一種茶樹(shù)紫芽相關(guān)蛋白CsGST及其編碼基因和應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】一種茶樹(shù)紫芽相關(guān)蛋白CsGST及其編碼基因和應(yīng)用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。該茶樹(shù)紫芽相關(guān)蛋白CsGST的氨基酸序列為：1）SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列；或 2）SEQ ID No.2 所示的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列；編碼該蛋白的基因核苷酸序列為：1）SEQ ID No.1 所示的核苷酸；或2）SEQ ID No.1 所示的核苷酸序列經(jīng)取代一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，得到編碼 CsGST的核苷酸序列。本發(fā)明驗(yàn)證了CsGST基因具有提高植物花青素含量的功能，為定向培育紫芽茶樹(shù)品種提供候選基因。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種茶樹(shù)紫芽相關(guān)蛋白CsGST及其編碼基因和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種茶樹(shù)紫芽相關(guān)蛋白CsGST及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]紫芽茶樹(shù)是一種重要的特色茶樹(shù)資源。自本世紀(jì)以來(lái)我國(guó)育成的紫芽茶樹(shù)品種主要有紫娟茶和紫燕茶。這些紫芽茶主要與其花青素含量較高有關(guān)。與普通茶葉相比，紫芽茶具有更多藥用保健價(jià)值，例如紫芽茶對(duì)癌細(xì)胞增殖具有更強(qiáng)的抑制效果。對(duì)心血管疾病、神經(jīng)性疾病具有更好的預(yù)防作用。對(duì)眼科疾病、循環(huán)系統(tǒng)紊亂等也具有很好的療效。同時(shí)紫芽茶還可以作為一種綠色安全的天然色素應(yīng)用于食品工業(yè)。因此對(duì)紫芽茶的開(kāi)發(fā)和利用越來(lái)越受到人們的重視。
[0003]對(duì)于紫芽茶的成色機(jī)理，過(guò)去一直缺乏深入研究。在模式植物擬南芥中，與花青素累積相關(guān)的基因主要涉及類(lèi)黃酮合成、花青素轉(zhuǎn)運(yùn)及轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。在茶樹(shù)中究竟哪一步是限制性因子，目前尚不得而知，從而也還沒(méi)有一種可靠的定向培育紫芽茶樹(shù)品種的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種茶樹(shù)紫芽相關(guān)蛋白CsGST及其編碼基因和應(yīng)用的技術(shù)方案。
[0005]所述的一種茶樹(shù)紫芽相關(guān)蛋白CsGST，其特征在于其氨基酸序列為:
DSEQ ID N0.2所示的氨基酸序列；或
2)SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基形成的具有同等功能的氣基酸序列。
[0006]所述的編碼蛋白的基因，其特征在于其核苷酸序列為:
DSEQ ID N0.1所示的核苷酸;或
2)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，得到編碼CsGST的核苷酸序列。
[0007]所述的含有編碼基因的重組載體。
[0008]所述的編碼基因在調(diào)控茶樹(shù)芽葉花青素含量中的應(yīng)用。
[0009]所述的編碼基因在提高茶樹(shù)芽葉花青素含量中的應(yīng)用。
[0010]所述的一種制備花青素含量提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于包括如下步驟:將所述的編碼基因?qū)氤霭l(fā)植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物;與出發(fā)植物相比，轉(zhuǎn)基因植物的花青素含量提高。
[0011 ]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明在茶樹(shù)中發(fā)現(xiàn)蛋白CsGST，將該蛋白對(duì)應(yīng)的基因在擬南芥中過(guò)表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植物的葉花青素含量高于野生型對(duì)照，驗(yàn)證了該基因具有提高植物花青素含量的功能，為定向培育紫芽茶樹(shù)品種提供候選基因。
【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1紫娟茶與龍井43不同葉位(一芽一葉、第二葉、第三葉、第四葉、第五葉、第六葉)表型；
圖2為花青素累積緊密相關(guān)的CsGSTl基因序列；
圖3紫娟茶與龍井43不同葉位花青素含量；
圖4紫娟茶與龍井43不同葉位CsGST I基因qPCR相對(duì)定量結(jié)果；
