一種粉蚧科昆蟲基因條形碼檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種粉蚧科昆蟲基因條形碼檢測(cè)技術(shù)，可以快速檢測(cè)21種粉蚧，至少包括20次用量以上的引物PseJ /PseN試劑和基因條形碼序列盤；引物PseJ序列：5'? CCTTCAACTAATCATAAAAATATNAG ?3'，引物PseN序列：5'? TAAACTTCT GGATGTCCAAAAAATCA?3'；所述基因條形碼序列盤存有93條標(biāo)準(zhǔn)條碼序列，詳細(xì)序列為SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.93所示。本發(fā)明的粉蚧科昆蟲基因條形碼檢測(cè)技術(shù)，是一種高效、準(zhǔn)確、便捷的粉蚧科昆蟲分子檢測(cè)技術(shù)，可在分子水平將粉蚧科21種昆蟲種類區(qū)分，能滿足使用需求。
【專利說(shuō)明】
-種粉蟻科昆蟲基因條形碼檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種PCR檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，尤其設(shè)及一種粉階科昆蟲基因條 形碼檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于植物檢疫技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 粉階是一類分布廣、寄主多的植食性昆蟲，除少部分為資源昆蟲外，多為農(nóng)林業(yè)中 發(fā)生普遍且危害嚴(yán)重的害蟲(Ben-Dov，2002)。該類群的成蟲和若蟲主要在寄主植物的幼嫩 部位取食危害，導(dǎo)致生長(zhǎng)勢(shì)衰弱；亦可傳播病原微生物導(dǎo)致植物病害大面積的發(fā)生；另外蟲 體排出的蜜露常誘致煤煙病的產(chǎn)生，影響光合作用，對(duì)農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)、城市景觀等的生態(tài)影響 巨大。
[0003] 長(zhǎng)期W來(lái)，基于形態(tài)特征的粉階科分類研究的操作性和準(zhǔn)確性一直受到質(zhì)疑。粉 階體形較小或微小，有些種類鮮見(jiàn)雄蟲，可供比較的形態(tài)學(xué)特征有限;粉階的個(gè)體大小、巧U 毛長(zhǎng)短、透明孔的有無(wú)等重要的形態(tài)分類特征不穩(wěn)定，極易受外部環(huán)境的影響而發(fā)生變化 (齊曉豐，2002);同時(shí)傳統(tǒng)階蟲形態(tài)分類對(duì)專業(yè)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)要求較高，只有分類專家或者經(jīng) 過(guò)?？谂嘤?xùn)的人員才能有效開(kāi)展此項(xiàng)工作;此外，傳統(tǒng)的昆蟲形態(tài)鑒定方法必須W完整成 蟲作為形態(tài)學(xué)研究對(duì)象，若蟲、卵與殘缺的蟲體等情況均難于通過(guò)形態(tài)特征進(jìn)行快速有效 地鑒定化ondo，2008;化SUgi，2011)。
[0004] 近年來(lái)，昆蟲分子生物學(xué)迅速發(fā)展起來(lái)，在分子鑒定和系統(tǒng)演化兩個(gè)方面的應(yīng)用 較為廣泛，通過(guò)研究昆蟲核酸分子結(jié)構(gòu)探求各類群之間的親緣關(guān)系和進(jìn)化關(guān)系(Frgzal， 2008,鄭斯竹，2015)。利用分子生物學(xué)技術(shù)，可W有效地掲示自然種群中遺傳結(jié)構(gòu)、基因流 動(dòng)和選擇作用等問(wèn)題，為粉階的分類鑒定提供新的技術(shù)和方法(魏亦寒，2105)。尤其是DNA 條形碼技術(shù)的出現(xiàn)，越來(lái)越多的研發(fā)人員加入了DNA條形碼技術(shù)研究行列，使該領(lǐng)域成為生 物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一 (Hebert, 2006)。