抗cd 30 嵌合抗原受體及其用圖
【專(zhuān)利摘要】于一方面，本發(fā)明關(guān)于經(jīng)基因改造的T細(xì)胞，其具有一嵌合抗原受體，以用于治療一個(gè)體內(nèi)的CD30+癌癥的過(guò)繼性細(xì)胞療法中。更具體的，本發(fā)明關(guān)于一種具有可對(duì)CD30+癌細(xì)胞表現(xiàn)毒性但對(duì)CD30+非癌細(xì)胞不具毒性的一特定嵌合抗原受體的T細(xì)胞。進(jìn)一步地，本發(fā)明關(guān)于一種特定嵌合抗原受體以及可編碼出該受體的核酸分子與具有相同核酸分子的載體與細(xì)胞。最后，本發(fā)明關(guān)于該嵌合抗原受體的用途，以用于改善具有相同受體的淋巴細(xì)胞的持久性與放大作用，以及特定勝肽的用途，用以改善經(jīng)基因改造并表現(xiàn)出相同勝肽的淋巴細(xì)胞的持久性與放大作用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
抗CD30嵌合抗原受體及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明第一方面關(guān)于經(jīng)過(guò)基因改造的T細(xì)胞，其具有一嵌合抗原受體(CAR)，用于 對(duì)需要治療CD30+癌癥的個(gè)體所進(jìn)行的過(guò)繼性細(xì)胞療法。更具體的，本發(fā)明關(guān)于一種經(jīng)過(guò)基 因工程的T細(xì)胞，其中含有并表現(xiàn)出一種特定嵌合抗原受體，其對(duì)于CD30+癌細(xì)胞具有毒性， 但對(duì)于CD30+則不具有毒性。另一方面，本發(fā)明關(guān)于一種特定嵌合抗原受體以及編碼相同的 細(xì)胞核酸分子，以及相同編碼的載體及細(xì)胞。最后，本發(fā)明關(guān)于利用一嵌合抗原受體改良具 有相同編碼的淋巴細(xì)胞的持久性與放大作用，以及利用特定勝肽以改良經(jīng)基因改造并表現(xiàn) 出相同特征的淋巴細(xì)胞的持久性與增殖作用。
【背景技術(shù)】
[0002] 過(guò)繼性T細(xì)胞轉(zhuǎn)移已于惡性腫瘤療程中展現(xiàn)出顯著功效，并可對(duì)患有包括白血并 在內(nèi)各種疾病之患者發(fā)揮治療效果。通常而言，自患者身上所衍生出的T細(xì)胞經(jīng)體外工程以 表現(xiàn)為一重組T細(xì)胞(T細(xì)胞受體，TCR)，或者稱(chēng)為嵌合抗原受體(CAR)。該嵌合抗原受體一般 為衍生自一抗體的一細(xì)胞外抗原結(jié)合域以及衍生自一傳遞訊號(hào)的T細(xì)胞受體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的 一細(xì)胞內(nèi)T細(xì)胞活化域所組成。與生理學(xué)上的T細(xì)胞受體不同，嵌合抗原受體由一單一多勝 肽鏈所組成，其可通過(guò)細(xì)胞外部分與細(xì)胞內(nèi)的傳遞訊號(hào)部分所提供的一T細(xì)胞活化機(jī)構(gòu)與 抗原結(jié)合。故，因?yàn)檠苌越Y(jié)合域的該抗體緣故，經(jīng)嵌合抗原受體所修正的T細(xì)胞可無(wú)視主 要組織相容復(fù)合體(MHC)的表現(xiàn)與否獨(dú)立辨識(shí)其目標(biāo)，該目標(biāo)通常為一細(xì)胞表面抗原，且其 效果不因腫瘤細(xì)胞變體中因抗原較低或缺乏抗原而常見(jiàn)的腫瘤免疫脫逃機(jī)制所干擾。
[0003] 嵌合抗原受體近年來(lái)已受到廣泛的研究所重視，嵌合抗原受體T細(xì)胞的溶細(xì)胞能 力為過(guò)繼細(xì)胞療法的焦點(diǎn)所在。近期的癌癥治療臨床試驗(yàn)強(qiáng)調(diào)以經(jīng)嵌合抗原受體重新導(dǎo)向 的T細(xì)胞進(jìn)行過(guò)繼性療法的潛力。舉例而言，神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者經(jīng)由針對(duì)GD2神經(jīng)節(jié)糖苷 (Ganglioside)的嵌合抗原受體T細(xì)胞進(jìn)行治療后，雖然T細(xì)胞僅維持一簡(jiǎn)短期間，仍展現(xiàn)出 令人激勵(lì)的抗腫瘤效果。近一步研究證實(shí)，經(jīng)過(guò)嵌合抗原受體工程的T細(xì)胞，在受慢性與急 性淋巴性白血病所苦的患者體內(nèi)可有效激發(fā)抗腫瘤反應(yīng)。嵌合抗原受體T細(xì)胞療法與其他 抗體作為媒介的免疫療法策略不同，例如利用免疫毒素者，目前利用經(jīng)改造工程的細(xì)胞，而 非使用單一分子。
