑或固體菌劑的施用劑量低，液體菌劑IL/畝~化/畝、或固體 菌劑化g/畝~化g/畝。本發(fā)明施用方法簡單，可采用或拌種、或包衣、或誘根、或薩根等方法 進行接種。與其他使用30kg/畝~50kg/畝的大劑量的生物肥料產(chǎn)品相比較，本發(fā)明可大幅度 降低資源和生產(chǎn)成本，節(jié)能環(huán)保。
[0013] 綜上所述，本發(fā)明的菌劑對油菜具有專一特異性，可在油菜根部長期存活定殖并 發(fā)揮生理功能。應(yīng)用本發(fā)明的菌劑可促進油菜對憐的吸收，提高油菜的生長量;降低憐肥的 使用量，提高±壤速效憐的含量，提高油菜的憐肥利用率。應(yīng)用本發(fā)明可W改變現(xiàn)有生物肥 料專一性不強、使用效果不明顯的弊病，有利生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展。
【具體實施方式】
[0014] 實施例1 油菜專用溶憐細菌的篩選和鑒定 1.采集在±壤中正常生長的健康油菜植株的幼根根系4g，將根系置于200 mL無菌生 理鹽水中，添加100化吐溫80，150 r/min震蕩比，采用10倍稀釋法，制成1〇-1、1〇-2、1〇-3、10一4、 1〇-5、1〇-5、1〇-7梯度懸液，分別取1〇-4、1〇- 5、1〇-5、1〇-7稀釋懸液100化涂布于溶憐細菌培養(yǎng)基 平板，3(TC培養(yǎng)60h;挑取透明圈較大的菌株，在溶憐細菌培養(yǎng)基平板上劃線純化，獲得溶憐 細菌菌株31株。
[0015] 2.制備油菜凝集素，采用油菜凝集素對上述獲得的31株溶憐細菌進行親和性凝 集試驗，獲得具有油菜親和性的溶憐菌株18株。采用鋼藍比色法測定法比較運些菌株的溶 憐活性，發(fā)現(xiàn)YP206菌株的溶憐活性最高，達到150 iig/mLW上，該菌株即為油菜專用溶憐細 困。
[0016] 3.根據(jù)通用細菌鑒定方法，測定該菌株的生理生化特征和其16S rDNA序列，將該 菌株命名為YP206,分類命名為葡萄牙雙頭菌(Zabiys ,2016年5月23日保 藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，地址：中國.武漢.武漢大學(xué)；保藏編號為CCTCC M 2016274。
[0017]實施例2 油菜專用溶憐細菌葡萄牙雙頭菌YP206菌株(Zabiys ^artucaJaosis)溶憐活性的測 定。
[001引 1.菌液制備 制備測定溶憐活性液體培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基配方:薦糖10g，NaCl 0.3g，MgS化? 7此0 0.3g，Ca3(P04)2 5.0g，MnS04?4出0 0.03g，瓊脂15~20g，KC10.3g，（NH4)2S04 0.5gFeS04? 7此0 0.03g，蒸饋水1000 mL,抑7.0~7.5。取溶憐活性培養(yǎng)基90 mL裝于250 mLS角瓶中，每 瓶接入一環(huán)YP206菌株菌苔，對照組不接菌種，每組3個平行;30°C，120 r/min搖床培養(yǎng)45h， 獲得測定溶憐活性的YP206菌株菌液。
[0019] 2.活性巧憶 采用鋼藍比色法測定YP206菌株的溶憐活性。取一環(huán)YP206菌株斜面接種于溶憐培養(yǎng)基 中，28 °C，160 r/min培養(yǎng)10 d。培養(yǎng)結(jié)束后，取10 ml菌液6000r/min離屯、IOmin;取ImL離屯、 后的上清液于比色管中，加入蒸饋水至6 ml,再加入2 ml 1 mol/L出S化溶液，2 mL鋼藍比 色液、混勻，靜止反應(yīng)15 min; W空白培養(yǎng)基取代菌液的反應(yīng)作為對照，測定在OD660的吸光 值;根據(jù)標準曲線方程求得菌液中可溶性憐的含量。
[0020] 3.溶憐活性測定結(jié)果 在上述條件下，W對照為0基準，測定YP206菌株的溶憐活性為158.07 μg/ml，YP206菌 株顯著地提高了溶液中速效憐的濃度。
[0021 ]實施例3 油菜專用溶憐液體菌劑的制備和應(yīng)用 1.油菜專用溶憐液體菌劑的制備 從溶憐細菌菌種YP206斜面上挑取1環(huán)菌種，接種于裝有150 mL無菌牛肉膏蛋白腺液體 培養(yǎng)基的500 mLS角瓶中，30°C，150 r/min震蕩3她，即制得油菜專用溶憐細菌YP206液體 菌劑。
[00。] 2.油菜接種栽培 將油菜種子至于蒸饋水中室溫浸泡4~化，置于28°C人工氣候箱中光暗比14:10催芽至 油菜種子露白。取風(fēng)干黃褐上置于花盆中，2.5 kg/盆，每盆種植10~15顆催芽露白油菜種 子;對照組A按正常田間栽培施肥，對照組B和實驗組憐肥施用量均減半;每盆接種油菜專用 溶憐細菌YP206液體菌劑3 mL，對照組只接進3 mL空白培養(yǎng)基;待苗出齊后每盆定苗3株，日 常管理水肥，待油菜植株生長至75 d后，收獲油菜植株，測定油菜植株干重和葉片含憐量， 試驗測定結(jié)果如下表。
