一種赤眼鰭條細(xì)胞系及其建立方法與應(yīng)用
【專利摘要】一種赤眼鱒魚鰭條細(xì)胞系及其建立方法與應(yīng)用，該赤眼鱒魚鰭條細(xì)胞系的保藏號為CCTCC NO：C201642，是赤眼鱒的尾鰭經(jīng)過原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)所得，所用的培養(yǎng)基為Leibovitz’sl?15培養(yǎng)所制得。所述赤眼鱒魚鰭條細(xì)胞系的生物學(xué)特性包括：細(xì)胞為成纖維樣細(xì)胞，細(xì)胞在含有20％體積分?jǐn)?shù)的胎牛血清的Leibovitz’sl?15培養(yǎng)基在25℃恒溫培養(yǎng)箱中呈最適狀態(tài)。在此生長條件下復(fù)蘇后的細(xì)胞經(jīng)胎盼藍(lán)染色，細(xì)胞的成活率達(dá)82.5％，細(xì)胞呈成纖維樣，生長旺盛，其特征染色體數(shù)目為48條。另外，將質(zhì)粒pEGFP?N1轉(zhuǎn)入該細(xì)胞系中表達(dá)顯示熒光。本發(fā)明的細(xì)胞系能應(yīng)用于支持草魚出血病病毒的生長與復(fù)制中，不僅可以用于外源基因的表達(dá)，還可以運(yùn)用于毒理學(xué)。CCTCC NO：C20164220160316
【專利說明】
一種赤眼鰭條細(xì)胞系及其建立方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及動物細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種赤眼鱒鰭條細(xì)胞系，同時涉及該細(xì)胞系的建立方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]草魚屬鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬，是中國主要淡水養(yǎng)殖對象。然而草魚在養(yǎng)殖過程中，草魚出血病一直非常突出，已嚴(yán)重影響了草魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量。赤眼鱒(Squal1barbus curricuhs)在分類學(xué)上屬于鯉形目鯉科雅羅魚亞科赤眼鱒屬，俗稱紅眼魚，是優(yōu)質(zhì)的經(jīng)濟(jì)魚，其分布廣泛，幾乎遍布全中國各大水系。赤眼鱒因其病害少、肉質(zhì)鮮美、適應(yīng)性強(qiáng)，常用以研究。通常研究是以赤眼鱒為母本，草魚為父本進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交試驗，對抗病機(jī)理進(jìn)行分析。該赤眼鱒細(xì)胞系的建立可以為研究遺傳學(xué)提供材料，還可以運(yùn)用毒理學(xué)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的主要目的是，基于上述問題，提供一種赤眼鱒鰭條細(xì)胞系SCF及其建立方法與應(yīng)用。
[0004]上述赤眼鱒魚鰭條細(xì)胞系SCF，保藏號為CCTCC NO:C201642，于2016年3月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。
[0005]本發(fā)明還提供上述赤眼鱒鰭條細(xì)胞系SCF的建立方法，該方法包括以下步驟:
(I)制備細(xì)胞培養(yǎng)液:以Leibovitz’sl-15培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于其中加入表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子及胎牛血清配置成細(xì)胞培養(yǎng)液;該細(xì)胞培養(yǎng)液中，胎牛血清占該細(xì)胞培養(yǎng)液總體積的25%，表皮生長因子的終濃度為1ng/ml，成纖維細(xì)胞生長因子的終濃度為 10ng/ml ；
(2 )原代培養(yǎng):取健康的赤眼鱒，于20mg/ml的高錳酸鉀液中浸泡30min，然后用75%質(zhì)量濃度的酒精噴灑魚體后擦干，在超凈工作臺內(nèi)，剪取魚體的尾鰭組織，轉(zhuǎn)移至含有0.25%胰蛋白酶的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)15min，用滅菌剪刀將尾鰭組織塊剪成大小為1.5_3的小塊，剪成的組織小塊先用含有500IU/ml的青霉素、500ug/ml的鏈霉素及12.5ug/ml的兩性霉素B的磷酸緩沖液洗3次，再用含有500IU/ml的青霉素、500ug/ml的鏈霉素及12.5ug/ml兩性霉素B的Leibovitz’sl-15培養(yǎng)液洗I次;將漂洗過的組織小塊均勻接種在沒有加任何培養(yǎng)基的25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于25°C培養(yǎng)箱倒置干貼5h;再于該細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入原代培養(yǎng)所需的前述制備的細(xì)胞培養(yǎng)液lml，前20d每天更換該細(xì)胞培養(yǎng)液；