[0004] 近年來(lái)，業(yè)界對(duì)于嵌合抗原受體的最佳化設(shè)計(jì)已投入諸多心力，可參照如 Bridgeman J.S.，et al.所著內(nèi)容（Curr Gene Ther 2010，10,77-90)。然而，目前仍有許多 挑戰(zhàn)，更具體的，關(guān)于更有效的抗腫瘤反應(yīng)與延長(zhǎng)T細(xì)胞存活周期以使該經(jīng)工程改造的T細(xì) 胞于體內(nèi)具有更長(zhǎng)持久性的必要性。另外，于臨床實(shí)施中維持Τ細(xì)胞持久性以及活性所需要 的共激訊號(hào)仍需要加以辨識(shí)。所以仍須進(jìn)一步努力，以達(dá)成適用于包括過(guò)繼性免疫療法在 內(nèi)的各種療法的最理想嵌合抗原受體。
[0005] 于 1999年，Hombach A.，et al ·的著作（Immunotherapy, 1999,22(6) ,473-480)描 述一嵌合T細(xì)胞受體，其具體用于與CD30抗原相關(guān)聯(lián)的何杰金氏淋巴癌（Hodgkin ' s Lymphoma)中。于此已確認(rèn)，該嵌合受體的特定交聯(lián)會(huì)誘發(fā)非限制性主要組織相容復(fù)合體的 細(xì)胞毒性，其作用于CD30+目標(biāo)細(xì)胞，但不會(huì)作用于CD3(T細(xì)胞。由于CD30不僅會(huì)通過(guò)腫瘤細(xì) 胞表現(xiàn)，也會(huì)借助正?；罨腂細(xì)胞表現(xiàn)，故以往并未利用CD30作為目標(biāo)。此假設(shè)受Savoldo et al.的報(bào)告(Blood,2007,110(7) ,2620-2630)所支持，其表示嵌合抗原受體T細(xì)胞表現(xiàn)出 良性B細(xì)胞類(lèi)的類(lèi)淋巴細(xì)胞株(LCL cell lines)的細(xì)胞溶解增加。此處所使用的嵌合抗原 受體為一"第一代"嵌合抗原受體，其中不具有細(xì)胞內(nèi)CD28結(jié)構(gòu)域(CD28domain)。
[0006] Hombach A.et al ·的著作（Gene Therapy ,2010,17,1206-1213)描述細(xì)胞外嵌合 抗原受體部分中對(duì)IgGIFc間隔域(spacer domain)的改造作用，以避免由具有Fc受體的細(xì) 胞所引起的非目標(biāo)活性化以及意外引發(fā)的先天性免疫反應(yīng)。
[0007] Kofler的著作（2011，Mol.Ther. 19,760-767)敘述一嵌合抗原受體分子具有一 CD28胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，其與一 CD3zeta胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域以及由一抗體所衍生對(duì)CEA的scFv胞外域所結(jié) 合。其中并描述，將CD28嵌合抗原受體胞內(nèi)域中的lck結(jié)合部分去除，可于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (Treg cells)存在的情況下改善經(jīng)重新導(dǎo)向的抗腫瘤活性，且不會(huì)損害干擾素伽瑪 (interferon gamma)的分泌、增殖與細(xì)胞溶解。據(jù)推測(cè)具有經(jīng)改造⑶28胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的該嵌 合抗原受體可加快對(duì)于患有各種可大量受調(diào)節(jié)性T細(xì)胞所滲入的癌癥患者體內(nèi)實(shí)施過(guò)繼性 T細(xì)胞療法。
[0008]另外，Hombach et al.對(duì)于利用具嵌合抗原受體重新導(dǎo)向的T細(xì)胞過(guò)繼性療法提 供簡(jiǎn)要說(shuō)明（Current Molecular Medicine,2013，13(1) ,1-10)，其中，嵌合抗原受體效果 經(jīng)表示具有共激活性，以及可改善并延長(zhǎng)經(jīng)重新導(dǎo)向的抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)。除此之外，此種 過(guò)繼性療法的不利反應(yīng)經(jīng)描述包括"細(xì)胞因子風(fēng)暴"以及"T細(xì)胞抑制"。
