一株高效轉(zhuǎn)化延胡索酸為l-天冬酰胺的重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株能夠高效轉(zhuǎn)化延胡索酸為L?天冬酰胺的重組大腸桿菌，將耐銨型大腸桿菌BEW308中編碼富馬酸酶的基因fumA、fumB、fumC失活，再將編碼L?天冬氨酸酶和L?天冬酰胺酶編碼基因插入到編碼富馬酸酶fumAC基因的位置，即得到無蘋果酸副產(chǎn)、少量L?天冬氨酸積累并主產(chǎn)L?天冬酰胺的重組大腸桿菌。本發(fā)明還公開了上述菌株的構(gòu)建方法及應(yīng)用。本發(fā)明可實現(xiàn)L?天冬氨酸酶和L?天冬酰胺酶的組成型高活性表達，并最終實現(xiàn)延胡索酸至L?天冬酰胺的轉(zhuǎn)化。
【專利說明】
-株高效轉(zhuǎn)化延胡索酸為L-天冬醜胺的重組大腸桿菌及其構(gòu) 建方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一株轉(zhuǎn)化延胡索酸合成k天冬酷胺生產(chǎn) 菌株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] k天冬酷胺是k天冬氨酸的徑基酷胺化合物，在醫(yī)藥、食品、輕化工和水環(huán)保方面 具有廣泛的用途，在醫(yī)藥行業(yè)主要作為氨基酸輸液中的二十種之一，并具有治療皮膚病的 功效。在食品行業(yè)只要作為營養(yǎng)增補劑，抗酒精中毒劑，也可進一步衍生做香味劑。在化工 行業(yè)主要做鐵鹽的穩(wěn)定劑及陶瓷表面的薄膜。在環(huán)保行業(yè)是水處理膜的重要原料。
[0003] 目前k天冬酷胺的生產(chǎn)主要天冬氨酸為原料經(jīng)醋化氨解，精制而成，但其過 程產(chǎn)物收率偏低，且設(shè)及大量的有機溶劑，污染大，廢水難處理。生物法具有反應(yīng)溫和、轉(zhuǎn)化 率高、S廢易處理等優(yōu)點，是k天冬酷胺最佳的生產(chǎn)方式，但k天冬氨酸轉(zhuǎn)化為心天冬酷胺 過程中設(shè)及到輔酶的參與，因此需要解決輔酶的供給問題，本發(fā)明基于此構(gòu)建了具有高效 轉(zhuǎn)化合成心天冬酷胺的菌株，并建立了其發(fā)酵工藝，生產(chǎn)指標(biāo)具有顯著的經(jīng)濟性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一株利用延胡索酸合成心天冬酷胺的重組大腸 桿困。
[0005] 本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是，提供上述能夠高效轉(zhuǎn)化延胡索酸合成心天冬酷胺 重組大腸桿菌在制備k天冬酷胺中的應(yīng)用。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] 一株高效轉(zhuǎn)化延胡索酸為-天冬酷胺的重組大腸桿菌，將耐錠型大腸桿菌邸W308 中編碼富馬酸酶的基因化減、化1118、化1]1(：失活，再將編碼心天冬氨酸酶基因和編碼心天冬酷 氨酶基因插入到編碼富馬酸酶的fumAC基因位置，即得高效轉(zhuǎn)化延胡索酸為-天冬酷胺的重 組大腸桿菌。所述的耐錠型大腸桿菌BEW308,該菌株的保藏號為CCTCC N0:M2013157,該菌 株的詳細(xì)信息已經(jīng)在申請?zhí)枮?01310279778.6的中國專利中公開。
[000引其中，所述編碼k天冬氨酸酶的基因序列如SEQ ID NO: 1所示，所述編碼k天冬酷 胺酶的基因序列如SEQ ID N0:2所示。
[0009] 其中，1^-天冬氨酸酶基因的起始密碼子上游有一段信號膚，該信號膚的基因序列 如SEQ ID N0:3所示，將k天冬氨酸酶基因的終止密碼子刪除，在心天冬氨酸酶基因的末端 與心天冬酷氨酶基因之間有一段連接序列，該連接序列如SEQ ID N0:4所示。
