一株空間不動(dòng)桿菌lct-h3的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株“神舟九號(hào)”飛船返回艙中分離得到下行菌株不動(dòng)桿菌LCT?H3（Acinetobacter sp. LCT?H3），其菌體形態(tài)為短桿狀，可利用多種碳源生長(zhǎng)，并且可以響應(yīng)不同濃度的鐵離子，全基因組測(cè)序分析其基因組大小為3.13 Mbp，包括2760個(gè)編碼序列和74個(gè)RNA基因，COG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)共注釋到21組COG功能分類。對(duì)研究密閉飛行器內(nèi)微生物種類、分布及特點(diǎn)等提供了一定幫助。CGMCC No.1257120160601
【專利說明】
-株空間不動(dòng)桿菌LCT-H3
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域;更具體地，本發(fā)明設(shè)及不動(dòng)桿菌LCT-H3及其生物學(xué)特 性、全基因組學(xué)測(cè)序。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著航天技術(shù)的發(fā)展，人類的外太空探索活動(dòng)越來越頻繁。在地面上微生物幾乎 無(wú)處不在，大多數(shù)存在于人類皮膚、口腔、鼻咽部和胃腸道。盡管載人飛船及內(nèi)部物品等經(jīng) 過嚴(yán)格的真空消毒，載人航天器密閉環(huán)境條件下仍然容易滋生細(xì)菌和真菌等微生物，運(yùn)些 微生物能在密閉艙室內(nèi)的金屬、高分子復(fù)合材料等表面形成生物膜，它們的生長(zhǎng)繁殖和代 謝會(huì)對(duì)材料產(chǎn)生腐蝕，嚴(yán)重威脅空間站的長(zhǎng)期在軌運(yùn)行安全，縮短空間站的服役時(shí)間。研究 密閉航天器內(nèi)的微生物種類對(duì)于航天器內(nèi)微生物的安全防護(hù)具有重要的意義。
[0003] 早期人們對(duì)許多環(huán)境微生物的認(rèn)識(shí)僅來自于對(duì)16S rRNA的研究，一些重要的遺傳 信息很難獲得?，F(xiàn)在越來越多的新的培養(yǎng)和分子生物學(xué)方法，例如基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、 宏基因組學(xué)等，被用來研究新獲得微生物的潛在特征和功能等。
[0004] 隨著人類基因組計(jì)劃的實(shí)施和進(jìn)行，生物體基因組研究已經(jīng)成為生命科學(xué)研究的 前沿領(lǐng)域，而與之相對(duì)應(yīng)的微生物基因組研究正在廣泛開展。細(xì)菌是微生物的一種，其基因 組小、操作簡(jiǎn)單且實(shí)驗(yàn)周期短，其研究的工作可為人類基因組研究提供有益的參考；同時(shí)隨 著測(cè)序技術(shù)的更新?lián)Q代和高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，細(xì)菌基因組的測(cè)序成本和所需時(shí)間已大 幅度降低。初步研究了該菌的表型及生理生化特征，對(duì)研究密閉飛行器內(nèi)微生物種類分布、 材料的微生物腐蝕等提供了幫助。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的菌株不動(dòng)桿菌LCT-H3(Acinetobacter SP. LCT-H3)為"神舟九號(hào)"飛船 的返回艙內(nèi)的冷凝水中分離得到。
[0006] 本發(fā)明提供的該菌株，其保藏號(hào)為CGMCC 12571。
[0007] 菌株LCT-H3可在MH固體平板上形成無(wú)色、表面光滑且邊緣整齊菌落。為革蘭氏陰 性菌。菌體呈桿狀，分散排布，無(wú)芙膜，無(wú)芽抱，表面沒有鞭毛，但有菌毛結(jié)構(gòu)。LCT-冊(cè)菌株可 利用多種碳源，包括單糖(葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖等）、二糖(龍膽二糖、乳糖、蜜二糖 等），多糖(果膠、糊精等）W及多種無(wú)機(jī)碳源等，對(duì)四環(huán)素、慶大霉素、左氧氣沙星、頭抱贓酬 等多種抗生素敏感。在鐵離子缺乏條件下，生長(zhǎng)受到明顯抑制。