[0009] 表現(xiàn)出嵌合抗原受體T細(xì)胞于過(guò)繼性療法中除了有益效果外，一具有不利的副作 用，目前已知會(huì)阻礙上述各種療效的理想發(fā)展。如引證文件所述，嵌合抗原受體的發(fā)展催生 出第二代及第三代嵌合抗原受體，其具有一或二共激訊號(hào)域，且亦試圖克服相同的問(wèn)題。然 而，以嵌合抗原受體為基礎(chǔ)的過(guò)繼性療法仍存在另一項(xiàng)問(wèn)題，亦即經(jīng)改造工程表現(xiàn)出嵌合 抗原受體的T細(xì)胞并無(wú)法區(qū)分惡性癌細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)與健康細(xì)胞(非腫瘤細(xì)胞）。故，針對(duì)癌 癥的嵌合抗原受體T細(xì)胞療法所存在的主要問(wèn)題，為要將對(duì)于健康組織造成的副作用減至 最小。由于抗腫瘤效果必須長(zhǎng)期存在嵌合抗原受體T細(xì)胞，所以目前亟欲改善嵌合抗原受體 T細(xì)胞的持久性、存活度與增殖性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 于一方面，本發(fā)明關(guān)于一種T細(xì)胞，其具有一嵌合抗原受體，以用于過(guò)繼性細(xì)胞療 法以治療體內(nèi)患有⑶30+癌癥的個(gè)體，包括⑶30+白血病或⑶30+淋巴癌，借以使嵌合抗原受 體自N端(N-1 erm i nus)至C端(C_ t erm i nus)具有下列結(jié)構(gòu)域：
[0011] 一抗CD30單鏈抗體域，更具體的，SEQ ID No.2的HRS3-scFv或其一同源物，其可特 定結(jié)合于與SEQ ID No.2具有至少70%辨識(shí)度的CD30;
[0012] -間隔域（spacer domain);
[0013] 一穿膜域（transmembrane domain);以及
[0014] -細(xì)胞衆(zhòng)訊號(hào)傳遞域（cytoplasmatic signalling domain);
[0015] 其特征在于該具有嵌合抗原受體的T細(xì)胞對(duì)于CD30+癌細(xì)胞具有毒性，更具體的， 對(duì)于CD30+白血病細(xì)胞或CD30+淋巴癌瘤具有毒性，但對(duì)于該個(gè)體體內(nèi)的CD30+非腫瘤(健康） 細(xì)胞則不具有毒性。
[0016] 更具體的，本發(fā)明關(guān)于一種T細(xì)胞，其表現(xiàn)出嵌合抗原受體，該抗原受體為SEQ. ID No. 3的一多勝肽，受Seq. ID. No. 4的一核酸或一其同源物所編碼。
[0017] 進(jìn)一步方面，本發(fā)明關(guān)于利用本發(fā)明所揭露該具有嵌合抗原受體的T細(xì)胞以治療 患有⑶30+癌癥而需要治療的個(gè)體。更具體的，該⑶30+癌癥為何杰金氏淋巴癌(Hodgkin ' S Lymphoma)、間變性大細(xì)胞淋巴癌(anaplastic large cell lymphoma)、急性淋巴性白血病 (acute lymphocytic leukaemia)、皮膚淋巴癌（cutaneous lymphoma)、蕈樣霉菌病 (mycosis fungoides)、塞札里淋巴癌（S6zary lymphoma)、淋巴增生性疾病 (lymphoproliferative diseases)、全身性肥大細(xì)胞增生癥（systemic mastocytosis)、畸 胎癌（teratocarcinoma)、干細(xì)胞衍生性惡性腫瘤（stem cell derived malignancies)、癌 干細(xì)胞(cancer stem cells)與其他癌癥中的任一者。
[0018] 再者，本發(fā)明關(guān)于SEQ ID No. 3或的一種多勝肽一其同源物，其具有與SEQ ID No. 3達(dá)至少90 %的辨識(shí)度，借此，該多勝肽或其一同源物于T細(xì)胞中表現(xiàn)為一嵌合抗原受體 時(shí)，可對(duì)于CD30+癌細(xì)胞具有毒性作用，但對(duì)于CD30+非癌細(xì)胞則不具有毒性。
[0019] 此外，本發(fā)明關(guān)于一核酸分子，其可編碼出本發(fā)明所述的多勝肽，本發(fā)明亦關(guān)于一 載體，其具有該核酸序列如Seq. ID.No.4。再者，本發(fā)明提供一種細(xì)胞、細(xì)胞株或具有該核酸 序列或該載體的宿主細(xì)胞，亦提供一套件或系統(tǒng)，其含有該載體或一細(xì)胞、細(xì)胞株或具有該 載體或該核酸序列或具有該核酸分子的一宿主細(xì)胞。
[0020] 最后，本發(fā)明關(guān)于利用本發(fā)明所揭露的嵌合抗原受體已改善任何經(jīng)基因工程改造 的免疫細(xì)胞的持久性與放大作用，該免疫細(xì)胞尤指表現(xiàn)該嵌合抗原受體的淋巴細(xì)胞。此外， 本發(fā)明關(guān)于使用HRS3SCFV勝肽或可編碼出相同勝肽的核酸，當(dāng)該勝肽融合于任何受基因工 程改造林巴細(xì)胞所特定表現(xiàn)的一嵌合抗原受體時(shí)，用以改善任何可表現(xiàn)該勝肽的基因工程 改造淋巴細(xì)胞的持久性及放大作用的用途。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1是帶有Seq. ID.No.3的嵌合抗原受體#1138的模組化組成，其由一Seq. ID.No.4 核酸所編碼。