[0010] 上述高效轉(zhuǎn)化延胡索酸為天冬酷胺的重組大腸桿菌的制備方法，其特征在于，包 括如下步驟：
[00川 （1)將PKD46質(zhì)粒轉(zhuǎn)入耐錠型大腸桿菌BEW308中，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子大腸桿菌 BEW308-地D46，利用k阿拉伯糖誘導(dǎo)其表達A重組酶，再將大腸桿菌肥W308-P邸46制備成感 受態(tài)細(xì)胞；
[001^ (2似PIJ773質(zhì)粒為模板，沈Q ID N0:5和沈Q ID N0:6所示的序列為引物，PCR擴 增得到fumB基因敲除片段；
[001引（3)將步驟(2)得到的化mB基因敲除片段電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌肥W308-PKD46制備成 感受態(tài)細(xì)胞中，在安普抗性平板上篩選陽性重組子；
[0014] (4)將步驟(3)得到的陽性重組子制備成感受態(tài)細(xì)胞，將PCP20質(zhì)粒轉(zhuǎn)化其中，42°C 誘導(dǎo)FLP重組酶表達，在安普霉素抗性平板和無抗性的平板上進行雙挑實驗，在物抗性的平 板上生長，但不能在有安普霉素抗性的平板上生長的菌株為化mB基因失活的菌株邸W308- A fumB;
[0015] (5)合成同源重組片段:在SEQ ID NO: 1起始密碼子ATG前增加信號膚序列SEQ ID NO: 3，刪除心天冬氨酸酶基因的終止密碼子，并在k天冬氨酸酶基因后添加連接序列SEQ ID N0:4,該片段還包括安普霉素抗性基因序列，并在該片段的兩端添加了fumAC的同源臂， 具體序列如SEQ ID NO:7所示；
[0016] (6)將步驟(4)得到的化mB基因失活的菌株邸W308-A化mB制備成感受態(tài)細(xì)胞，將 PKD46質(zhì)粒轉(zhuǎn)化其中，利用k阿拉伯糖誘導(dǎo)其表達A重組酶，再將其制備成感受態(tài)細(xì)胞；
[0017] (7)將步驟巧）中的同源重組片段轉(zhuǎn)化至步驟(6)的含有A重組酶的感受態(tài)細(xì)胞中， 在安普抗性平板上篩選陽性重組子；
[001引（8)將步驟(7)中的陽性重組子制備成感受態(tài)細(xì)胞，將PCP20質(zhì)粒轉(zhuǎn)化其中，42 °C誘 導(dǎo)化P重組酶表達，在安普霉素抗性平板和無抗性的平板上進行雙挑實驗，在無抗性的平板 上生長，但不能在有安普霉素抗性的平板上生長的菌株即為能夠高效轉(zhuǎn)化延胡索酸為天冬 酷胺的重組大腸桿菌邸W308 A fumB-AfumAC-aspC2-30-asnA。
[0019] 上述轉(zhuǎn)化延胡索酸為-天冬酷胺的重組大腸桿菌在生產(chǎn)k天冬酷胺中的應(yīng)用。
[0020] 其中，其發(fā)酵過程分為誘導(dǎo)階段和轉(zhuǎn)化階段。
[0021] 其中，誘導(dǎo)階段培養(yǎng)基配方為:延胡索酸20g/L，酵母粉24g/L，蛋白腺10g/L，K2HP化 36mmol/L，MgS〇4 lOmmol/L，微量元素 [CaCl2.6H20 0.74g/L，ZnS04.7H20 0.18g/L， MnS04.出0 20g/L，Na2-EDTA20.1g/l，CuS04 Q.lg/L，CoCl2 0.104g/L，F(xiàn)eS04.7此02g/L]2mL/ U溶劑為水，抑為7.2~7.5。
[0022] 轉(zhuǎn)化階段補料發(fā)酵:誘導(dǎo)階段結(jié)束后分次補加總計葡萄糖40~60g/L，延胡索酸 150~200g/L。
[0023] 其中，誘導(dǎo)階段溫度為28~30°C，pH為7.2~7.8,溶氧為5~40%;轉(zhuǎn)化階段溫度為 30~37°(：，口出％7.2~7.8，溶氧為5~40%。
[0024] 其中，葡萄糖補加方式為將葡萄糖配置成600g/L的儲液，并根據(jù)發(fā)酵液體積分兩 次補加，總計40~60g/l;延胡索酸的補加方式為配成400g/L的延胡索酸混懸液，并用氨水 調(diào)節(jié)抑至中性，分5次補加總計約150~200g/L的延胡索酸。
