主動脈瘤的標志物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及血管疾病的診斷和治療領域，具體涉及了一種主動脈瘤的標志物以及用于輔助診斷主動脈瘤的試劑盒。相對于健康人對照組，主動脈瘤病人血清中miR663a含量明顯升高。且miR663a與發(fā)病時間存在相關性，發(fā)病時間越短，miR663a含量越高。因此miR663a可作為主動脈瘤標志物，用于輔助診斷主動脈瘤。本發(fā)明所述主動脈瘤輔助診斷的試劑盒可以快速、靈敏、特異的用于臨床輔助診斷主動脈瘤，為臨床醫(yī)生快速準確掌握患者病情及評價治療效果奠定基礎。
【專利說明】
主動脈瘤的標志物
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及血管疾病的診斷和治療領域，具體設及一種新的主動脈瘤標志物W及 用于輔助診斷主動脈瘤的發(fā)生的方法和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 主動脈瘤(aorticaneurysm)，是指主動脈壁局部或彌漫性的異常擴張，壓迫周圍 器官而引起癥狀，瘤狀破裂為其主要危險。常發(fā)生在升主動脈主動脈弓、胸部降主動脈、胸 腹主動脈和腹主動脈。主動脈瘤發(fā)病緩慢，早期多無癥狀和體征，至后期由于動脈瘤壓迫周 圍組織而產(chǎn)生癥狀，其臨床表現(xiàn)由于動脈瘤的大小、形狀、部位和生長方向而有不同。如主 動脈瘤壓迫氣管和支氣管可引起咳嗽、氣急、肺炎和肺不張，壓迫食管引起吞咽困難，壓迫 喉返神經(jīng)引起聲音嘶啞。壓迫隔神經(jīng)引起隔肌麻搏，壓迫上腔靜脈和頭臂靜脈可引起上肢 及頸部、面部、上胸部浮腫，壓迫胸骨可引起胸痛。傳統(tǒng)的主動脈瘤的檢查方法主要為胸、腹 部X線照像、超聲波、CT血管造影(CTA)和磁共振血管造影(MRA)檢查、動脈造影等。
[0003] 近年來隨著免疫學和分子生物學技術的發(fā)展而提出的一類與細胞生長增殖有關 的物質(zhì)-生物標記物(biomarker)。它可W標記系統(tǒng)、器官、組織、細胞及亞細胞結(jié)構(gòu)或功能 的改變或可能發(fā)生的改變的生化指標，生物標記物不僅可從分子水平探討發(fā)病機制，而且 在準確、敏感地評價早期、低水平的損害方面有著獨特的優(yōu)勢，可提供早期預警，很大程度 上為臨床醫(yī)生提供了輔助診斷的依據(jù)。
[0004] 目前，最常用的主動脈瘤生物標志物是D-二聚體化-dimer),特別是急性主動脈夾 層，靈敏度可高達99%。如果D-dimer不升高，幾乎可排除主動脈夾層的可能性。然而特異度 很低，肺栓塞和冠狀動脈血栓形成等狀態(tài)下，D-dimer也會升高。并且，D-dimer的升高發(fā)生 在夾層發(fā)生之后，并不能作為預測使用。此外，C反應蛋白、平滑肌肌球蛋白重鏈、肌巧蛋白 等也都作為臨床輔助診斷主動脈瘤的生物標志物，但靈敏度和特異度都并不高，仍然需要 進一步深入研究探討。
[0005] 大量研究表明，很多miRNA參與了主動脈瘤的病理過程。但還不清楚如何利用 miRNA快速準確診斷主動脈瘤，及其在主動脈瘤發(fā)生中的預測作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的問題，提供一種新的主動脈瘤的標志 物W及用于輔助診斷主動脈瘤的試劑盒。
[0007] 在一些實施方案中，本發(fā)明收集臨床樣本，檢測健康人和主動脈瘤血清中的miRNA (microRNA)含量，分析差異表達的miRNA在各不同特征人群（性別、危險因素、病情嚴重程 度、疾病進展程度等）中表達量與該特征之間的相關性。結(jié)果顯示miR663a表達差異最大，相 對于健康人對照組，主動脈瘤病人血清中miR663a含量明顯升高。且miR663a與發(fā)病時間存 在相關性，發(fā)病時間越短，miR663a含量越高。
[000引因此本發(fā)明提供了miR663a在制備主動脈瘤標志物中的應用。
[0009] 本發(fā)明所述應用中所述主動脈瘤的受檢樣品可W采用本領域技術人員公知的任 何一種樣品，包括但不限于血液、唾液、尿液。優(yōu)選的，所述主動脈瘤的受檢樣品為血清或血 漿。
[0010] 本發(fā)明還提供了 miR663a在制備主動脈瘤輔助診斷試劑盒中的應用。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種主動脈瘤輔助診斷的試劑盒，包括miR663a的引物。 [0012]作為優(yōu)選，所述11111?663曰的引物序列如沈9 10齡.1和沈9 10齡.2所示。
[OOU]在一些實施方案中，本發(fā)明所述試劑盒還包括PCR反應常用的酶和試劑。如逆轉(zhuǎn)錄 酶、Taq酶、dNTPs、MgCl 2、DEPC水和緩沖液等。
[0014] 進一步的，在一些實施方案中，本發(fā)明所述試劑盒還包括對照品和標準品。
[0015] 由上述技術方案可知，本發(fā)明提供了一種主動脈瘤的標志物W及用于輔助診斷主 動脈瘤的試劑盒。相對于健康人對照組，主動脈瘤病人血清中miR663a含量明顯升高。且 miR663a與發(fā)病時間存在相關性，發(fā)病時間越短，miR663a含量越高。因此miR663a可作為主 動脈瘤標志物，用于輔助診斷主動脈瘤。本發(fā)明所述主動脈瘤輔助診斷的試劑盒可W快速、 靈敏、特異的用于臨床輔助診斷主動脈瘤，為臨床醫(yī)生快速準確掌握患者病情及評價治療 效果奠定基礎。
【附圖說明】
[0016] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0017] 圖1示實施例1主動脈瘤病人和健康人miR663a表達量的t檢測結(jié)果圖；
[001引圖2示實施例1主動脈瘤病人和健康人miR663a表達量的ROC曲線圖；
[0019] 圖3示實施例2急、慢性主動脈瘤病人miR663a表達量的t檢測結(jié)果圖；