[0022] 圖2是經(jīng)工程改造的人類(lèi)T細(xì)胞，其表現(xiàn)出該嵌合抗原受體#1138,人類(lèi)周邊T細(xì)胞 經(jīng)由一健康捐贈(zèng)者的血液中分離出來(lái)，并借助載體#1138的轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒工程，于12 小時(shí)后，細(xì)胞以雙色流式細(xì)胞分選儀(FACS)，根據(jù)S0P_tumorgenetics_FACS利用PE標(biāo)記的 多株山羊人類(lèi)IgG Fc抗體（PE-labelled polyclonal goat anti-human IgG Fc antibody)以及FITC標(biāo)記鼠科抗人類(lèi)CD3單株抗體UCHT1進(jìn)行檢測(cè)#1138嵌合抗原受體的表 現(xiàn)。
[0023] 圖3是工程改造的T細(xì)胞消除CD30+淋巴瘤細(xì)胞以及降少⑶34+CD30+造血干細(xì)胞 (hematopoetic stem cells)。具有嵌合抗原受體#1138的T細(xì)胞，具嵌合抗原受體#1138的T 細(xì)胞、于shame轉(zhuǎn)導(dǎo)后不具有嵌合抗原受體的T細(xì)胞(!'-〇6118#1138]16831:;^6)以及未經(jīng)修改 的T細(xì)胞(w/o)與同種異體的CD34+造血干細(xì)胞進(jìn)行共同培養(yǎng)，以受誘發(fā)表現(xiàn)CD30,以及與 CFSE標(biāo)記My la CD30+細(xì)胞共同培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞經(jīng)抗CD34PE單株抗體(mAb) AC136 (20μ1)染 色，加入計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)（counting standard) (δμL/test)以及7AAD(5yl/test)，并將細(xì)胞以流式 細(xì)胞分選儀將計(jì)數(shù)設(shè)定于lOOOevents的標(biāo)準(zhǔn)微珠進(jìn)行分析。進(jìn)行三重復(fù)檢測(cè)，并測(cè)定目標(biāo) 細(xì)胞的總數(shù)量。
[0024] 圖4是分別為具有與非具有#1138嵌合抗原受體的細(xì)胞，與同種異體的CD34+造血 干細(xì)胞進(jìn)行共同培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)抗⑶34PE單株抗體(mAb) AC136 (20μ1)染色，加入計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn) (counting standard) (δμL/test)以及7AAD(5yl/test)，并將細(xì)胞以流式細(xì)胞分選儀將計(jì) 數(shù)設(shè)定于lOOOevents的標(biāo)準(zhǔn)微珠進(jìn)行分析。各目標(biāo)族群中的死亡細(xì)胞(7-AAD+)數(shù)量經(jīng)測(cè)定 并利用下列公式顯示為總目標(biāo)細(xì)胞中的死亡細(xì)胞百分比：死亡細(xì)胞百分比= (7-AAD+目標(biāo) 細(xì)胞數(shù)量/總目標(biāo)細(xì)胞數(shù)量)*1〇〇,完成三重復(fù)檢測(cè)。
[0025] 圖5是擬人化SCID小鼠周邊血液中具有抗CD30嵌合抗原受體T細(xì)胞#1138的情況下 所留存的CD30+T細(xì)胞及B細(xì)胞。SCID小鼠受移植有人類(lèi)造血系統(tǒng)，以使其周邊血液中具有B 細(xì)胞與T細(xì)胞。于第0日時(shí)，來(lái)自同一捐贈(zèng)者并受#1138嵌合抗原受體工程改造的人類(lèi)T細(xì)胞， 借助靜脈注射進(jìn)行轉(zhuǎn)移輸入。于利用抗CD30嵌合抗原受體T細(xì)胞#1138治療前第5日以及治 療50日后，以流式細(xì)胞儀紀(jì)錄周邊血液中的⑶30+CD4+T細(xì)胞(A)以及⑶30+⑶19+B細(xì)胞(B)。 [0026]圖6是具有抗CD30嵌合抗原受體#1138的T細(xì)胞于試管培養(yǎng)中的理想累積情況，周 邊血液淋巴細(xì)胞以各嵌合抗原受體進(jìn)行移植。于轉(zhuǎn)導(dǎo)后，細(xì)胞在Xviv〇15培養(yǎng)基中輔以10% FCS及IL-2 (500U/ml)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基每周更換一次，并每三日添加一次IL-2。于開(kāi)始培養(yǎng) 后，將CD3+T細(xì)胞經(jīng)利用FITC共輒抗小鼠及PE共輒抗人類(lèi)IgGIFc抗體于指定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行紀(jì) 錄其嵌合抗原受體表現(xiàn)。