何衍彪等(2007)對(duì)大洋臀紋粉階、相橘臀紋粉階、無(wú) 花果臀紋粉階/icus等3種近緣種粉階的mtDNA COI序列W及18S和 28S基因序列進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)階蟲COI基因序列變異程度高于其他基因；Park等(2011)通過(guò) 重新設(shè)計(jì)COI基因序列的正向引物，對(duì)盾階科和粉階科進(jìn)行了物種鑒定的有效性研究，掲示 了介殼蟲DNA條形碼序列核巧酸組成的特性(Deng et aJ.，2012); Saccaggi等（2008) 通過(guò)mtDNA COI基因序列特征分析成功將葡萄綿粉階jP/anococcus巧CUS、相橘臀紋粉階和 長(zhǎng)尾粉階iongisjoint/s區(qū)別開(kāi)來(lái)。但運(yùn)些數(shù)據(jù)仍遠(yuǎn)達(dá)不到廣泛解決粉階科種 類準(zhǔn)確鑒定的問(wèn)題。
[0005] DNA條形碼技術(shù)是利用一段或幾段標(biāo)準(zhǔn)的、易擴(kuò)增的、種間差異顯著大于種內(nèi)差異 的DNA片段來(lái)鑒別物種的新技術(shù)，該概念最早由加拿大學(xué)者化bed提出。與傳統(tǒng)的分類鑒定 技術(shù)相比，DNA條形碼技術(shù)具有許多無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)：（1)操作簡(jiǎn)單，對(duì)物種分類鑒定知識(shí)缺 乏的人也可W通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)流程對(duì)物種進(jìn)行鑒定；（2)不受個(gè)體發(fā)育階段和形態(tài)特征的限 審IJ，只要個(gè)體存在完整的目標(biāo)DNA片段即可滿足鑒定需求；（3)該技術(shù)可W作為傳統(tǒng)分類學(xué) 的輔助手段，幫助傳統(tǒng)分類學(xué)家修正W往的分類結(jié)論，解決形態(tài)分類無(wú)法解決的難題。正是 由于DM條形碼技術(shù)具有W上及其它很多優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越多的研發(fā)人員加入了 DNA條形碼技術(shù) 研究行列，使該領(lǐng)域成為生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一(Hebert,2006)。但是關(guān)于粉階的基因條碼 快速檢測(cè)技術(shù)研究，國(guó)內(nèi)外相關(guān)的系統(tǒng)報(bào)道仍然不多。因此，建立準(zhǔn)確可靠的粉階條形碼檢 測(cè)技術(shù)，不僅對(duì)我國(guó)檢疫部口具有重要的意義，更是對(duì)我國(guó)基因資源的補(bǔ)充，特別是粉階害 蟲資源的補(bǔ)充，為我國(guó)在爭(zhēng)奪有限的資源方面能做出一定的貢獻(xiàn)，同時(shí)也為粉階的分類鑒 定提供新的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于解決上述的技術(shù)問(wèn)題，提供一種一種粉階科昆蟲基因條形碼檢 測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
[0007] 本發(fā)明的目的通過(guò)W下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)： 一種粉階科昆蟲基因條形碼檢測(cè)試劑盒，至少包括一基因條形碼序列盤和20次用量W 上的引物PseJ與引物PseN;所述引物PseJ與引物PseN序列號(hào)為， PseJ:5'- CCTTCAACTAATCATAAAAATATNAG -3'； PseN:5'-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3； 所述基因條形碼序列盤內(nèi)存有93條標(biāo)準(zhǔn)條碼序列，所述標(biāo)準(zhǔn)條碼序列如SEQ ID NO. 1 到沈Q ID NO.93所示。
