鴿1型副粘病毒毒株af-1及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鴿1型副粘病毒毒株AF?1及其應(yīng)用。該毒株為鴿1型副粘病毒AF?1，其保藏號(hào)為：CCTCC NO：V 201613。利用鴿1型副粘病毒毒株AF?1制備滅活疫苗的方法，首先培養(yǎng)鴿1型副粘病毒毒株AF?1，得到AF?1株病毒液，向AF?1株病毒液中加入β?丙內(nèi)酯；滅活得到混合液；再加入吐溫?80得到水相溶液；向白油中加入硬脂酸鋁，邊加邊攪拌直到完全透明為止，再加入吐溫?80得到油相溶液；向油相溶液中緩緩加入水相溶液置于乳化罐內(nèi)進(jìn)行乳化；得到滅活疫苗。本發(fā)明的滅活疫苗幫助鴿子有效抵抗鴿副黏病毒I型病毒引起的感染，極大的減少損失并促進(jìn)鴿業(yè)的發(fā)展。該疫苗安全、有效，能應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。CCTCC NO：V 20161320160310
【專利說(shuō)明】
鴿1型副粘病毒毒株AF-1及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及鴿1型副粘病毒，具體地指一種鴿1型副粘病毒毒株AF-1及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鴿瘟，又稱鴿新城疫或巴拉米哥病毒病，由鴿1型副粘病毒（Pigeon Paramyxovirus 1; PPMV-1)引起。該病流行廣泛，主要導(dǎo)致鶴下痢、神經(jīng)癥狀及死亡等，給全 球養(yǎng)鴿業(yè)健康發(fā)展造成極大的障礙。不同品種、不同齡期的鴿子均易感。一般來(lái)說(shuō)，鴿的發(fā) 病率可高達(dá)80~90%。根據(jù)具體免疫狀況以及飼養(yǎng)條件，其死亡率大致為30~80%。
[0003] 由于鴿子不直接影響大多數(shù)人的日常生活，并且養(yǎng)殖量相對(duì)較小。所以幾十年來(lái) 并沒(méi)有引起相關(guān)行業(yè)認(rèn)識(shí)及國(guó)家的重視，目前缺乏針對(duì)鴿新城疫的專用疫苗用于預(yù)防控 制。長(zhǎng)期以來(lái)，纟鳥(niǎo)子養(yǎng)殖戶大量使用雞源的新城疫疫苗進(jìn)行免疫。雖然纟鳥(niǎo)1型副粘病毒與雞 新城疫病毒同屬副粘病毒，但由于其基因型存在差異，保護(hù)效果差強(qiáng)人意。隨著中國(guó)賽鴿運(yùn) 動(dòng)的快速發(fā)展，每年因賽鴿感染鴿新城疫而造成了無(wú)法挽回的巨大經(jīng)濟(jì)損失。
[0004] 因此，迫切需要開(kāi)發(fā)一種針對(duì)性的鴿新城疫疫苗。大的減少損失并促進(jìn)鴿業(yè)的發(fā) 展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供了一種鴿1型副粘病毒毒株AF-1及其應(yīng)用。本發(fā)明利用鴿1型 副粘病毒毒株AF-1制備針對(duì)鴿瘟的效價(jià)穩(wěn)定的滅活疫苗;該滅活疫苗幫助鴿子有效抵抗鴿 副黏病毒I型病毒引起的感染，極大的減少損失并促進(jìn)鴿業(yè)的發(fā)展。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種鴿1型副粘病毒毒株AF-1，毒株為鴿1型副粘 病毒AF-1，其保藏號(hào)為:CCTCC N0:V 201613。
[0007] 上述毒株是2014年11月從安徽阜陽(yáng)某鴿場(chǎng)的病死鴿中分離得到，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)擴(kuò)增，連接基因測(cè)序鑒定該病毒確為鴿1型副粘病毒（Pigeon Paramyxovirus-1，PPMV-1)。
【申請(qǐng)人】將該病毒株命名為鴿1型副粘病毒AF-1株(PPMV-1AF-1 株）。并將該病毒于2016年3月10日保藏于中國(guó)武漢市武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)，其保藏號(hào)為:CCTCC N0:V 201613。