圖5擬南芥ttl9突變體轉(zhuǎn)基因前后花青素含量測(cè)定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0013]以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例
[0014](I)茶樣制備:在夏茶季節(jié)取生長(zhǎng)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗(yàn)場(chǎng)生長(zhǎng)期一致的紫芽品種紫娟茶及綠芽品種龍井43—芽一葉，用液氮速凍后暫存在-80°C冰箱中，用于提取總RNA。每組試驗(yàn)樣品兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)。如圖1所示紫娟茶與龍井43不同葉位(一芽一葉、第二葉、第三葉、第四葉、第五葉、第六葉)表型。
[0015](2)測(cè)序及轉(zhuǎn)錄組分析:茶樣用液氮研磨后用Qiagen公司的RNA提取試劑提取總RNAt3IiiRNA用Illumina公司的Truseq RNA Sample Prep試劑盒進(jìn)行純化。RNA完整性及分布由B1analyzer 2100 (Agilent technologies , Palo Alto, CA,美國(guó))測(cè)定。之后mRNA被切割為小片段，以這些片段為模板，使用隨機(jī)六聚體引物合成cDNA第一鏈。利用dNTPs、DNA聚合酶I和緩沖液等合成cDNA第二鏈。采用TAKARA的PCR試劑盒提取純化的短片段(TakaraB1，大津，日本)。測(cè)序適配器分別連接到短片段并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分辨。選擇適當(dāng)?shù)钠?，并純化，隨后PCR擴(kuò)增，以創(chuàng)建最終的cDNA文庫(kù)。
[0016]然后，CDNA序列通過(guò)IlluminaHiSeq 2500系統(tǒng)(Illumina, San Diego , CA,美國(guó))進(jìn)行測(cè)序(150 bp雙向測(cè)序)。通過(guò)對(duì)讀取的原始序列進(jìn)行篩選，刪除適配器序列，空序列和低質(zhì)量序列以提高序列質(zhì)量。產(chǎn)生的序列進(jìn)行BLAST搜索和注釋?zhuān)瑓⒖嫉臄?shù)據(jù)庫(kù)包括NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Nr數(shù)據(jù)庫(kù)、Pf am數(shù)據(jù)庫(kù)、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)和GO數(shù)據(jù)庫(kù)，比較的E值必須小于10一5。
[0017](3)差異基因篩選:基因的表達(dá)水平采用FPKM(每百萬(wàn)測(cè)序堿基中每千個(gè)轉(zhuǎn)錄子測(cè)序堿基中所包含的測(cè)序片斷數(shù))進(jìn)行比較。采用cuffdiff軟件用確定差異表達(dá)(FDRS0.01)的基因。對(duì)其中與花青素合成、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的差異基因進(jìn)行分析，獲得一條與花青素累積緊密相關(guān)的CsGSTl基因序列。該基因序列長(zhǎng)為1179bp，其閱讀框長(zhǎng)為642bp，編碼蛋白包含213個(gè)氨基酸，具體序列如圖2所示。
[0018]該編碼蛋白與山葡萄中與花青素累積相關(guān)的GST(ACN38271.1)相似度達(dá)到80%，與模式植物擬南芥中GSTF12(TT19)的相似度達(dá)到58%，因此它們是高度同源的基因。
[0019](4)實(shí)時(shí)熒光定量分析:為驗(yàn)證CsGSTl基因，測(cè)定龍井43及紫娟茶不同葉位(一芽一葉、第二葉、第三葉、第四葉、第五葉和第六葉)花青素含量及CsGST I基因相對(duì)表達(dá)量?；ㄇ嗨睾繙y(cè)定采用分光光度計(jì)法，CsGSTl基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。
[0020]熒光定量PCR采用ABI7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied B1systems)，以SYBR Green染料進(jìn)行標(biāo)記。內(nèi)參基因選擇茶樹(shù)GAPDH基因(GE651107)。采用的引物為CsGSTl-F: 5’-TATTCATGTTGATCTTGACTCTGGA-3’；CsGSTl-R: 5’-CTTCCAGAGTGGTTCCTAGTAGGTT-3’；GAPDH-F: 5 ’ -TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3 ’ 及 GAPDH-R: 5 ’ -CAGTGGGAACACGGAAAGC-3 ’。反應(yīng)體系為25μ1，包含0.5yL LATaq,5yL PCR緩沖液，2yL dNTP(2.5 mM)，0.5yL引物(10 Μ)，1μL cDNA(40 ng)和 15.5yL CldH2O0 反應(yīng)條件為:94°C，3分鐘；95°C，30秒；60°C，30秒；72°C，I分鐘;30個(gè)循環(huán)。72 °C，1分鐘;4 °C保存。每組樣品3個(gè)重復(fù)。