[0023] 從表中數(shù)據(jù)可見，實驗組油菜植株干重比對照組B增加33.6%，但比對照組A略低； 實驗組油菜根干重比對照組B增加24%，比對照組A低5%;葉片含憐量比施同樣水平憐肥的對 照組B增加15.5%，比對照組A高16%。施用油菜專用溶憐細菌YP206的液體菌劑可大幅度降低 憐肥用量，提高油菜對憐的吸收，促進油菜生長。
[0024] 實施例4 油菜專用溶憐固體菌劑的制備和應(yīng)用 1.油菜專用溶憐固體菌劑的制備 從溶憐細菌菌種YP206斜面上挑取1環(huán)菌種，接種于裝有50 mL無菌牛肉膏蛋白腺液體 培養(yǎng)基的250 mLS角瓶中，32°C，130 r/min震蕩30h，加入干燥的泥炭80 g混勻即制得油菜 專用溶憐細菌YP206固體菌劑。
[002引2.油菜接種栽培 方法同前，施肥水平提高（見下表），每盆接種YP206固體菌劑4.5g，對照接經(jīng)100°C、 20min滅活處理的固體菌劑4.5g;正常管理，85 d后收獲油菜植株，測定油菜植株干重和葉 片含憐量;測定實驗前后上壤中速效憐的含量，計算憐素的平衡;測定結(jié)果如下表。
[0026] * :實驗中對照組A施用223mg/盆的（NH2) 2冊〇4，其中含憐為24%，計算施憐量為 54mg，對照組B和實驗組為27mg。
[0027] 從表中數(shù)據(jù)可見，接種YP206固體菌劑的實驗組油菜干重比對照組B增加29.5%，比 對照組A低7%。接種YP206固體菌劑的實驗組植株含憐量比對照組B增加12%，比對照組A高 16.5%。施用油菜專用溶憐固體菌劑可大幅度降低憐肥用量，提高植株含憐量，促進油菜生 長。
[0028] 根據(jù)測定的數(shù)據(jù)計算憐素的平衡:憐素平衡=試驗前憐素量-試驗后憐素量，正值 代表施進的憐被固定，負值代表±壤中原有固定態(tài)的憐被釋放。
[0029] 試驗前憐素水平=試驗前±壤平均速效憐含量X每盆±壤重量+施憐量 試驗后憐素水平=試驗后±壤平均速效憐含量X每盆±壤重量+油菜憐積累量 從計算的數(shù)據(jù)可知，由于在對照組A中施用了較多的憐肥，導(dǎo)致大量施進±壤的憐素被 固定，造成浪費;對照組B憐素基本平衡，但長勢低于實驗組;在對照組C中，由于沒有施進憐 月己，±壤中原來存在的一些微生物的獲得釋放了少量的速效憐，但總量不夠，植株生長很 弱；在接種YP206固體菌劑的實驗組±壤中，±壤中原有的大量固定態(tài)的憐素也被釋放，植 株生長良好。
[0030] 肥料利用率計算公式:肥料利用率=(A-A0)/BX 100% 式中 A，施憐肥處理植株含憐素總量，mg; AO，不施憐肥植株含憐素總量，mg; B，施肥磯素總景，mg。
[0031] 聯(lián)巧YP Wb回體菌刑的溫栽畑采刈憐肥的利用準巧顯者局于施和問氷干肥料的對 照組B和施100%水平對照組A，說明接種YP206固體菌劑可W大幅度提高肥料利用率，促進油 菜對營養(yǎng)元素的吸收。溶憐菌YP206大幅度提高憐肥的利用率，可將±壤中緩效憐轉(zhuǎn)化為速 效憐，增加±壤速效憐含量，供油菜吸收和利用，促進油菜生長。
【主權(quán)項】
1. 一種油菜專用溶磷細菌，其特征在于：一種油菜專用溶磷細菌的菌株被命名為 YP206,所述油菜專用溶磷細菌的分類命名為葡萄牙雙頭菌(Zafe/ys joorit/caiaosis)，保藏 在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2016年5月23日，保藏編號為CCTCC M 2016274。2. 由權(quán)利要求1所述一種油菜專用溶磷細菌制備的菌劑，其特征在于： 將所述油菜專用溶磷細菌在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)得到油菜專用溶磷 菌劑;將油菜專用溶磷菌劑用于拌種、或包衣、或澆根、或蘸根以實現(xiàn)有效接種，增加土壤中 速效磷濃度。3. 制備權(quán)利要求2所述的油菜專用溶磷菌劑的方法，其特征在于具體操作步驟如下： 將1環(huán)葡萄牙雙頭菌(YP206)斜面菌種接種于40 mL~120 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基 中，溫度25~35°C、轉(zhuǎn)速80 r/min~180 r/min條件下，震蕩培養(yǎng)18h~60h，即得到液體培養(yǎng) 物； 所述液體培養(yǎng)物即為油菜專用溶磷液體菌劑； 油菜專用溶磷液體菌劑的施用劑量為IL/畝~3L/畝。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的油菜專用溶磷菌劑的制備方法，其特征在于： 在40 mL~120 mL所述液體培養(yǎng)物中加入干燥的泥炭50g~150g混勾，即制得油菜專用 溶磷固體菌劑； 油菜專用溶磷固體菌劑的施用劑量為I kg/畝~3kg/畝。
【文檔編號】C12R1/01GK105925509SQ201610420910
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月16日
【發(fā)明人】周可金, 白莉敏, 唐欣昀, 朱英華, 朱宗河, 曹媛媛, 孫樂妮, 陳曉琳, 鄧瑞寧
【申請人】安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)