[000引所述的菌株LCT-冊(cè)菌株，進(jìn)行了全基因組測(cè)序，并進(jìn)行分析，其基因組大小為3.13 Mbp，GC含量為44.3%，包括2760個(gè)蛋白編碼基因和74個(gè)RNA基因。其中，COG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后， 2131個(gè)蛋白被分類注釋為21類COG家族。


【附圖說明】
[0011] 圖1菌株LCT-冊(cè)的16S rRNA基因序列NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0012] 圖2菌株LCT-冊(cè)的革蘭氏染色結(jié)果。
[0013] 圖3菌株LCT-冊(cè)的生理生化鑒定分析。
[0014] 圖4菌株LCT-冊(cè)的藥敏分析。
[0015] 圖5菌株LCT-冊(cè)的透射及掃描電子顯微鏡觀察。
[0016] 圖6菌株LCT-H3在不同鐵離子濃度下的生長(zhǎng)曲線。
[0017] 圖7菌株LCT-H3在不同鐵離子濃度下的差異蛋白分析。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下述實(shí)施實(shí)例中所用的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0019] 下述實(shí)施實(shí)例中所用的材料、試劑，如無(wú)特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0020] 實(shí)施實(shí)例一:菌株LCT-冊(cè)培養(yǎng)。
[0021] 菌株LCT-H3為"神舟九號(hào)"飛船的返回艙內(nèi)冷凝中分離得到的下行菌株。菌株分 別于37 °C培養(yǎng)箱或搖床中進(jìn)行靜置或振蕩培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基均為L(zhǎng)B(Trptone lOg/L， Yeast extract 5g/l, NaCl 5g/l,閒7.3)，固體培養(yǎng)基為MH 平板。
[0022] 實(shí)施實(shí)例二:菌株LCT-冊(cè)菌種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。
[0023] LCT-H3接種至LB液體培養(yǎng)基，37 DC，180 rpm過夜培養(yǎng)，6000 rpm離屯、5 min收集 菌體，棄上清。利用Qiagen公司的基因組DNA提取試劑盒(Code No. 51304,詳細(xì)步驟見產(chǎn) 品說明書）提取收集的菌體的基因組DNA。WLCT-H3的基因組DNA為模板，利用細(xì)菌16S rRNA 通用巧U 序引 物 27F(5'一 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 3'）^ni492R(5'一 TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）擴(kuò)增其16s rRNA片段并測(cè)序，得到其堿基序列。用CLUSTALW 化1：19://\￥麗.613；[.日。.址/1'0013/1113日/。11131日1￥2/)進(jìn)行多序列比對(duì)，并用1664 5.0構(gòu)建 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。
[0024] 實(shí)施實(shí)例S:菌株LCT-冊(cè)的革蘭氏染色。
[00巧]采用革蘭氏染色試劑盒（Code No. G1060, Solarbio)對(duì)LCT-H3菌體進(jìn)行革蘭氏 染色。LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)菌體，將菌液滴于載玻片中央，在酒精燈上略加溫，使之迅速 干燥。結(jié)晶紫、沙黃染色液對(duì)干燥菌體一次染色脫色，詳細(xì)步驟見產(chǎn)品說明書。染色完成并 驚干后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況，先用顯微鏡低倍鏡找到目標(biāo)視野，然后再用油鏡 (IOOX)進(jìn)行觀察，判定并記錄結(jié)果、拍照，見圖2,革蘭氏染色陰性桿菌，呈單個(gè)、分散排列。 [00%] 實(shí)施實(shí)例四：菌株LCT-冊(cè)的生理生化鑒定實(shí)驗(yàn)。