[00巧]有益效果：
[00%] (1)本發(fā)明可實現(xiàn)k天冬氨酸酶和k天冬酷胺酶的組成型高活性表達，且發(fā)酵培 養(yǎng)后獲得的細(xì)胞具有低富馬酸酶活性。
[0027] (2)通過誘導(dǎo)-轉(zhuǎn)化兩階段發(fā)酵過程，其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中主要是心天冬酷胺(底物的摩 爾轉(zhuǎn)化率超過97.5%)，有少量k天冬氨酸積累，無蘋果酸積累。該方法可有效提高底物延 胡索酸的轉(zhuǎn)化收率，降低副產(chǎn)物的生產(chǎn)，有效降低生產(chǎn)成本。
【附圖說明】
[002引圖1敲除fumB基因的線性片段PCR圖，泳道M為marker,泳道1為線性片段。
[00巧]圖2菌落PCR鑒定圖，其中邸W308泳道為出發(fā)菌株，M為Markera~8為鑒定的單菌 落。
【具體實施方式】
[0030] 根據(jù)下述實施例，可W更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0031] 實施例1:
[0032] 本實施例說明利用同源重組技術(shù)敲除親本耐錠型大腸桿菌BEW308中富馬酸酶 fumB基因，得到消除安普霉素抗性菌株的過程。
[0033] (1)利用LB培養(yǎng)基，于37°C、有氧條件下培養(yǎng)大腸桿菌邸W308至ODsoo = O. 4~0.6， 制備成電轉(zhuǎn)感受態(tài)；
[0034] (2)將地D46質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入感受態(tài)的大腸桿菌邸W308。電擊條件為:200 Q，2扣F，電擊 電壓2.3kv，電擊時間4~5ms。電擊后迅速將菌體加入預(yù)冷1血的SOC培養(yǎng)基，150r/min、30°C 培養(yǎng)化之后涂布于帶氨節(jié)青霉素(amp)的LB培養(yǎng)基平板篩選出陽性轉(zhuǎn)化子BEW308(地D46);
[0035] (3)在LB培養(yǎng)基中加入1〇11^的心阿拉伯糖，于30°C下誘導(dǎo)質(zhì)粒地D46表達出A重組 酶，制成電轉(zhuǎn)感受態(tài)；
[0036] (4) W兩側(cè)帶有FRT位點的安普霉素抗性基因為模板，利用高保真PCR擴增系統(tǒng)，W 質(zhì)粒PIJ773為模板，并設(shè)計兩端帶有化mB同源片段的擴增引物，擴增出線性DNA同源片段， 引物序列如下：
[0037] 上游帶同源臂引物Hl-Pl(沈Q ID N0:5):
[0038] 5' -0GGCA0GCCATTTT0GAATAACAAATACAGAGTTACAGGCTGGAAGCTATTC0GGGGATC0GT0GACC-3'
[0039] 下游帶同源臂引物肥-P2(沈Q ID N0:6):
[0040] 5 ' -TTACTTAGTGCAGTT0G0GCACTGTTTGTTGA0GATTTGCTGGMGMTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3，
[0041 ] 反應(yīng)體系：帶同源臂的上下游引物（1 OOpmo 1 Ai 1)各0.化1;模板DNA (1 OOng/山）0.5 y 1; 10 X buf f er 5山；dNTPs (IOmM)各化1; DMS0( 100 % ) 2.5iU ; Pyrobest DNA聚合酶（2.5U/ii I)化I; dd肥0 36/35.化1;總體積50iU。
[0042] 反應(yīng)條件:94°C，2min; (94°C，45sec;50°C，45sec;72°C，90sec;10個循環(huán)）；（94°C， 45sec;55°C，45sec;72°C，90sec;15個循環(huán)）；72°C，5min。