[0027]圖7中的圖7a顯示實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖，圖7b顯示由本發(fā)明抗CD30嵌合抗原受體T細(xì)胞 導(dǎo)致自體B細(xì)胞的目標(biāo)細(xì)胞的胞溶情況。
【具體實(shí)施方式】
[0028]發(fā)明人的目標(biāo)提供經(jīng)基因改造以具有嵌合抗原受體(CAR)的T細(xì)胞，借以使T細(xì)胞 對(duì)于個(gè)體內(nèi)的CD30+癌細(xì)胞可產(chǎn)生毒性活化，而對(duì)CD30+非癌細(xì)胞則不具有毒性。亦即，于一 方面，本發(fā)明關(guān)于具有一嵌合抗原受體的T細(xì)胞，用于過(guò)繼性細(xì)胞療法中以治療個(gè)體所患的 CD30+癌癥，尤指⑶30+淋巴癌或⑶30+白血病，借此，該嵌合抗原受體自其N(xiāo)端(N-terminus) 至C端(C-terminus)至少具有下列結(jié)構(gòu)域 :一抗⑶30單鏈抗體域，更具體的，SEQIDNo.2的 HRS3-scFv或其一同源物，其可特定結(jié)合于與SEQ ID如.2具有至少70%辨識(shí)度的0)30;選 擇性一間隔域（spacer domain); -穿膜域（transmembrane domain);以及一細(xì)胞衆(zhòng)訊號(hào)傳 遞域(cytoplasmatic signalling domain);其特征在于該具有嵌合抗原受體的T細(xì)胞對(duì)于 CD30+癌細(xì)胞具有毒性，更具體的，對(duì)于CD30+白血病細(xì)胞或CD30+淋巴癌瘤具有毒性，但對(duì)于 該個(gè)體體內(nèi)的CD30+非腫瘤(健康)細(xì)胞則不具有毒性。
[0029] 于此連結(jié)關(guān)系中，"⑶30+癌細(xì)胞"一詞指表現(xiàn)出⑶30分子的惡性細(xì)胞或瘤細(xì)胞。 [0030]再者，"⑶30+非腫瘤細(xì)胞"一詞指表現(xiàn)出⑶30分子的良性(健康)細(xì)胞，例如活化的 T細(xì)胞、B細(xì)胞或干細(xì)胞。
[0031] 除非特別定義，否則"非腫瘤細(xì)胞"與"腫瘤細(xì)胞"等詞可分別與"非癌細(xì)胞"與"癌 細(xì)胞"等詞交互使用。
[0032] 于此所述，"包含"或"含有"以及"具有"或"擁有"表示"有…成分"或"由…組成"的 實(shí)施例。
[0033] 于此所述，"同源物"一詞指分子，可為DNA或多勝肽，其具有一既定量的序列相似 度，至少達(dá)70%，例如至少達(dá)其80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的核酸序列或胺基 酸序列。同源指兩序列的辨識(shí)規(guī)模，同源序列具有相同或相似特性，更具體的，具有相同或 相似的序列辨識(shí)度。舉例而言，Seq . ID . No . 2的HRS3scFV序列，其對(duì)于CD30分子具有與 HRS3scFV分子相同或相似的結(jié)合特定性。再者，同源物包括核酸分子，其可編碼出相同勝 肽，但可能因基因碼的簡(jiǎn)并性(degeneracy)而使序列有所變化。再者，辨識(shí)度指具有相同胺 基酸或核酸分子排列于序列中的順序，亦即，就至少90%辨識(shí)度的情況下，有90%以上的核 酸或胺基酸分子分別位于相同位置上。除非另外特別定義，否則"同源"與"同辨識(shí)度"于此 可交互使用。于一實(shí)施例中，所述同源物為SEQ ID No.2的HRS3scFv勝肽的同源物，其特定 結(jié)合于由SEQ ID No.2的勝肽所辨認(rèn)的相同抗原決定位(epitope)。
[0034] 另外，"經(jīng)基因工程改造"一詞指細(xì)胞借助基因工程加以控制，亦即細(xì)胞具有并非 原本出現(xiàn)在該等細(xì)胞內(nèi)的異種序列。典型地，異種序列通過(guò)一載體系統(tǒng)導(dǎo)入，或通過(guò)其他手 段將核酸分子導(dǎo)入包含脂質(zhì)體在內(nèi)的細(xì)胞中。異種核酸分子可經(jīng)融合至該等細(xì)胞的基因組 中，或可表現(xiàn)于染色體外，例如以質(zhì)體的型態(tài)表現(xiàn)。此用詞亦包含將經(jīng)基因工程改造并分離 的嵌合抗原受體多勝肽導(dǎo)入細(xì)胞中的實(shí)施例。