[0020] 圖4示實施例2不同病程的主動脈瘤病人miR663a表達量的線性相關分析結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0021] 下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的 實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都 屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0022] 實施例1、
[0023] 1、收集主動脈瘤病人和健康人血清，于-80°C保存
[0024] 2、匹配性別和年齡，挑選37例健康人做對照，主動脈瘤病人50例；
[0025] 3、使用QIAGEN公司的microRNA提取試劑盒，按照說明書提取血清中的microRNA， 送至公司，使用液態(tài)忍片檢測microRNA表達量。分別采用兩獨立樣本t檢驗和ROC曲線的統(tǒng) 計學方法進行檢測。
[00%]結(jié)果顯示，其中miR663a表達差異最大，相對于健康人對照組，主動脈瘤病人血清 中miR663a含量明顯升高(表1、圖1和圖2)。健康人對照組平均表達量為-0.051，主動脈瘤組 平均表達量為2.624,且受試者曲線下面積(Area = O. 879)最優(yōu)。表明血清中miR663a含量與 主動脈瘤有關。
[0029]
[0030] 實施例2、
[0031] 將實施例1所述主動脈瘤病人按照急慢性進行分組，分組依據(jù)如下:慢性為無癥狀 或癥狀出現(xiàn)超過2周，急性為急性起病且病程在2周內(nèi)。分析miR663a表達量，兩獨立樣本t檢 驗進行統(tǒng)計，結(jié)果見(表2、圖3)。
[0032] 表2主動脈瘤病人按照急慢性分組miR663a表達情況
[0033]
[0034]
[00對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于對照組或慢性組，急性起病組miR663a表達量更高，差異具有統(tǒng) 計學意義。
[0036] 進一步將實施例1所述主動脈瘤病人病程細分為如下幾組:發(fā)病時間超過5年，1-5 年，2個月-1年，1個月-2個月，7天-1個月，1-7天，小于1天。分析miR663a表達量，采用線性相 關分析，結(jié)果見(表3、圖4)。
[0037] 表3豐動脈漓病人按照發(fā)病時間分組miR663a表試信況 [00；3 引
[0039]
[0040] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR663a與發(fā)病時間存在相關性，即發(fā)病時間越短，miR663a含量越高。 [0041 ] 上述結(jié)果表明miR663a與主動脈瘤急慢性起病相關。
[0042] 實施例3、主動脈瘤檢測試劑盒
[0043] 包括miR663a上游引物（SEQ ID No.l)和miR663a下游引物（SEQ ID No.2)，Taq DNA 聚合酶，MgCbSYBRGreen 等。
[0044] 實施例4、主動脈瘤檢測方法
[0045] 1、使用血清/血漿miRNA提取試劑盒提取miRNA，具體操作為：
[0046] (1)血清/血漿+加入裂解液(血清/血漿:裂解液=1:5)，室溫提取5min;
[0047] (2)加入 3. 對照內(nèi)參，miR39;
[004引（3)加入氯仿(血清/血漿:氯仿=1:1)，振蕩15s，室溫放置3min;
[0049] (4) 12000g，4°C離屯、15min，上清轉(zhuǎn)移至新的收集管，加入1.5倍體積的無水乙醇， 混勻；
[0050] (5)吸取7(K)化混合液加入新的收集管后，^SOOOg室溫離屯、15s，剩余液體重復此 步；
[0化1] (6)加入700化洗脫液RWT，^SOOOg室溫離屯、15s;
[0化2] (7)加入500化洗脫液RPE，^SOOOg室溫離屯、15s;
[0化3] (8)加入50化L80 %乙醇，^ SOOOg室溫離屯、2min; (9)換新的收集管，開蓋全速離屯、 Smin ；
[0054] (10)換新的收集管，加入1化L無RNA酶的水，全速離屯、Imin;
[0055] (11 )Nano化OP測樣品濃度，RNA樣品可置于-20 r長期保存；
[0056] 2、RT-PCR 檢測 miR663a 表達。
[0057] (1 )miRNA反轉(zhuǎn)錄:使用miRNA反轉(zhuǎn)試劑盒，對包含miRNA的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄；
[0〇5 引（2)RT-PCR:利用 SYBR Green 和 miR663a 特異性引物（SEQ ID No.l 和 SEQ ID 齡.2)檢測11111?66：3曰的表達。
【主權項】
1. miR663a在制備主動脈瘤標志物中的應用。2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于，所述主動脈瘤的受檢樣品為血清或血漿。 3 .miR663a在制備主動脈瘤輔助診斷試劑盒中的應用。4. 一種主動脈瘤輔助診斷的試劑盒，其特征在于，包括miR663a的引物。5. 根據(jù)權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述miR663a的引物序列如SEQ ID No. 1 和SEQ ID No.2所示。6. 根據(jù)權利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于，還包括PCR反應常用的酶和試劑。
【文檔編號】C12Q1/68GK105925705SQ201610424000
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月14日
【發(fā)明人】杜杰, 李玉琳, 劉璐鑫
【申請人】北京市心肺血管疾病研究所