[0021 ]花青素提取取不同葉位鮮樣0.1 g，放入2mL離心管，用自動(dòng)研磨機(jī)研磨成粉后加入1.5mL 0.1 mol.L—1鹽酸乙醇溶液，在60 °C水浴中浸提30分鐘，4°C3000g離心10 min,取上清液用于花青素測(cè)定，每組樣品3個(gè)重復(fù)?；ㄇ嗨販y(cè)定采用UV-160型日本島津紫外分光光度計(jì)，測(cè)定提取液在530nm、620nm和650nm波長(zhǎng)下的吸光值，并進(jìn)行換算。試驗(yàn)結(jié)果表明紫鵑茶與龍井43各個(gè)葉位花青素含量與CsGSTl基因表達(dá)水平呈極顯著正相關(guān)。如圖3所示，紫娟茶與龍井43不同葉位花青素含量。如圖4所示，紫娟茶與龍井43不同葉位CsGSTl基因qPCR相對(duì)定量結(jié)果。
[0022] (5)轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證:將茶樹(shù)CsGSTl全長(zhǎng)cDNA克隆到含有35S啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體P B I I 2 I上。具體步驟包括:設(shè)計(jì)特異引物:C s G S T 1- F 2: 5 ’ -TCTAGAATGGTTGTTAAAGTGTATGGTC-3’； CsGSTl_R2: 5’-GGATCCCTAGTCCATGAGATTCATGAC-3’。以紫娟茶cDNA為模板，獲得CsGSTl的cDNA序列。通過(guò)PCR在該序列兩側(cè)引入FBamH /位點(diǎn)，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)目標(biāo)片段切膠回收。將回收純化后的PCR產(chǎn)物與PMD19-T載體連接。通過(guò)熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。菌液涂于含氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)16h。測(cè)序正確的帶有CsGSTl基因的序列雙酶切后連入pBI121質(zhì)粒，構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體P35S::CsGSTl。再通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，后侵染擬南芥ttl9-8突變體(salk_105779擬南芥突變體)。該突變體突變基因?yàn)閿M南芥中CsGSTl的同源基因TT19。該TT19敲除突變體幾乎沒(méi)有花青素積累。采用花序侵染法將CsGSTl轉(zhuǎn)入ttl9-8突變體。轉(zhuǎn)基因株系篩選到T2代純系后進(jìn)行表型性狀觀察及花青素測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因株系ttl9-8-0El與ttl9-8-0E2在2%糖處理?xiàng)l件下子葉和莖呈紫色，而ttl9-8突變體子葉和莖呈黃綠色?；ㄇ嗨販y(cè)定表明轉(zhuǎn)基因株系花青素含量提高了 10倍左右，如圖5所示，擬南芥ttl9突變體轉(zhuǎn)基因前后花青素含量測(cè)定結(jié)果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種茶樹(shù)紫芽相關(guān)蛋白CsGST，其特征在于其氨基酸序列為: DSEQ ID N0.2所示的氨基酸序列；或 2)SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基形成的具有同等功能的氣基酸序列。2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因，其特征在于其核苷酸序列為: 1)SEQID N0.1所示的核苷酸;或 2)SEQID N0.1所示的核苷酸序列經(jīng)取代一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，得到編碼CsGST的核苷酸序列。3.含有如權(quán)利要求1所述編碼基因的重組載體。4.如權(quán)利要求2所述的編碼基因在調(diào)控茶樹(shù)芽葉花青素含量中的應(yīng)用。5.如權(quán)利要求2所述的編碼基因在提高茶樹(shù)芽葉花青素含量中的應(yīng)用。6.—種制備花青素含量提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于包括如下步驟:將權(quán)利要求2所述的編碼基因?qū)氤霭l(fā)植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物;與出發(fā)植物相比，轉(zhuǎn)基因植物的花青素含量提高。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK105936898SQ201610572400
【公開(kāi)日】2016年9月14日
【申請(qǐng)日】2016年7月20日
【發(fā)明人】韋康, 成浩, 王麗鴛, 阮麗, 李海琳, 吳立赟
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所