[0027] Biolog微孔板(Biolog GENIII MicroPlate, Biolog)用來對(duì)LCT-H3菌株進(jìn)行94 種表型檢測(cè)，其中包括71種碳源利用率分析和23種化學(xué)敏感性分析。LCT-H3接種至BHI液體 培養(yǎng)基，37。(：，180巧m過夜培養(yǎng)，6000巧m離屯、5 min收集菌體，棄上清。將菌體用IF- B接 種液懸浮并調(diào)節(jié)至適當(dāng)濃度(0D600約為0.8，菌體濃度約107~108)，分別取100 Ul接種液加 入Biolog微孔板的96個(gè)孔中，將微孔板放置在37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，進(jìn)行觀察，見 圖3,同時(shí)用酶標(biāo)儀測(cè)定590 nm各孔的吸光度值(0D590)作為輔助結(jié)果。
[0028] 實(shí)施實(shí)例五:菌株LCT-冊(cè)的抗生素敏感性檢測(cè)。
[0029] LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)菌體，用滅菌的棉簽薩取菌液后涂布MH固體平板，盡可能 地涂布均勻，涂4個(gè)平板;粘貼藥敏片或藥敏E-TEST試紙，選擇抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，W檢測(cè) 菌株對(duì)不同抗生素的敏感程度；貼完藥敏片后，將平板放置在37°C下培養(yǎng)18~24h;觀察結(jié) 果，將平板取出觀察各藥敏片的抑菌情況，并記錄抑菌圈的大小(直徑cm),其中藥敏片直徑 約為0.6cm。結(jié)果見表3和圖4。
[0030] 表3菌株LCT-冊(cè)藥敏試驗(yàn)。
[0031] 實(shí)施實(shí)例六:菌株LCT-冊(cè)的電子顯微鏡觀察。
[0032]分別在透射電子顯微鏡(TEM)和掃描電子顯微鏡(SEM)下觀察菌體形態(tài)。1 ml培養(yǎng) 至穩(wěn)定前期的菌液，6000巧m離屯、5 min收集菌體，棄上清;PBS緩沖液洗涂一次后將菌體懸 浮至合適濃度。菌懸液等體積與4%多聚甲醒+0.5%戊二醒溶液混合，滴在有支持膜的銅網(wǎng) 上，15 min后用濾紙吸取未吸附樣品；吸取憐鶴酸染液小屯、滴在銅網(wǎng)上，染色1 min后用濾 紙吸取未吸附的樣品；樣品干燥后在化ilips EM 400T型透射電子顯微鏡(TEM)下觀察菌體 形態(tài)。首先用2.5%戊二醒、PBS緩沖液W及1%餓酸清洗菌體，乙醇梯度脫水并乙酸異戊醋置 換，樣品干燥后做噴金處理(4)，處理好的樣品置于FEI Quanta 200型掃描電鏡下觀察。結(jié) 果如圖5所示，菌體形態(tài)為桿狀，沒有鞭毛，但有菌毛，透射電鏡下可觀察到深色致密區(qū)域。
[0033] 實(shí)施實(shí)例屯:菌株LCT-冊(cè)在不同鐵離子濃度條件下的生長(zhǎng)曲線。
[0034] 活化菌株，在15ml試管(4ml培養(yǎng)基）中過夜培養(yǎng)，然后接種至裝有6ml LB液體培養(yǎng) 基和6ml含終濃度200uM DIP(，鐵馨合劑）的LB培養(yǎng)基的15ml試管中，不同時(shí)間點(diǎn)取菌液 ISOul，用酶標(biāo)儀測(cè)定630 nm的吸光度值(0D630)。將菌株在兩種培養(yǎng)條件下所得到的OD值 進(jìn)行平均值的計(jì)算，然后再繪制曲線，見圖6,從圖中可看出，培養(yǎng)基中加入200UM DIP后， LCT-冊(cè)菌株基本不生長(zhǎng)。
[0035] 實(shí)施實(shí)例八:菌株LCT-冊(cè)在不同鐵離子濃度下的差異蛋白分析。
[0036] LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)兩管菌體至穩(wěn)定前期，無(wú)菌條件下6000 g，5 min，4°C離屯、收 集菌體;棄掉上清后，將菌體分別轉(zhuǎn)移至等體積的LB和含終濃度200UM DIP()的LB培養(yǎng)基 中，培養(yǎng)6小時(shí)。6000 g，5 min，4°C離屯、收集菌體，棄上清，用PBS緩沖液重新懸浮菌體并 洗涂一次。加入50ul SDS-PAGE上樣緩沖液重懸上述菌體沉淀，煮沸IOmin ,1000 Og離屯、 lOmin，上清即為全菌體蛋白樣品。將W上蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，電泳結(jié)束后 對(duì)凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，分離比較差異蛋白條帶，如圖7,可W發(fā)現(xiàn)在鐵缺乏的條件下， 出現(xiàn)了 一條差異蛋白條帶，大小約70-80邸a。
[0037] 實(shí)施實(shí)例九:菌株LCT-冊(cè)的基因組測(cè)序、組裝及注釋。