[0043] 線性DNA片段的鑒定如圖I。
[0044] (5)電轉(zhuǎn)線性DNA片段至已誘導(dǎo)表達A重組酶的邸W308(地D46)感受態(tài)，并涂布于帶 安普霉素的LB平板篩選出陽性重組子，并進行了 PCR鑒定，電泳圖如圖2所示。
[0045] (6)陽性重組子制備成感受態(tài)后倒入能誘導(dǎo)表達化P重組酶的質(zhì)粒PCP20,于42°C 熱激表達化P重組酶后即可消除安普霉素抗性。利用一對平板，進行平行點樣，能夠在無抗 性平板上生長，但不能在抗性平板上生長的菌即為已經(jīng)敲除抗性的菌株，命名為邸W308( A fumB)。
[0046] 實施例2:本實施例考察了突變Escherichia coli 1(12的^天冬氨酸酶基因 (aspC)后對該酶活性的影響。具體操作過程為：W原始的aspC為基礎(chǔ)，將236和249位氨基酸 進行突變化ys236Asn，Gly249Thr)，通過人工合成的方式合成該基因，命名為aspC2。將突變 的基因連接到pTrc99a表達質(zhì)粒并導(dǎo)入邸W308( A fumB)，構(gòu)建獲得邸W308( A fumB，aspC2)， W為突變的重組菌BEW308( A fumB，aspC)作對比，結(jié)果如表1:
[0047] 表1天冬氨酸酶突變前后的酶學(xué)性質(zhì)變化情況 [004引 L0049」實施例3:
[0050] 本實施例說明利用同源重組技術(shù)進一步敲除大腸桿菌BEW308( A化mB)中富馬酸 酶fumAC基因，并引入突變的高活性心天冬氨酸酶和k天冬酷胺酶基因。
[0051] 整個實驗操作過程與實施例1 一致，僅同源序列不同。
[0052] (1)本實施例WEscherichia COli 1(12的1^-天冬氨酸酶基因（aspC)為出發(fā)序列， 同時236和249位氨基酸進行突變獲得aspC2,即Lys236Asn，Gly24OThr，同時在啟始密碼子 ATP上游增加了一段信號膚序列：atgttgaatccgaaggttgcc1:acatggtctggatgacgtgcctgggtt taacgttgcccagccaggca(SEQ ID ^:3所示），下游刪除了終止密碼子；所述編碼心天冬酷胺 酶基因（asnA)，其起始密碼子與心天冬氨酸酶基因末端基因之間有一段30bp的連接序列W 確保兩個酶同時具有高活性，該30bp序列為CAATCTGGACCGTGGCATCCTGGAAGCATT(SEQ ID NO: 4所示）。
[0053]最終在兩端增加 fumAC的同源臂和安普霉素抗性基因序列，整段基因采用人工合 成的方式合成，具體核巧酸序列見SEQ ID N0:5所示。
[0化4] (2)電轉(zhuǎn)人工合成的線性DNA片段至已誘導(dǎo)表達A重組酶的邸W308( A fumB,PKD46) 感受態(tài)，并涂布于帶安普霉素的LB平板篩選出陽性重組子，并進行了 PCR鑒定，陽性重組子 制備成感受態(tài)后倒入能誘導(dǎo)表達化P重組酶的質(zhì)粒PCP20,于42°C熱激表達化P重組酶后即 可消除安普霉素抗性。利用一對平板，進行平行點樣，能夠在無抗性平板上生長，但不能在 抗性平板上生長的菌即為已經(jīng)敲除抗性的菌株，命名為邸W308( AfumB-A^mAC-aspCS- SO-asnA)
[0化5] 實施例4:
[0056] 本實施例對比考察了出發(fā)菌株Escherichia COli邸W308和重組菌Escherichia CO 1 i BEW308 ( A化mB- A化mAC-aspC2-30-asnA)在發(fā)酵培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)化后的富馬酸 酶、天冬氨酸酶、心天冬酷胺酶活性的對比數(shù)據(jù)。
[0057] W及邸W308( A化mB- A fumAC-aspC2-30-asnA)兩步法合成k天冬酷胺的過程數(shù) 據(jù)。