[0008] 進(jìn)一步地，所述毒株AF-1的形態(tài)學(xué)特征為:在電子顯微鏡下，PPMV-1病毒顆粒呈多 形性，直徑約為100~250nm，有不同長(zhǎng)度的細(xì)絲;有囊膜，在囊膜的外層有呈放射狀排列的 突起物或稱纖突;具有能刺激宿主產(chǎn)生抑制紅細(xì)胞凝集素和病毒中和抗體的抗原成分病毒 粒子以圓形為主，常因囊膜破損而呈現(xiàn)多形性;粒子內(nèi)部含義直徑為16~20μπι的卷曲狀的 核衣殼，其表面覆蓋有6~10nm長(zhǎng)的纖突。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種上述鴿1型副粘病毒毒株AF-1在制備防治鴿副黏病毒I型病 毒引起地鴿瘟的疫苗中應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明還提供了一種利用鴿1型副粘病毒毒株AF-1制備滅活疫苗的方法，包括以 下步驟：
[0011] 1)培養(yǎng)鴿1型副粘病毒毒株AF-1，得到AF-1株病毒液，其中，病毒液中，AF-1株病毒 含量為 l〇7.QEID5〇/0.1mL;
[0012] 2)向步驟1)中得到的AF-1株病毒液中加入β-丙內(nèi)酯;邊加邊混合，直至混合均勻， 滅活得到混合液；
[0013] 3)取注射用白油94份，加硬脂酸鋁2份，邊加邊攪拌，直到完全透明為止，再加入司 本-80 6份，混合后，高壓滅菌備用。;
[0014] 4)按體積比96:4混合液中加入吐溫-80,充分混勻，直到完全溶解，得到水相溶液；
[0015] 5)按體積比1: 2取水相溶液和油相溶液，然后向油相溶液中緩緩加入水相溶液置 于乳化罐內(nèi)進(jìn)行乳化;得到滅活疫苗。
[0016] 進(jìn)一步地，所述步驟1)中，毒株AF-1培養(yǎng)過(guò)程中，是將鴿1型副粘病毒毒株AF-1置 于SPF雞胚進(jìn)行培養(yǎng)。
[0017] 再進(jìn)一步地，所述步驟2)中，AF-1株病毒液與β-丙內(nèi)酯體積比為2000:1，再進(jìn)一步 地，所述步驟2)中，滅活溫度為4°C，時(shí)間為8h。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0019] 1)本發(fā)明的毒株是從目前的流行毒株中篩選而出，具有免疫原性好、增殖滴度高 的特點(diǎn)。通過(guò)最佳接種量、最優(yōu)培養(yǎng)溫度、最適收毒時(shí)間等條件的優(yōu)化，可生產(chǎn)出效價(jià)穩(wěn)定 的鴿1型副黏病毒。本發(fā)明還對(duì)該滅活疫苗的生產(chǎn)工藝、安全性、免疫保護(hù)效果、免疫程序和 保存期等研究做了評(píng)價(jià)，結(jié)果表明該疫苗安全、有效，能應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。
[0020] 2)本發(fā)明利用AF-1株制備的滅活疫苗經(jīng)皮下注射能夠在鴿體內(nèi)產(chǎn)生非常高的抗 體水平，并且?guī)椭澴佑行У挚锅澑别げ《綢型病毒引起的感染，保護(hù)效率高達(dá)90%以上。 經(jīng)免疫的鴿子，未發(fā)現(xiàn)明顯的不適反應(yīng)，因此具有良好的安全性。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但 本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實(shí)施例。
[0022]實(shí)施例1病毒的分離與鑒定
[0023]從安徽某養(yǎng)鴿場(chǎng)采集病死鴿內(nèi)臟組織經(jīng)過(guò)RNA提取后經(jīng)RT-PCR方法檢測(cè)后確定為 鴿副黏病毒1型，將該病毒株命名為鴿副黏病毒PPMV-1AF-1株。具體操作步驟如下：
[0024] 1、雞胚增殖