[000引優(yōu)選地，所述試劑盒還包括20次用量W上的下列試劑：Taq buffer ,MgCb, dNTP miX，Taq DNA聚合酶，d地20, DNA標(biāo)準(zhǔn)樣。
[0009]優(yōu)選地，一種粉階科昆蟲基因條形碼檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，用所述試劑盒進(jìn)行 擴(kuò)增包括W下步驟： 51、 DNA模板的制備:采用GenMagBio動(dòng)物細(xì)胞組織/細(xì)胞基因組DNA磁珠法提取試劑 盒，提取待檢測(cè)樣品； 52、 DNA條形碼序列的擴(kuò)增：WSl中的DNA檢測(cè)樣品為模板，采用引物PseJ與引物PseN 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述引物PseJ與引物PseN序列號(hào)為， PseJ:5'- CCTTCAACTAATCATAAAAATATNAG -3'； PseN: 5 ' -TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3;所述PCR反應(yīng)體系采用標(biāo)準(zhǔn)體系，總體積為 50化或25化； 所述PCR反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性4min;35個(gè)循環(huán):94°C變形1111111，48°(：退火1111111，72°(：延 伸90s;最后72°C延伸4min，4°C保存； 53、 混合8化待測(cè)樣品與化1 eXGlycerol DNA上樣緩沖液上樣，Wdna Marker DLlOO 為分子量標(biāo)記，室溫下恒壓120 V，用3%瓊脂糖凝膠電泳45min，0.5% ymol/L的邸染色，凝膠 成像系統(tǒng)檢測(cè)樣品，拍照分析； 54、 PCR結(jié)果判定： 混合8化PCR產(chǎn)物與2 yL 6 XGlycerol DNA上樣緩沖液上樣，Wdna Marker DLlOO為 分子量標(biāo)記，室溫下恒壓120 V，用3 %瓊脂糖凝膠電泳45分鐘，0.5% ymol/L的邸染色，凝膠 成像系統(tǒng)檢測(cè)樣品，拍照;照片顯示粉階與標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品在70化P位置有清晰的擴(kuò)增條帶，即 為目標(biāo)條帶； 55、 RCR產(chǎn)物測(cè)序獲得基因序列； S6、粉階科昆蟲基因比對(duì) 將待測(cè)粉階測(cè)序得到的序列與基因條形碼序列盤中標(biāo)準(zhǔn)基因條碼序列進(jìn)行比對(duì)，若比 對(duì)相似度100%，則認(rèn)定其為該種類;當(dāng)沒(méi)有與任何標(biāo)準(zhǔn)條碼序列相似度達(dá)100%，則進(jìn)行氨基 酸遺傳距離的比對(duì)判定是否在目標(biāo)范圍內(nèi)。
[0010] 優(yōu)選地，所述PCR反應(yīng)體系為50化，其中含5化IOXTaq buffer含有KCl、2mmol/L MgCl2、200ymol/L dNTP mix、2U hq DNA 聚合酶、化L DNA模板、引物各lymol/l; 所述PCR反應(yīng)體系為25化，其中模板DNA化L，含Mg2+的10 X反應(yīng)緩沖液2.扣UdNTPs 0.2mmol/L化L，5pmol/L上游引物和下游引物各化L，1.0 U hq DNA聚合酶0.化L，無(wú)菌水 補(bǔ)至2如L。
[0011] 優(yōu)選地，所述Sl中的樣品為渡蘿潔粉階、李比利氏灰粉階、灰粉階屬一種斯smi coccus neobreWjOes、萍綿粉階、綿粉階屬一種化6/33(：?〇(：?(：?帖 3^^6/336、綿粉階屬一種/%aoacocct/s joarras、石蒜綿粉階、扶桑綿粉階、枯臀紋粉階、臀紋粉階屬一種PJanococct/s巧ct/s、日本 臀紋粉階、臀紋粉階屬一臀紋粉階屬一韋々Planococcus minor、 臀紋粉階屬一種戶Jaoococcus rarae、粉階屬一種Pset/c/ococcus 薦根粉階、康氏 粉階、粉階屬一種A?et/c/ococct/s Cr乃7tt/s、杰克貝爾氏粉階、擬長(zhǎng)尾粉階、粉階屬一種 Pseudococcus vIburn1。