[005引具體步驟和結(jié)果如下：
[0059] (1)采用LB培養(yǎng)基，按1~2% (v/v)接種量從凍存管接入S角瓶中，有氧培養(yǎng)10~ 12h，進一步按1~2% (v/v)接種量接種至搖瓶或者種子發(fā)酵罐(培養(yǎng)基也為LB)，種子培養(yǎng) 過程溫度控制在30°C，培養(yǎng)中不需調(diào)節(jié)抑，溶氧控制在5~40%，培養(yǎng)4~化后待菌體ODsoo至 2.5~4之間，按5~10%接種發(fā)酵培養(yǎng)基的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，發(fā)酵過程溫度控制在3(TC，培養(yǎng)過 程抑用氨水控制在7.2~7.8，溶氧控制在5~40 %，培養(yǎng)化。
[0060] 表2 Escherichia COli BEW308( AfumB-A fumAC-aspC2-30-asnA)與出發(fā)菌株酶 活比較
[0061]
[0062] (2)誘導(dǎo)之后添加30g/L葡萄糖和150g/L延胡索酸(用氨水調(diào)節(jié)至中性后分S次補 加），提高溫度至37°C進入轉(zhuǎn)化階段，收集轉(zhuǎn)化12h，16h，20h和24h的菌液產(chǎn)物分析。實驗結(jié) 果見表2。
[0063] 表3 Escherichia coli BEW308( A fumB-A fumAC-aspC2-3〇-asnA)發(fā)酵液過程
[0064]
【主權(quán)項】
1. 一株高效轉(zhuǎn)化延胡索酸為天冬酰胺的重組大腸桿菌，其特征在于，將耐銨型大腸桿 菌BEW308中編碼富馬酸酶的fumA、fumB、fumC基因失活，再將編碼L-天冬氨酸酶的基因和編 碼L-天冬酰氨酶的基因插入到編碼富馬酸酶的fumAC基因位置，即得高效轉(zhuǎn)化延胡索酸為-天冬酰胺的重組大腸桿菌。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效轉(zhuǎn)化延胡索酸為天冬酰胺的重組大腸桿菌，其特征在于， 編碼L-天冬氨酸酶的基因序列如SEQ ID NO: 1所示，編碼L-天冬酰胺酶的基因序列如SEQ ID NO:2所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效轉(zhuǎn)化延胡索酸為天冬酰胺的重組大腸桿菌，其特征在于， 編碼L-天冬氨酸酶的基因的起始密碼子上游有一段信號肽，該信號肽的基因序列如SEQ ID NO: 3所示，將L-天冬氨酸酶基因的終止密碼子刪除，在L-天冬氨酸酶基因的末端與L-天冬 酰氨酶基因之間有一段插入連接序列，該連接序列如SEQ ID N0:4所示。4. 權(quán)利要求1所述的高效轉(zhuǎn)化延胡索酸為天冬酰胺的重組大腸桿菌的制備方法，其特 征在于，包括如下步驟： (1) 將PKD46質(zhì)粒轉(zhuǎn)入耐銨型大腸桿菌BEW308中，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子大腸桿菌BEW308-PKD46,利用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)其表達λ重組酶，再將大腸桿菌BEW308-pKD46制備成感受態(tài)細(xì) 胞； (2) 以pIJ773質(zhì)粒為模板，SEQ ID Ν0:5和SEQ ID Ν0:6所示的序列為引物，PCR擴增得 到fumB基因敲除片段； (3) 將步驟(2)得到的fumB基因敲除片段電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BEW308-pKD46制備成感受 態(tài)細(xì)胞中，在安普抗性平板上篩選陽性重組子； (4) 將步驟(3)得到的陽性重組子制備成感受態(tài)細(xì)胞，將pCP20質(zhì)粒轉(zhuǎn)化其中，42°C誘導(dǎo) FLP重組酶表達，在安普霉素抗性平板和無抗性的平板上進行雙挑實驗，在物抗性的平板上 