[0038] 基因組DNA樣品委托美吉生物有限公司進(jìn)行全基因組序列測(cè)定、基因預(yù)測(cè)、基因功 能注釋、非編碼RNA預(yù)測(cè)等工作，序列分析工作委托美吉生物有限公司和上海滿宇生物科技 有限公司共同完成。
[0039] 基因組DNA提取后進(jìn)行質(zhì)量鑒定，在濃度和純度達(dá)到測(cè)序要求后進(jìn)行全基因組測(cè) 序。利用Covaris進(jìn)行基因組DNA片段化，構(gòu)建插入片段約300-500 bp的基因組測(cè)序文庫(kù)， 通過橋式PCR擴(kuò)增得至化NA簇，然后采用I Ilumina化seq2000測(cè)序技術(shù)完成該菌株的基因組 掃描測(cè)序，獲得約1 Gb的原始測(cè)序數(shù)據(jù)。Illumina HiSeq2000測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù) 經(jīng)過Base化Iling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，結(jié)果WFASTQ文件格式來存儲(chǔ)，包含測(cè)序read的序 列信息W及測(cè)序質(zhì)量信息；原始數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理去除接頭、引物及低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，利用 SOAPdenovo化ttp://soa P.genomics.org.cn/)拼接軟件對(duì)優(yōu)化序列進(jìn)行多個(gè)Kmer參數(shù) 的拼接，得到最優(yōu)的組裝結(jié)果，并運(yùn)用GapCloser軟件對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行局部?jī)?nèi)桐填充和堿 基校正；分別利用RNAmmer和tRNAscan-SE軟件對(duì)基因組中包含的rRNA和tRNA進(jìn)行預(yù) 測(cè)J;利用Glimmer 3 .(Khttp://www. cbcb.umd.edu/software/glimmer/)軟件進(jìn)行基因預(yù) 測(cè);利用各種數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因功能注釋和分類。
[0040] 關(guān)于保藏的LCT-H3菌株的說明 A. 菌種的保藏單位名稱和地址 名稱：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、 地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 B. 交機(jī)構(gòu)保藏的日期 2016年6月1日 C. 保藏機(jī)構(gòu)給予的保藏號(hào) CGMCC No.12571 D. 分類命名 不動(dòng)桿菌 Acinetobacter sp.o
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株"神舟九號(hào)"飛船返回艙中分離得到下行菌株不動(dòng)桿菌LCT-H3(Acinetobacter sp · LCT-H3)，其保藏號(hào)為CGMCC 12571。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的下行菌株LCT-H3，其特征在于:為桿狀的革蘭氏陰性菌，分散 排列，菌落直徑約0.5 -1.0 mm，菌落為圓形，無(wú)色，不透明，表面光滑，邊緣整齊，細(xì)菌無(wú)莢 膜，無(wú)芽孢;化學(xué)異養(yǎng)細(xì)菌，可利用葡萄糖、纖維二糖等多種碳源;對(duì)多種抗生素敏感;在鐵 離子缺乏條件下，生長(zhǎng)受抑制。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的下行菌株LCT-H3,對(duì)該菌進(jìn)行16S rRNA測(cè)序，并進(jìn)行全基因組 測(cè)序并進(jìn)行分析。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK105925510SQ201610456292
【公開日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月22日
【發(fā)明人】劉長(zhǎng)庭, 周宏 , 張學(xué)林, 方向群, 姜學(xué)革, 郭英華, 劉巖, 徐綢, 潘磊, 李佳, 余昳
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院