[0012] 優(yōu)選地，所述S6粉階科昆蟲基因比對(duì)結(jié)果包括如下步驟， 561、 當(dāng)?shù)玫降男蛄信c標(biāo)準(zhǔn)基因條碼序列相似度100%，則認(rèn)定其為該種類； 562、 當(dāng)沒(méi)有與任何標(biāo)準(zhǔn)條碼序列相似度達(dá)100%，則將待測(cè)粉階基因序列按"無(wú)脊椎動(dòng) 物密碼子"翻譯為氨基酸，與標(biāo)準(zhǔn)基因條碼序列所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列使用"P-distance模 型"計(jì)算遺傳距離，若與未知種類粉階基因序列遺傳距離小于1%的標(biāo)準(zhǔn)基因條碼種類，即為 目標(biāo)種類;若遺傳距離都大于1%，判定未知粉階種類不在此21種粉階范圍內(nèi)。
[0013] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：（1)目標(biāo)基因短，降低了實(shí)驗(yàn)對(duì)標(biāo)本質(zhì)量的需求， 擴(kuò)增效率高；（2)種間變異大而種內(nèi)變異小，W區(qū)分不同物種;包含足夠的系統(tǒng)進(jìn)化信息W 定位物種在分類系統(tǒng)中的位置，能滿足使用需求。（3)操作簡(jiǎn)單，對(duì)物種分類鑒定知識(shí)缺乏 的人也可W通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)流程對(duì)粉階科物種進(jìn)行鑒定；（4)不受個(gè)體發(fā)育階段和形態(tài)特征 的限制，只要個(gè)體存在完整的目標(biāo)DNA片段即可滿足鑒定需求。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明： 圖1:扶桑綿粉階、石蒜綿粉階、康氏粉階=種粉階樣品的引物PseJ /Pse府廣增結(jié)果圖。
[0015] 圖2:實(shí)施例中的樣品擴(kuò)增條帶示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 本發(fā)明掲示了一種粉階科昆蟲基因條形碼檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，本方法能高 效、準(zhǔn)確、便捷的粉階科昆蟲分子檢測(cè)技術(shù)，可在分子水平將粉階科21種昆蟲種類區(qū)分，能 滿足使用需求。
[0017] -種粉階科昆蟲基因條形碼檢測(cè)試劑盒，可W快速檢測(cè)21種粉階，所述粉階具體 如表1所示，所述試劑盒至少包括基因條形碼序列盤和20次用量W上的引物PseJ /PseN試 劑： 引物PseJ序列：5 ' - CCTTCAACTAATCATAAAAATATNAG -3 '， 引物PseN序列：5 ' - TAAACTTCT GGATGTCCAAAAAATCA-3 ' ； 所述基因條形碼序列盤存有93條標(biāo)準(zhǔn)條碼序列，詳細(xì)序列為SEQ ID NO.1到SEQ ID NO. 93所示。
[001引親1 :粉階種類與么疏
優(yōu)選地，所述試劑盒還包括20次用量W上的下列試劑:Taq buffer,MgCb，dNTP mix, Taq DNA聚合酶，d地20, DNA標(biāo)準(zhǔn)樣。