(3)傳代培養(yǎng):待原代細(xì)胞單層鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶時，取出組織小塊，將組織小塊用磷酸緩沖液清洗一次，再用Iml0.25%胰蛋白酶對細(xì)胞靜止消化，待細(xì)胞開始收縮變圓成單個細(xì)胞時，加入2ml新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液中和終止消化，吸出加入的胰蛋白酶溶液和細(xì)胞培養(yǎng)液，再加入5ml新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液，于25 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞再次形成單層時，進(jìn)行下一次傳代。
[0006]按照步驟(3)的過程傳代，10代后所用培養(yǎng)基為含有20%血清的Leibovitz’sl-15培養(yǎng)基。該赤眼鱒鰭條細(xì)胞于20%血清的Leibovitz’sl-15培養(yǎng)基中25 °C下呈現(xiàn)最適生長。
[0007]上述赤眼鱒鰭條細(xì)胞系可以運(yùn)用于外源基因的表達(dá)，質(zhì)粒pEGFP-Nl在該細(xì)胞系中表達(dá)顯不灰光。
[0008]本發(fā)明同時提供所述赤眼鱒鰭條細(xì)胞系SCF在支持草魚出血病病毒(GCRV)的生長和復(fù)制中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):在組織塊制備時，用0.25%的胰蛋白酶除去多余的組織，有利于較快的獲得成纖維細(xì)胞，減小雜質(zhì)細(xì)胞對所要獲得細(xì)胞的影響；用含有抗生素的磷酸緩沖液漂洗三次后，用含有抗生素的Leibovitz’sl-15漂洗一次，使組織塊獲得一定營養(yǎng)，延長倒置干貼的時間，使其貼壁率上升。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于可以較快獲得大量成纖維細(xì)胞;本赤眼鱒鰭條細(xì)胞系不僅能運(yùn)用于外源基因的表達(dá)，還能用于病毒學(xué)、毒理學(xué)、遺傳學(xué)等。
【附圖說明】
[0010]圖1是顯微鏡下本發(fā)明赤眼鱒鰭條細(xì)胞的原代培養(yǎng)圖。
[0011]圖2是顯微鏡下本發(fā)明赤眼鱒鰭條細(xì)胞的傳代培養(yǎng)圖。
[0012]圖3是赤眼鱒鰭條細(xì)胞在不同血清濃度下的生長曲線圖。
[0013]圖4是赤眼鱒鰭條細(xì)胞在不同培養(yǎng)基類型的生長曲線圖。
[0014]圖5是質(zhì)粒pEGFP-Nl在赤眼鱒鰭條細(xì)胞中表達(dá)顯示的熒光圖。
[0015]圖6是接種草魚出血病病毒后，赤眼鱒鰭條細(xì)胞系的形態(tài)圖。
[0016]圖7是赤眼鱒鰭條細(xì)胞染色體圖，右圖顯示48條染色體。
【具體實施方式】
[0017]下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的具體的實施方式作詳細(xì)的說明。
[0018]實施例1本發(fā)明赤眼鱒鰭條細(xì)胞系的建立
(I)制備細(xì)胞培養(yǎng)液
以Leibovitz’sl-15培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，于其中加入表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子及胎牛血清，配置成細(xì)胞培養(yǎng)液。該培養(yǎng)液中，胎牛血清占該細(xì)胞培養(yǎng)液總體積的25%，表皮生長因子的終濃度為10ng/ml，成纖維細(xì)胞生長因子的終濃度為10ng/ml，配制成的細(xì)胞培養(yǎng)液于4°C保存。
[0019](2)原代培養(yǎng)