[0025] 將病料處理液加入雙抗(最終濃度為10000U/ml)，于33~35°C孵育30分鐘后，經(jīng)絨 毛尿囊腔接種9~11日齡SPF雞胚，每份病料接種4雞胚枚，每胚0.2ml。接種的雞胚置33~35 °C孵育96小時(shí)，濕度保持為60~65%，定時(shí)照蛋。24小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚棄去。取24~96小時(shí) 死亡和存活的雞胚置2~8°C冷卻過(guò)夜或_20°C以下冷卻1~2小時(shí)，無(wú)菌收集尿囊液，12000 轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，以去除紅細(xì)胞和大的雜質(zhì)，取上清進(jìn)行紅細(xì)胞凝集(HA)試驗(yàn)。對(duì)于第 一代尿囊液為陰性的取上清按以上方法繼續(xù)接種SPF胚盲傳三代，如仍為陰性則棄之，陽(yáng)性 置-70°C以下保存?zhèn)溆谩?br>[0026] 2、紅細(xì)胞凝集(HA)試驗(yàn)向微量血凝板中加入25μ1 PBS，共做3組平行重復(fù)。吸取25 μL尿囊液并加入到第一列各孔，然后從左到右進(jìn)行2倍系列稀釋至第11列各孔，從第11列各 孔吸取25μ1混合液，棄去。第12列各孔不加抗原，作為對(duì)照孔。然后向每孔中加入25μ1 1% 紅細(xì)胞懸液。將板震蕩1分鐘，然后室溫靜置25~30分鐘，判定結(jié)果。
[0027] 3、病毒RNA的提取，cDNA的合成以及基因的擴(kuò)增
[0028] 3.1、病毒RNA的提取
[0029] 將已研磨好的病料6000rpm離心5min，取上清200yL，加入1.5ml的EP管中，每管加 入lml RNAiso Reagent，用移液器吹打均勻后室溫靜置lOmin;每管加入200yL的三氯甲烷， 渦旋儀混勻，置冰浴lOmin后，4°C，12000rpm，離心10min。取600yL上清轉(zhuǎn)移至新的離心管 中，并加入等體積的異丙醇，禍旋儀混勾后室溫靜置lOmirufC，12000rpm，離心10min。棄上 清(除凈異丙醇），沿離心管壁緩緩加入lml無(wú)水乙醇，反復(fù)顛倒混勻，7800rpm，5min。將除去 乙醇的基因組RNA沉淀在室溫下干燥5-10min，緩慢加入適量的DEPC水(20-50yL)溶解基因 組 RNA。
[0030] 3.2、1型副粘病毒〇0嫩的合成
[0031] 反轉(zhuǎn)錄用的引物序列Unil2(單鏈）：5'-AGCAAAAGCAGG-3' ；鴿副黏病毒cDNA合成： [0032]在20yL反轉(zhuǎn)錄體系中進(jìn)行，依次加入以下組分：
[0035] 將上述試劑或酶混勻后置PCR儀上，于42 °C下反應(yīng)60min，95 °C下反應(yīng)5min進(jìn)行反 轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)產(chǎn)物直接用于PCR或于4°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0036] 3.3、1型副粘病毒的？0?鑒定
[0037] 根據(jù)鴿副黏病毒1型F基因設(shè)計(jì)引物，引物序列：
[0038] 上游引物：5'-(^&七區(qū)區(qū)區(qū)(：1：(^&&&(^1:1：(31：-3'；
[0039] 下游引物：5'_ggtcatgtt cttgtagtgg-3'。
[0040] 采用20yL體系進(jìn)行DNA擴(kuò)增，反應(yīng)體系及程序如下：
[0042] PCR 反應(yīng)參數(shù)：951€5111丨11;941€3〇8,55 1€3〇8,721€3111丨11，30個(gè)循環(huán)；72。(：延伸1〇11^11。 F基因的擴(kuò)增結(jié)果分別見(jiàn)圖1，將PCR產(chǎn)物純化后連接pMD18-T載體(購(gòu)自寶生物工程大連有 限公司，其載體圖譜見(jiàn)寶生物工程大連有限公司的PMD18-T載體說(shuō)明書(shū)）。
[0043] 4、病毒的保藏
[0044] 發(fā)明人對(duì)該毒株(AF-1株)進(jìn)行了生物保藏。保藏單位為：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中 心(CCTCC)保藏，其保藏號(hào)為:CCTCC N0:V 201613。