[0019] W下詳細(xì)闡述下采用該試劑盒的檢測(cè)和區(qū)分方法： 選取扶桑綿粉階、石蒜綿粉階、康氏粉階、四紋豆象、白腹皮蠢、紅蠟階六份樣品作為待 檢測(cè)樣品。步驟如下： 1)總DNA提取 DNA的提取采用GenMa濁io動(dòng)物細(xì)胞組織/細(xì)胞基因組DNA磁珠提取試劑盒進(jìn)行提取。 具體過(guò)程如下： 直接將1-2頭昆蟲樣品放入2mm試管，無(wú)水乙醇浸泡保存標(biāo)本用無(wú)菌蒸饋水沖洗浸泡4~ 5次，棄水;干標(biāo)本無(wú)菌蒸饋水浸泡化后吸干水分。置于2mL離屯、管，MM400球磨儀中震蕩娠磨 (30次/3)303，加入180化17313 8證'6'、20化？'〇16111日36 1(，震蕩混勻，常溫過(guò)夜，55°(：震 蕩溫浴3-化，12000巧m離屯、IOmin，取上清，加入200化Binding Buf fer和200化無(wú)水乙醇， 充分混勻，加入20化磁珠，輕柔顛倒混勻lOmin。離屯、管置于磁力架，吸棄管內(nèi)液體，保留磁 珠 ，Wash Buffer I SOOuL顛倒混勻2min置于磁力架，棄去管內(nèi)液體，Wash Buffer n同樣 洗涂?jī)纱?，離屯、管仍置于磁力架上，緩慢加入Wash Buffer虹，Imin后移走管內(nèi)液體。加入 20化Elution Buffer,55°C水浴IOmin洗脫磁珠上吸附的DNA，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br>[0020] 2)序列擴(kuò)增與測(cè)定 PCR反應(yīng)體系：總體積為50 化，其中含5 yl IOXTaq buffer with KC1、2 mmol/L MgCbJOO ymol/L dNTP mix、2 U Taq DNA 聚合酶、3 yL DNA模板、引物各I ymol/l; 所述PCR反應(yīng)體系為25化，其中模板DNA化L，含Mg2+的10 X反應(yīng)緩沖液2.扣UdNTPs 0.2mmol/L化L，5pmol/L上游引物和下游引物各化L，1.0 U hq DNA聚合酶0.化L，無(wú)菌水 補(bǔ)至2如L。
[0021] 反應(yīng)條件：95°C 預(yù)變性 4min;35 個(gè)循環(huán)：94°C 變形 1111111，48°(：退火1111111，72°(：延伸 90s;最后72°C延伸4min，4°C保存； 混合8 yL待測(cè)樣品與2 yL 6 X Glycerol DNA loading Buffer上樣，Wdna Marker DLlOO為分子量標(biāo)記，室溫下恒壓120 V，用3%瓊脂糖凝膠電泳45 min，0.5% ymol/L的邸染 色，進(jìn)行凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)樣品，拍照、分析； 電泳圖，如圖2所示，圖中1為扶桑綿粉階;圖中2為石蒜綿粉階;圖中3為康氏粉階;圖中 4為四紋豆象;圖中5為白腹皮蠢；圖中6為紅蠟階。
[0022] 六個(gè)樣品中、=種粉階、紅蠟階擴(kuò)增出7(K)bp大小的條帶，四紋豆象、白腹皮蠢未擴(kuò) 增出條帶，排除的運(yùn)兩種不在粉階科昆蟲之內(nèi)，且符合實(shí)際，排除準(zhǔn)確。
[0023] W上擴(kuò)增出條帶的產(chǎn)物WPCR引物作為測(cè)序引物，進(jìn)行雙向測(cè)序，由蘇州金唯智 生物科技有限公司完成。
[0024] 3)基因比對(duì) 利用現(xiàn)有的比對(duì)軟件和計(jì)算機(jī)技術(shù)，將未知種類粉階測(cè)序得到的序列結(jié)果與基因條形 碼序列盤中標(biāo)準(zhǔn)基因條碼序列進(jìn)行比較，具體結(jié)果按W下方式運(yùn)行： A:當(dāng)序列與標(biāo)準(zhǔn)基因條碼序列相似度100%，則認(rèn)定其為該種類； B:當(dāng)序列沒(méi)有與任何標(biāo)準(zhǔn)條碼序列相似度達(dá)100%，則將未知種類粉階基因序列按"無(wú) 脊椎動(dòng)物密碼子"翻譯為氨基酸，與標(biāo)準(zhǔn)基因條碼的氨基酸序列使用"P-distance模型"計(jì) 算遺傳距離，與未知種類粉階基因序列遺傳距離小于2%的標(biāo)準(zhǔn)基因條碼種類，即為目標(biāo)種 類;如果遺傳距離都大于1%，說(shuō)明未知粉階種類不在此21種粉階范圍內(nèi)。
[00巧]準(zhǔn)確性檢測(cè)： 所得5條序列依次輸入基因條形碼序列盤進(jìn)行計(jì)算比對(duì)，結(jié)果如下： 1)石蒜綿粉階序列與序列盤中谷斑粉階標(biāo)準(zhǔn)條碼基因相似度為100%，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確。