取健康的赤眼鱒，于20mg/ml的高錳酸鉀液中浸泡30min，然后用70%質(zhì)量濃度的酒精噴灑魚體后擦干，在超凈工作臺內(nèi)，剪取魚體的尾鰭組織，轉(zhuǎn)移至含有0.25%胰蛋白酶的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)15min，用滅菌剪刀鑷子刮去多余的組織，并用剪刀將組織塊剪成大小為1.5mm3的小塊，剪成的組織小塊先用含有500IU/ml的青霉素、500ug/ml的鏈霉素及12.5ug/ml的兩性霉素B的磷酸緩沖液洗3次，再用含有500IU/ml的青霉素、500ug/ml的鏈霉素及12.5ug/ml兩性霉素B的Leibovitz’sl-15培養(yǎng)液洗I次。將漂洗過的組織小塊均勻接種在25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(該培養(yǎng)瓶未加任何培養(yǎng)液)中，于25°C培養(yǎng)箱倒置干貼5hο于該細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入原代培養(yǎng)所需的前面步驟(I)制得的細(xì)胞培養(yǎng)液lml，前20d每天更換該細(xì)胞培養(yǎng)液觀察(結(jié)合參見圖1)。
[0020](3)傳代培養(yǎng)
待原代細(xì)胞單層鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶時，移出細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞培養(yǎng)液，取出組織小塊用磷酸緩沖液清洗一次，再用Iml的0.25%胰蛋白酶對細(xì)胞靜止消化，待細(xì)胞開始收縮變圓成單個細(xì)胞時，用2ml前述制備的新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液中和終止消化，吸出液體(液體是指細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入的胰蛋白酶溶液和細(xì)胞培養(yǎng)液)，再加入5ml前述制備的新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液，于25 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(結(jié)合參見圖2 )。待細(xì)胞再次形成單層時，進(jìn)行下一次傳代。
[0021]實施例2細(xì)胞的保存與復(fù)蘇 A液和B液的配置:
A液:按體積比由40%胎牛血清、20%二甲基亞砜及40% Leibovitz’s 1-15培養(yǎng)基配制而成。取lml A液放入凍存管中，并在凍存管上標(biāo)記凍存日期、細(xì)胞名稱、培養(yǎng)基類型、血清濃度。
[0022]B液:常規(guī)的Leibovitz’ sl-15培養(yǎng)液(不含有胎牛血清)。
[0023]細(xì)胞的保存:取生長旺盛的赤眼鱒鰭條細(xì)胞，用磷酸緩沖液洗一次后，用Iml
0.25%胰蛋白酶消化，待細(xì)胞收縮快成單個時，吸出胰蛋白酶。用2ml專用培養(yǎng)基(該專用培養(yǎng)基中胎牛血清占該培養(yǎng)基總體積的20%)中和，再吸出專用培養(yǎng)基。用Iml B液吹懸細(xì)胞加入上述含有A液的凍存管底部。將凍存管放入東村盒中，置于_80°C超低溫冰箱過夜，最后放入液氮中長期保存。
[0024]細(xì)胞的復(fù)蘇:取液氮中保存的細(xì)胞，在37°C水浴鍋中解凍，待細(xì)胞即將融化完全時轉(zhuǎn)入離心管中，加入3 m I專用培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基中胎牛血清占該培養(yǎng)基總體積的2 O % )，1000rpm/min離心5min，棄上清液，用專用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，在25°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，更換專用培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。同時，取少量的解凍細(xì)胞，加入臺盼藍(lán)(Trypan Blue)，用血球計數(shù)法計數(shù)，活的細(xì)胞為白色，死的為藍(lán)色。計算細(xì)胞的存活率。復(fù)蘇細(xì)胞的存活率為82.5%左右，細(xì)胞呈成纖維樣，生長旺盛。
[0025]實施例3細(xì)胞最適生長條件的確定
最適血清濃度的確定:將初始密度為20 X 16個/ml的赤眼鱒鰭條細(xì)胞分別種植在含有體積分?jǐn)?shù)分別為5%、10%、15%、20%的FBS的Le i bo v i t i z ’ s 1-15培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基中還添加有表皮生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子，該培養(yǎng)基中表皮生長因子的終濃度為10ng/ml，成纖維細(xì)胞生長因子的終濃度為10ng/ml，)的25cm2培養(yǎng)瓶中。在第2、4、6、8、10、12天分別用