生長，但不能在有安普霉素抗性的平板上生長的菌株為fumB基因失活的菌株BEW308-A fumB； (5) 合成同源重組片段:在SEQ ID NO: 1起始密碼子ATG前增加信號肽序列SEQ ID NO: 3,刪除L-天冬氨酸酶基因的終止密碼子，并在L-天冬氨酸酶基因后添加連接序列SEQ ID N0:4,該片段還包括安普霉素抗性基因序列，并在該片段的兩端添加了fumAC的同源臂，具 體序列如SEQ ID NO:7所示； (6) 將步驟(4)得到的f umB基因失活的菌株BEW308-Af umB制備成感受態(tài)細(xì)胞，將pKD46 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化其中，利用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)其表達λ重組酶，再將其制備成感受態(tài)細(xì)胞； (7) 將步驟(5)中的同源重組片段轉(zhuǎn)化至步驟(6)的含有λ重組酶的感受態(tài)細(xì)胞中，在安 普抗性平板上篩選陽性重組子； (8) 將步驟(7)中的陽性重組子制備成感受態(tài)細(xì)胞，將pCP20質(zhì)粒轉(zhuǎn)化其中，42°C誘導(dǎo) FLP重組酶表達，在安普霉素抗性平板和無抗性的平板上進行雙挑實驗，在無抗性的平板上 生長，但不能在有安普霉素抗性的平板上生長的菌株即為能夠高效轉(zhuǎn)化延胡索酸為天冬酰 胺的重組大腸桿菌 BEW308AfumB-AfumAC-aspC2-30-asnA。5. 權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化延胡索酸為天冬酰胺的重組大腸桿菌在制備L-天冬酰胺中的 應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，其發(fā)酵過程分為誘導(dǎo)階段和轉(zhuǎn)化階段。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，誘導(dǎo)階段培養(yǎng)基配方為:延胡索酸20g/L， 酵母粉24g/L，蛋白胨10g/L，K 2HP〇4 36mmol/L，MgS〇4 10mmol/L，微量元素[CaCl2.6H20 0.74g/L,ZnS04.7H20 0.18g/L,MnSO4.H2O 20g/L,Na2-EDTA 20.lg/L,CuSO4 O.lg/L,CoCl2 0 · 104g/L，F(xiàn)eS〇4· 7H20 2g/L]2mL/L，溶劑為水，pH為7 · 2~7 · 5。 轉(zhuǎn)化階段補料發(fā)酵:誘導(dǎo)階段結(jié)束后分次補加總計葡萄糖40~60g/L，延胡索酸150~ 200g/L〇8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，誘導(dǎo)階段溫度為28~30°C，pH為7.2~7.8， 溶氧為5~40 % ;轉(zhuǎn)化階段溫度為30~37 °C，pH為7.2~7.8，溶氧為5~40 %。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，葡萄糖補加方式為將葡萄糖配置成600g/L 的儲液，并根據(jù)發(fā)酵液體積分兩次補加，總計40~60g/L;延胡索酸的補加方式為配成400g/ L的延胡索酸混懸液，并用氨水調(diào)節(jié)pH至中性，分5次補加總計約150~200g/L的延胡索酸。
【文檔編號】C12N1/21GK105925520SQ201610430229
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月16日
【發(fā)明人】馬江鋒, 姜岷, 董維亮, 章文明, 陳可泉, 吳昊
【申請人】南京工業(yè)大學(xué)