[0035] 一般而言，嵌合抗原受體為融合蛋白，由細(xì)胞外抗體類(lèi)的辨識(shí)域融合于細(xì)胞內(nèi)T細(xì) 胞訊號(hào)傳遞蛋白質(zhì)所組成。典型地，具有抗原辨識(shí)域的胞外域包含一訊號(hào)勝肽以及一抗原 辨識(shí)單元。根據(jù)本發(fā)明，該胞外域含有一抗CD30單鏈結(jié)構(gòu)域，較佳者，該單鏈結(jié)構(gòu)域?yàn)檫x自 SEQ.ID.No.2的HRS3scFv或其同源物的單鏈結(jié)構(gòu)域，其特定結(jié)合于具有與SEQIDNo.2達(dá)至 少70 %辨識(shí)度的⑶30。再者，該單鏈結(jié)構(gòu)域可衍生自其他抗⑶30抗體如HRS4或Ki-4。該等抗 體對(duì)于CD30具有與HRS3相同的結(jié)合特定性，亦即結(jié)合至CD30的相同抗原決定位(epitope)。 [0036]該胞外域可借助一間隔域與該穿膜域相互間隔，該選擇性具有的間隔域?qū)⒖乖Y(jié) 合域與穿膜域連結(jié)，較佳者，該穿膜域具有足夠彈性使該抗原結(jié)合域朝向不同方向以利抗 原辨識(shí)。
[0037] 該穿膜域一般為跨越細(xì)胞膜的一疏水性阿法螺旋(hydrophobic alpha helix)， 亦可利用其他穿膜域。最后，該胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域代表嵌合抗原受體細(xì)胞衆(zhòng)(cytoplasmic)部分中 的訊號(hào)傳遞域。
[0038]于此可認(rèn)定具有如前所述嵌合抗原受體的T細(xì)胞，亦即具有自N端至C端具有下列 要素的嵌合抗原受體:一抗CD30單鏈抗體域，其可選擇性為一間隔域、一穿膜域、一細(xì)胞漿 域，可區(qū)別于CD30+癌細(xì)胞以及CD30+非癌細(xì)胞之間以表現(xiàn)毒素活動(dòng)。故，本發(fā)明所揭露的T細(xì) 胞克服了細(xì)胞毒化作用會(huì)同時(shí)影響CD30+癌細(xì)胞與CD30+非癌細(xì)胞技術(shù)的問(wèn)題，如相關(guān)技術(shù) 中所述。
[0039] 于本發(fā)明一實(shí)施例中，該嵌合抗原受體具有一開(kāi)端序列（leader sequence)，位于 N端至抗⑶30單鏈抗體域。
[0040]另外，于一實(shí)施例中，該抗CD30單鏈抗體域?yàn)橐籋RS3scFv勝肽，更具體的，其屬于 SEQ. ID. No. 2。于此可認(rèn)定，變異域(scFv)的一抗CD30單鏈抗體片段，更具體的屬于HRS3，可 表現(xiàn)出理想的活性，亦即對(duì)于CD30+癌細(xì)胞產(chǎn)生毒性，但對(duì)CD30+非癌細(xì)胞則無(wú)毒性。
[0041 ] 于另一實(shí)施例中，該嵌合抗原受體分子的間隔域?yàn)镾EQ. ID . No . 5的一 1861鉸鏈 CH2CH3域或其同源物，其具有至少達(dá)70%的可辨識(shí)度，間隔域?yàn)镾EQ. ID .No. 5的突變1861鉸 鏈 CH2CH3 域。
[0042] 于某些實(shí)施例中，該間隔域與穿膜域之間可設(shè)有一連結(jié)體(linker)。舉例而言，于 Seq. ID.No.3的嵌合抗原受體中，一4胺基酸連結(jié)體設(shè)置于間隔域與穿膜域之間。
[0043] 再者，另一實(shí)施例關(guān)于一具有嵌合抗原受體的T細(xì)胞，其中該穿膜域衍生自CD28分 子，例如該⑶28分子的穿膜域缺少SEQ.ID.No.6的lck域(lckdomain)。
[0044]訊號(hào)傳遞域或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域等可于此交互替換，其含有一⑶3zeta 或FcEpsilon受體(IgE受體)珈瑪鏈訊號(hào)傳遞鏈或一共激域。舉例而言，該細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?yàn)?SEQ. ID.No.7的一⑶3zeta訊號(hào)傳遞域或其同源物，其具有至少70%之同源性。于另一實(shí)施 例中，該細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?yàn)镾EQ. ID ·Νο· 8的Fc epsilon受體加碼訊號(hào)傳遞域(Fc epsilon receptor gamma signalling domain)或其一同源物，其具有至少70%的辨識(shí)度。該訊號(hào)傳 遞域分別負(fù)責(zé)T細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用活化或T細(xì)胞的干擾素伽瑪(interferon-ga_a)分泌。 [0045]該嵌合抗原受體分子可為一所謂的"第二代"嵌合抗原受體分子。第二代嵌合抗原 受體分子具有經(jīng)改良的訊號(hào)傳遞域，其額外具有一第二訊號(hào)傳遞域，例如衍生自CD28、 CD134(0X40)或CD137(4-1BB)。"第三代"嵌合抗原受體分子具有一經(jīng)結(jié)合的共激訊號(hào)傳遞 域，例如⑶28與⑶137或⑶134結(jié)合。