0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，在血球計數(shù)板計數(shù)并繪制生長曲線。結(jié)果參見圖3，細(xì)胞生長速度隨著FBS濃度的增加而加快，在該含有FBS的Leibovitiz’sl-15培養(yǎng)基中，F(xiàn)BS的體積分?jǐn)?shù)為20%時細(xì)胞生長速度最快。表明:本發(fā)明所建立的赤眼鱒鰭條細(xì)胞在含20%體積分?jǐn)?shù)的胎牛血清的Leibovitz’sl-15培養(yǎng)基中最適生長。
[0026]最適培養(yǎng)基類型的確定:將初始密度為20X16個/ml的赤眼鱒鰭條細(xì)胞分別種植在含20%體積分?jǐn)?shù)的FBS的Leibovitiz’sl-15(簡稱L-15)培養(yǎng)基、M199培養(yǎng)基、R-1640培養(yǎng)基和MEM培養(yǎng)基的25 cm2培養(yǎng)瓶中。在第2、4、6、8、1、12天分別用0.25%胰蛋白酶消化，在血球計數(shù)板計數(shù)并繪制生長曲線。結(jié)果見圖4，細(xì)胞在含20%體積分?jǐn)?shù)的FBS的L-15培養(yǎng)基中明顯高于其他培養(yǎng)基;在含20%體積分?jǐn)?shù)的FBS的MEM培養(yǎng)基中生長緩慢，直至死亡。
[0027]實施例4細(xì)胞的轉(zhuǎn)染將質(zhì)粒pEGFP-Nl轉(zhuǎn)入赤眼鱒鰭條細(xì)胞中的步驟如下:將赤眼鱒鰭條細(xì)胞接種到6孔板中，第二天，待細(xì)胞密度達(dá)到80%以上時，進(jìn)行細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實驗。將1ul pEGFP-Nl加入到含有240ul常規(guī)Leibovitz’sl-15培養(yǎng)液的管中，將5ul Lipofectamine2000加入到含有245ul常規(guī)Leibovitz’sl-15培養(yǎng)液的另一管中。5min后，將上述兩管溶液混合，室溫放置20min，再于25 °C培養(yǎng)5h，然后將混合溶液中的培養(yǎng)液替換為專用培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基中含有20%體積分?jǐn)?shù)的胎牛血清)，24h后，在顯微鏡下觀察顯示熒光，結(jié)果參見圖5，質(zhì)粒pEGFP-Nl轉(zhuǎn)入赤眼鱒鰭條細(xì)胞，顯示熒光。說明赤眼鱒鰭條細(xì)胞系能用于外源基因的表達(dá)。
[0028]實施例5病毒的敏感性
病毒按照梯度稀釋，取10個EP管依次標(biāo)上編號，在第一個EP管中加入Iml的草魚出血病病毒，后面9個EP管都加900ul不含有胎牛血清的培養(yǎng)基(這個培養(yǎng)基指不加任何物質(zhì)的常規(guī)L-15培養(yǎng)基)，第二個EP管從第一個EP管中吸取10ul的病毒，后面的EP管依次從前一個EP管中吸取 I OOul 的病毒液，使得病毒按照 10°，10—1，10—2，10—3，10—4，10—5，10—6，10—7，10—8，10一9的梯度稀釋。取96孔板作上標(biāo)記，以2組只含常規(guī)L-15培養(yǎng)基的為對照組，后10組依次從濃度低的加入到96孔板中，每一排加入10ul的病毒液。從用專用培養(yǎng)基培養(yǎng)赤眼鱒鰭條細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中吸出專用培養(yǎng)基，將吸出的專用培養(yǎng)基放入離心管中以3000r/ min離心5min，而該培養(yǎng)瓶中加入Iml 0.25%胰蛋白酶消化成單個細(xì)胞，輕拍使得細(xì)胞從培養(yǎng)瓶脫落，再于該培養(yǎng)瓶中加入2ml前述離心后的上清液中和，吸出上清液，將上清液放入離心管中以I OOOr/min離心5min，棄掉離心后的上清液，再用含有2%體積分?jǐn)?shù)的胎牛血清的Leibovitz’sl-15培養(yǎng)基吹懸細(xì)胞，再將吹懸的細(xì)胞加在上述作有標(biāo)記的96孔板中，每孔滴加I滴的細(xì)胞懸液，用封口膜封口，放入25 0C培養(yǎng)觀察。細(xì)胞出現(xiàn)病變效應(yīng)，測得TCID5Q=10—8.52/0.1ml。表明:本赤眼鱒鰭條細(xì)胞系對草魚出血病病毒有易感性。
[0029]實施例6染色體分析