[0026] 2)扶桑綿粉階序列與序列盤中扶桑綿粉階標(biāo)準(zhǔn)條碼基因相似度為98%，與序列盤 中扶桑綿粉階標(biāo)準(zhǔn)條碼基因遺傳距離0.2%，按結(jié)果認(rèn)定規(guī)則認(rèn)定為扶桑綿粉階，鑒定結(jié)果 準(zhǔn)確。
[0027] 3)康氏粉階序列與序列盤中康氏粉階標(biāo)準(zhǔn)條碼基因相似度為98%~100%，與序列盤 中的康氏粉階標(biāo)準(zhǔn)條碼基因遺傳距離在0%~0.88%之間，按結(jié)果認(rèn)定規(guī)則認(rèn)定為康氏粉階， 鑒定結(jié)果準(zhǔn)確。
[0028] 4)紅蠟階與序列盤中粉階標(biāo)準(zhǔn)條碼基因遺傳距離為31.9%~39.7%，遠(yuǎn)大于2%，按結(jié) 果認(rèn)定規(guī)則認(rèn)定非21種粉階。
[0029] 所有結(jié)果與供試的樣本種類相符，結(jié)果符合要求，表明該試劑盒可W準(zhǔn)確鑒定運(yùn)3 種粉階。
[0030] 本發(fā)明尚有多種具體的實(shí)施方式，凡采用等同替換或者等效變換而形成的所有技 術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求保護(hù)的范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種粉蚧科昆蟲基因條形碼檢測(cè)試劑盒，其特征在于：至少包括一基因條形碼序列 盤和20次用量以上的引物PseJ與引物PseN;所述引物PseJ與引物PseN序列號(hào)為， PseJ:5'_ CCTTCAACTAATCATAAAAATATNAG -3'； PseN:5'-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3； 所述基因條形碼序列盤內(nèi)存有93條標(biāo)準(zhǔn)條碼序列，所述標(biāo)準(zhǔn)條碼序列如SEQ ID NO.1 到SEQ ID NO.93所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種粉蚧科昆蟲基因條形碼檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試 劑盒還包括20次用量以上的下列試劑：Taq buffer，MgCl2，dNTP mix，Taq DNA聚合酶， CldH2O，DNA 標(biāo)準(zhǔn)樣。3. -種粉蚧科昆蟲基因條形碼檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于，用所述試劑盒進(jìn) 行擴(kuò)增包括以下步驟： 51、 DNA模板的制備：采用GenMagBio動(dòng)物細(xì)胞組織/細(xì)胞基因組DNA磁珠法提取試劑 盒，提取待檢測(cè)樣品； 52、 DNA條形碼序列的擴(kuò)增：以Sl中的DNA檢測(cè)樣品為模板，采用引物PseJ與引物PseN 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述引物PseJ與引物PseN序列號(hào)為， PseJ:5'_ CCTTCAACTAATCATAAAAATATNAG -3'； PseN: 5 ' -TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3;所述PCR反應(yīng)體系采用標(biāo)準(zhǔn)體系，總體積為 50yL 或 25yL; 所述PCR反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性4min;35個(gè)循環(huán):94°C變形lmin，48°C退火lmin，72°C延 伸90s;最后72°C延伸4min，4°C保存； 53、 混合8yL待測(cè)樣品與2yL 6 XGlycerol DNA上樣緩沖液上樣，以DNA Marker DLlOO 為分子量標(biāo)記，室溫下恒壓120 V，用3%瓊脂糖凝膠電泳45min，0.5% ymol/L的EB染色，凝膠 成像系統(tǒng)檢測(cè)樣品，拍照分析； 54、 PCR結(jié)果判定： 混合8yL