[0046] -篇關(guān)于嵌合抗原受體分子的概論由Gi lham D . E . et所提供（Molecular Medicine,2012,18(7),377-384)。
[0047]于本發(fā)明一較佳實(shí)施例中，該T細(xì)胞為一具有一嵌合抗原受體的T細(xì)胞，其中該嵌 合抗原受體為SEQ. ID.No.3的一多勝肽。該嵌合抗原受體于此亦指#1138。
[0048]該抗CD30嵌合抗原受體#1138細(xì)表現(xiàn)于T細(xì)胞表面，并構(gòu)成于變異區(qū)域(scFv)抗體 抗HRS3⑶30單鏈片段的胞外部分以及經(jīng)修改的人類(lèi)IgGlCH2CH3結(jié)構(gòu)域，并于scFv及穿膜域 之間具有一間隔。該IgGl結(jié)構(gòu)域的修改作業(yè)包括點(diǎn)突變，以將野生型(wild-type)胺基酸序 列PELLGGPXl3MISRT(Seq·ID·No·9)轉(zhuǎn)換為PPVA-GPXl3MIART(Seq·ID·No·10)，其可減少嵌 合抗原受體Fc結(jié)構(gòu)域意外結(jié)合其他細(xì)胞如原生免疫細(xì)胞的Fc受體，此情形可能意外影響其 活化作用以及嵌合抗原受體T細(xì)胞的活化作用。嵌合抗原受體#1138的穿膜與近細(xì)胞內(nèi)膜部 分衍生自人類(lèi)⑶28,并融合于人類(lèi)⑶3zeta的細(xì)胞內(nèi)部分。該⑶28序列突變于P560>A560、 P563>A563、P564>A564(Kofler et al ·，Mol · Ther· 19，760-767(2011))。因此，lck激化酶的 CD28結(jié)合部位受該序列所破壞，lck訊號(hào)傳遞途徑與后續(xù)受嵌合抗原受體所影響的IL-2分 泌受到阻止。前臨床模型指出，可于此等條件之下降低調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg cells)影響嵌合 抗原受體T細(xì)胞效應(yīng)功能的抑制作用
[0049] 如范例中所示，T細(xì)胞(CD4+或D8+T細(xì)胞）于⑶30+細(xì)胞上的運(yùn)作不同，CD30+癌細(xì)胞 經(jīng)殺死，而CD30+非癌細(xì)胞則與具有#1138嵌合抗原受體的T細(xì)胞繼續(xù)留存。
[0050] 如一范例，表現(xiàn)該#1138嵌合抗原受體的T細(xì)胞對(duì)于健康的人類(lèi)⑶30+CD34+造血干 細(xì)胞并不具有毒性，而CD30+淋巴瘤細(xì)胞則會(huì)被消滅。
[0051] 再者，如范例中所示，本發(fā)明具有1138嵌合抗原受體的T細(xì)胞于鼠類(lèi)模式中對(duì)健康 的人類(lèi)B細(xì)胞與T細(xì)胞不會(huì)表現(xiàn)出毒素活性，對(duì)于自體移植的健康細(xì)胞并無(wú)顯著的自我免疫 活動(dòng)，亦無(wú)不利副作用發(fā)生。此外，對(duì)于病原體的淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)并未有所變化，仍可對(duì) 于受測(cè)病原體發(fā)揮細(xì)胞免疫保護(hù)作用。
[0052] 于另一方面，本發(fā)明關(guān)于本發(fā)明中具有一嵌合抗原受體的T細(xì)胞于試應(yīng)性細(xì)胞療 法以對(duì)一個(gè)體進(jìn)行CD30+癌癥治療的用途。舉例而言，該CD30+癌癥可為何杰金氏淋巴癌 (Hodgkin's Lymphoma)、間變性大細(xì)胞淋巴癌（anaplastic large cell lymphoma)、急性 淋巴性白血病（acute lymphocytic leukaemia)、皮膚淋巴癌（cutaneous lymphoma)、蕈樣 霉菌病(mycosis fungoides)、淋巴增生性疾病（lymphoproliferative diseases)、全身性 肥大細(xì)胞增生癥（systemic mastocytosis)、畸胎癌（teratocarcinoma)、干細(xì)胞衍生性惡 性腫瘤（stem cell derived malignancies)、癌干細(xì)胞（cancer stem cells)與其他癌癥。
[0053]亦即，本發(fā)明所揭露具有嵌合抗原受體的T細(xì)胞可令人訝異地在不傷害個(gè)體內(nèi)非 癌癥CD30+細(xì)胞的情形下治療個(gè)體的CD30+癌癥。與先前對(duì)于各種具不同抗原結(jié)合域的嵌合 抗原受體觀測(cè)結(jié)果相反，該抗CD30抗體域可消滅惡性CD30+細(xì)胞并且不影響良性CD30+細(xì)胞。 [0054]于另一方面，本發(fā)明關(guān)于SEQ. ID.No. 3的多勝肽，其于此代表#1138所指的嵌合抗 原受體多勝肽，或其一同源物，其可達(dá)至少90%的辨識(shí)度，借此，該多勝肽或其同源物于T細(xì) 胞中表現(xiàn)為一嵌合抗原受體，其可于CD30+癌細(xì)胞上表現(xiàn)毒性作用，而對(duì)于CD30+非癌細(xì)胞則 不具有毒性。舉例而言，該SEQ. ID. No. 3的多勝肽由Seq. ID. No. 4的核酸序列所編碼。