赤眼鱒鰭條細(xì)胞傳代培養(yǎng)24h后，向培養(yǎng)瓶加入終濃度為lug/ml的秋水仙素，置于25°C恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)14h，然后用Iml 0.25%胰蛋白酶消化，再用2ml專用培養(yǎng)基中和終止消化，將消化為單個的細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管，以1500rpm/min離心5min，收集細(xì)胞。用冰的雙蒸水低滲，然后用固定液(固定液按體積比甲醇:冰乙酸為3:1配置)固定20min，重復(fù)3次后滴片，自然干燥后用Giemsa染液染色。
[0030]顯微鏡下觀察拍照，染色體數(shù)目計數(shù)，根據(jù)染色體的著絲點(diǎn)位置、臂長等特征對染色體進(jìn)行分組、配對，顯示染色體數(shù)目為48條，見圖7。
[0031 ] 本文中的0.25%膜蛋白酶購置于So Iarb1公司。
[0032]本文中提及的專用培養(yǎng)基是以Leibovitz’sl-15培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于其中加入表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子及胎牛血清配置成，其中，胎牛血清占該培養(yǎng)基總體積的20%，表皮生長因子的終濃度為10ng/ml，成纖維細(xì)胞生長因子的終濃度為10ng/ml。
【主權(quán)項】
1.一種赤眼鱒鰭條細(xì)胞系SCF，保藏號為CCTCC NO: C201642。2.如權(quán)利要求1所述的赤眼鱒鰭條細(xì)胞系SCF在支持草魚出血病病毒的生長與復(fù)制中的應(yīng)用。3.權(quán)利要求1所述赤眼鱒鰭條細(xì)胞系SCF的建立方法，其特征在于，該方法步驟如下: (I)制備細(xì)胞培養(yǎng)液:以Leibovitz’sl-15培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于其中加入表皮生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子及胎牛血清配置成細(xì)胞培養(yǎng)液;該培養(yǎng)液中，胎牛血清占該細(xì)胞培養(yǎng)液總體積的25%，表皮生長因子的終濃度為10ng/ml，成纖維細(xì)胞生長因子的終濃度為10ng/ml； (2 )原代培養(yǎng):取健康的赤眼鱒，于20mg/ml的高錳酸鉀液中浸泡30mi η，然后用7 5%質(zhì)量濃度的酒精噴灑魚體后擦干，在超凈工作臺內(nèi)，剪取魚體的尾鰭組織，轉(zhuǎn)移至含有0.25%胰蛋白酶的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)15min，用滅菌剪刀將尾鰭組織塊剪成大小為1.5_3的小塊，剪成的組織小塊先用含有500IU/ml的青霉素、500ug/ml的鏈霉素及12.5ug/ml的兩性霉素B的磷酸緩沖液洗3次，再用含有500IU/ml的青霉素、500ug/ml的鏈霉素及12.5ug/ml兩性霉素B的Leibovitz’sl-15培養(yǎng)液洗I次;將漂洗過的組織小塊均勻接種在沒有加任何培養(yǎng)液的25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于25°C培養(yǎng)箱倒置干貼5h;再于該細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入原代培養(yǎng)所需的前述制備的細(xì)胞培養(yǎng)液lml，前20d每天更換該細(xì)胞培養(yǎng)液； (3)傳代培養(yǎng):待原代細(xì)胞單層鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶時，取出組織小塊，將組織小塊用磷酸緩沖液清洗一次，再用Iml0.25%胰蛋白酶對細(xì)胞靜止消化，待細(xì)胞開始收縮變圓成單個細(xì)胞時，加入2ml新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液中和終止消化，吸出加入的胰蛋白酶溶液和細(xì)胞培養(yǎng)液，再加入5ml新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打制成細(xì)胞懸液，于25 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞再次形成單層時，進(jìn)行下一次傳代。
【文檔編號】C12N5/071GK105925523SQ201610277718
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】肖調(diào)義, 鄧亞林, 喬慶, 李偉, 趙鑫, 周智愚, 何美鳳, 金生振
【申請人】湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)