[0045] 實(shí)施例2滅活疫苗1的制備
[0046] 1、病毒含量測(cè)定
[0047]將病毒液用滅菌的生理鹽水作10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10- 83個(gè)稀釋度尿囊腔 內(nèi)接種10日齡的SPF雞胚，每個(gè)稀釋度接種5枚，0. lml/胚，記錄24~120小時(shí)雞胚感染情況， 計(jì)算EID5Q，每0.1ml病毒含量應(yīng)多107' QEID5Q。經(jīng)測(cè)定，收獲尿囊液混合后EID5Q見(jiàn)下表：
[0048] 表 1 Reed-Muench 法計(jì)算 EID5Q 結(jié)果
[0049]
[0050]計(jì)算方法如下：
[0052] lgEID5Q =高于50%感染的病毒最高稀釋度的對(duì)數(shù)+距離比例X稀釋度之間的差。
[0053] 距離比例=〇.78
[0054] lgEID5〇 = -7+(-lX0.78)=-7.78
[0055] 則 EID5q=10-7.78/0.1ml
[0056] 2、病毒滅活
[0057]將上述胚液以4層紗布及一層細(xì)銅紗網(wǎng)濾過(guò)，混合于一個(gè)大玻璃瓶?jī)?nèi)。然后按 0.05%加入β-丙內(nèi)酯，隨加隨搖，使其充分混合。然后在4°C滅活（以瓶?jī)?nèi)溫度達(dá)到4°C開(kāi)始 計(jì)時(shí))8小時(shí)。
[0058] 3、滅活檢驗(yàn)
[0059] 取10日齡SPF雞胚5個(gè)，0.2ml/胚，接種后每日照蛋2次，觀察5日，并對(duì)所有胚液分 別測(cè)定血凝價(jià)，通過(guò)對(duì)雞胚的觀察和雞胚液的血凝價(jià)的測(cè)定，確定胚液的滅活效果。血凝價(jià) 低于1:4盼為陰性，陰性再次接種10日齡SPF雞胚5個(gè)，0.2ml/胚，5天后測(cè)血凝價(jià)，仍為陰性 的盼為滅活合格。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)下表：
[0060] 表2滅活病毒接種-SPF雞胚后HA效價(jià)
[0061]
[0062] 4、疫苗乳化
[0063] 4.1油佐劑滅活疫苗1的制備
[0064] 4.1油相制備取注射用白油94份，加硬脂酸鋁2份，邊加邊攪拌，直到完全透明為 止，再加入司本-80 6份，混合后，高壓滅菌備用。
[0065] 4.2水相制備將滅活的鴿副粘病毒I型AF-1株病毒液96份，加入滅菌的吐溫-80 4 份，充分搖動(dòng)，直到吐溫-80完全溶解。
[0066] 4.3乳化取6份油相放入乳化罐內(nèi)，慢速攪拌同時(shí)緩緩加入3份水相，加完后，中速 混合，然后高速乳化，制成滅活疫苗。
[0067] 實(shí)施例3
[0068] 1、疫苗安全性試驗(yàn)
[0069]用21~30日齡鴿副粘病毒I型抗體陰性鴿15只，10只各頸部皮下注射疫苗lml，另5 只作對(duì)照。觀察14日，應(yīng)不出現(xiàn)因注射疫苗而引起的局部和全身不良反應(yīng)。檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表： [0070]表3滅活疫苗超劑量接種21~30日齡鴿副粘病毒I型抗體陰性鴿安全性檢測(cè)
[0072] 2、免疫以及攻毒保護(hù)力實(shí)驗(yàn)
[0073] 2.1、免疫
[0074]用21~30日齡鴿副粘病毒I型抗體陰性鴿15只，10只各頸部皮下注射疫苗200μ1， 另5只作對(duì)照。
[0075] 2.2、血清抗體檢測(cè)
[0076]接種后21~28日，每只各采血，分離血清，進(jìn)行HI抗體效價(jià)測(cè)定。免疫組HI抗體效 價(jià)的幾何平均值應(yīng)不小于41og2,未免疫對(duì)照組HI抗體效價(jià)的幾何平均值應(yīng)不大于21og2。 免疫后21天采血，檢測(cè)血清抗體，抗體檢測(cè)HI結(jié)果見(jiàn)下表：
[0077]表4滅活疫苗免疫后血清抗體檢測(cè)
[0079] 2.3、攻毒保護(hù)力實(shí)驗(yàn)