PCR產(chǎn)物與2 yL 6 X Glycerol DNA上樣緩沖液上樣，以DNA Marker DLlOO為 分子量標(biāo)記，室溫下恒壓120 V，用3 %瓊脂糖凝膠電泳45分鐘，0.5% μ mol/L的EB染色，凝膠 成像系統(tǒng)檢測(cè)樣品，拍照；照片顯示粉蚧與標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品在700bp位置有清晰的擴(kuò)增條帶，即 為目標(biāo)條帶； 55、 RCR產(chǎn)物測(cè)序獲得基因序列； 56、 粉蚧科昆蟲基因比對(duì) 將待測(cè)粉蚧測(cè)序得到的序列與基因條形碼序列盤中標(biāo)準(zhǔn)基因條碼序列進(jìn)行比對(duì)，若比 對(duì)相似度100%，則認(rèn)定其為該種類;當(dāng)沒(méi)有與任何標(biāo)準(zhǔn)條碼序列相似度達(dá)100%，則進(jìn)行氨基 酸遺傳距離的比對(duì)判定是否在目標(biāo)范圍內(nèi)。4. 如權(quán)利要求3所述的一種粉蚧科昆蟲基因條形碼檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在 于，所述PCR反應(yīng)體系為50yL，其中含5yL IOXTaq buffer 含有KCl、2mmol/L MgCl2、200μ mol/L dNTP mix、2U Taq DNA 聚合酶、3yL DNA模板、引物各Ιμπιο?/L; 所述？〇?反應(yīng)體系為25以1^，其中模板0嫩2以1^，含1%2+的10\反應(yīng)緩沖液2.5以1^，(11?1^ 0.2mmol/L 2yL，5pmol/L上游引物和下游引物各lyL，1.0 U Taq DNA聚合酶0.2yL，無(wú)菌水 補(bǔ)至25yL。5. 如權(quán)利要求3所述的一種粉蚧科昆蟲基因條形碼檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在 于，所述Sl中的樣品為菠蘿潔粉蟻、李比利氏灰粉蟻、灰粉蟻屬一種 /3eo/7rerij〇es、萍綿粉蟻、綿粉蟻屬一種/%e/3acocct/s amoae、綿粉蟻屬一種PAe/jacocct/s parn/s、石蒜綿粉蚧、扶桑綿粉蚧、桔臀紋粉蚧、臀紋粉蚧屬一種/^a/3〇 C〇CCtAs /ict/s、日本 臀紋粉蟻、臀紋粉蟻屬一臀紋粉蟻屬一種Planococcus minor、 臀紋粉蟻屬一rarae、粉蟻屬一種Pset/c/ococct/s 鹿根粉蟻、康氏 粉蟻、粉蟻屬一種JpSeuczococcus CiTPius、杰克貝爾氏粉蟻、擬長(zhǎng)尾粉蟻、粉蟻屬一種 Pseudococcus viburni。6. 如權(quán)利要求3所述的一種粉蚧科昆蟲基因條形碼檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在 于，所述S6粉蚧科昆蟲基因比對(duì)結(jié)果包括如下步驟， 561、 當(dāng)?shù)玫降男蛄信c標(biāo)準(zhǔn)基因條碼序列相似度100%，則認(rèn)定其為該種類； 562、 當(dāng)沒(méi)有與任何標(biāo)準(zhǔn)條碼序列相似度達(dá)100%，則將待測(cè)粉蚧基因序列按"無(wú)脊椎動(dòng) 物密碼子"翻譯為氨基酸，與標(biāo)準(zhǔn)基因條碼序列所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列使用"P-distance模 型"計(jì)算遺傳距離，若與未知種類粉蚧基因序列遺傳距離小于1%的標(biāo)準(zhǔn)基因條碼種類，即為 目標(biāo)種類;若遺傳距離都大于1%，判定未知粉蚧種類不在此21種粉蚧范圍內(nèi)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105925697SQ201610381928
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年6月1日
【發(fā)明人】鄭斯竹, 楊曉軍, 詹國(guó)輝
【申請(qǐng)人】蘇州市外來(lái)有害生物防控技術(shù)中心