[0080] 接種后21~28日，每只鴿肌肉注射疫苗病毒AF-1株105'QELD 5Q，觀察14日。攻毒后結(jié) 果見(jiàn)下表：
[0081 ]表5滅活疫苗免疫后攻毒保護(hù)結(jié)果
[0083] 試驗(yàn)結(jié)果表明：該疫苗安全、無(wú)可見(jiàn)不良副反應(yīng)，疫苗抗體產(chǎn)生時(shí)間快，抗體效價(jià) 41og2以上能有效抵抗強(qiáng)毒株AF-1株感染。
[0084] 其它未詳細(xì)說(shuō)明的部分均為現(xiàn)有技術(shù)。盡管上述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做出了詳盡的描 述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，人們還可以根據(jù)本實(shí)施例在不經(jīng) 創(chuàng)造性前提下獲得其他實(shí)施例，這些實(shí)施例都屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鴿1型副粘病毒毒株AF-1，其特征在于:毒株命名為鴿1型副粘病毒AF-1，其保藏 號(hào)為：CCTCC NO:V 201613。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述鴿1型副粘病毒毒株AF-1，其特征在于:所述毒株AF-1的形態(tài)學(xué) 特征為:在電子顯微鏡下，PPMV-1病毒顆粒呈多形性，直徑約為100~250nm，有不同長(zhǎng)度的 細(xì)絲;有囊膜，在囊膜的外層有呈放射狀排列的突起物或稱纖突;具有能刺激宿主產(chǎn)生抑制 紅細(xì)胞凝集素和病毒中和抗體的抗原成分病毒粒子以圓形為主，常因囊膜破損而呈現(xiàn)多形 性;粒子內(nèi)部含義直徑為16~20μπι的卷曲狀的核衣殼，其表面覆蓋有6~10nm長(zhǎng)的纖突。3. -種權(quán)利要求1所述的鴿1型副粘病毒毒株AF-1在制備防治鴿副黏病毒I型病毒引起 地鴿瘟的疫苗中應(yīng)用。4. 利用權(quán)利要求1所述鴿1型副粘病毒毒株AF-1制備滅活疫苗的方法，其特征在于:包 括以下步驟： 1) 培養(yǎng)鴿1型副粘病毒毒株AF-1，得到AF-1株病毒液； 2) 向步驟1)中得到的AF-1株病毒液中加入β-丙內(nèi)酯;邊加邊混合，直至混合均勻，滅活 得到混合液； 3) 取注射用白油94份，加硬脂酸鋁2份，邊加邊攪拌，直到完全透明為止，再加入司本-80 6份，混合后，高壓滅菌備用； 4) 按體積比96:4混合液中加入吐溫-80，充分混勻，直到完全溶解，得到水相溶液； 5) 按體積比1:2稱取水相溶液和油相溶液，然后將油相溶液和水相溶液置于乳化罐內(nèi) 進(jìn)行乳化;得到滅活疫苗。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述鴿1型副粘病毒毒株AF-1制備滅活疫苗的方法，其特征在于:所 述步驟1)中，毒株AF-1培養(yǎng)過(guò)程中，是將鴿1型副粘病毒毒株AF-1置于SPF雞胚進(jìn)行培養(yǎng)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述鴿1型副粘病毒毒株AF-1制備滅活疫苗的方法，其特征在于:所 述病毒液中，AF-1株病毒數(shù)量為10 7'QEID5〇/0. lmL。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述鴿1型副粘病毒毒株AF-1制備滅活疫苗的方法，其特征在于:所 述步驟2)中，AF-1株病毒液與β-丙內(nèi)酯體積比為2000:1。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述鴿1型副粘病毒毒株AF-1制備滅活疫苗的方法，其特征在于:所 述步驟2)中，滅活溫度為4°C，時(shí)間為8h。
【文檔編號(hào)】C12N7/00GK105936893SQ201610361716
【公開(kāi)日】2016年9月14日
【申請(qǐng)日】2016年7月14日
【發(fā)明人】陳博
【申請(qǐng)人】武漢巴蒂思生物科技有限公司