[0055]該多勝肽的組成包括抗CD30抗體的HRS3-scFV單鏈結(jié)構(gòu)域;一間隔域，其為突變的 IgGl鉸鏈CH2CH3結(jié)構(gòu)域;一穿膜域，其衍生自⑶28，更具體的，由一⑶28衍生的穿膜域，其缺 少lck結(jié)構(gòu)域；以及⑶3zeta的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。
[0056] 另外，本發(fā)明提供核酸分子，包括用以編碼出本發(fā)明多勝肽的核酸序列。再者，亦 提供載體，其包含本發(fā)明所述用以編碼該多勝肽的核酸序列。精通技藝者可了解適用的載 體系統(tǒng)及載體，更具體的，為可達(dá)成真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)導(dǎo)，更具體的，該真核細(xì)胞為T(mén)細(xì) 胞。
[0057] 再者，本發(fā)明提供一細(xì)胞、細(xì)胞株或具有本發(fā)明所揭露該載體或本發(fā)明所揭露一 核酸分子的宿主細(xì)胞。較佳者，該細(xì)胞、細(xì)胞株或宿主細(xì)胞為一 T細(xì)胞，例如一 CD4+T細(xì)胞或 一 CD8+T 細(xì)胞。
[0058] 另外，本發(fā)明提供一套件或系統(tǒng)，其含有本發(fā)明所揭露該載體、本發(fā)明所揭露該細(xì) 胞或宿主細(xì)胞，或本發(fā)明所揭露該多勝肽或本發(fā)明所揭露一核酸分子或其組合，用以制造 表現(xiàn)該嵌合抗原受體的T細(xì)胞。本發(fā)明所揭露該套件或系統(tǒng)可進(jìn)一步含有其他組成，包含將 該載體或核酸分子上的多勝肽導(dǎo)入該等細(xì)胞的手段。精通技藝者可了解達(dá)成該目的的適用 手段。
[0059] 再者，本發(fā)明關(guān)于一于此所述的嵌合抗原受體，用以改善可表現(xiàn)該嵌合抗原受體# 1138或其同源物的任何經(jīng)基因工程改造的淋巴細(xì)胞的持久性及增殖性。亦即，本發(fā)明令人 訝異地發(fā)現(xiàn)與其他多種嵌合抗原受體不同，本發(fā)明所揭露的嵌合抗原受體#1138可對(duì)該經(jīng) 基因工程改造的淋巴細(xì)胞提供經(jīng)改良的持久性與放大作用，如范例中所示。所以，可克服現(xiàn) 今已知的嵌合抗原受體T細(xì)胞所具有的臨床相關(guān)缺點(diǎn)，亦即個(gè)體內(nèi)經(jīng)工程改造的T細(xì)胞的持 久性太短，以及經(jīng)工程改造的T細(xì)胞的數(shù)量驟降等問(wèn)題。
[0060] 最后，本發(fā)明提供一 HRS3SCFV勝肽，以及其同源物，其于受HRS3的scFv所辨識(shí)的抗 原決定位(epitope)方面具有相同特質(zhì)。亦即，例如抗體HRS4及Ki-4結(jié)合于相同的抗原決定 位。故，HRS4的scFv以及Ki-4的scFv于此發(fā)明中相似地具有相同活性。另外，亦提供可編碼 出所述勝肽的核酸序列。該等勝肽及核酸當(dāng)該scFv勝肽為一嵌合受體或經(jīng)融合于由經(jīng)基因 工程改造的淋巴細(xì)胞所特定表現(xiàn)出的一嵌合抗原受體的一部分時(shí)，適用于改善任何經(jīng)基因 工程改造的淋巴細(xì)胞的持久性與放大作用。亦即，舉例而言，將HRS3scFv勝肽，例如由 Seq.ID.No.l序列所編碼的SEQ ID No.2的HRS3scFV勝肽，與一額外具有一不同抗原結(jié)合特 定性的嵌合抗原受體相互結(jié)合，可改善該經(jīng)工程改造淋巴細(xì)胞的持久性與放大作用。
[0061] 本發(fā)明進(jìn)一步利用不同范例敘述，該等范例用以進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非用以限 定本
【發(fā)明內(nèi)容】
。
[0062] 范例
[0063] 制備檢測(cè)物件
[0064]用于#1138嵌合抗原受體的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體編碼，根據(jù)SOP-GL-VectProd利用一長(zhǎng) 臂猿白血病病毒假性外套膜(Galv pseudotyped envelope)所制造。簡(jiǎn)要而言，載體微粒制 作以Polyfect?為媒介的DNA轉(zhuǎn)染后于人類(lèi)胚胎腎細(xì)胞株293T上瞬時(shí)制成。載體微利以長(zhǎng)臂 猿白血病病毒(Galv)假性處理。并無(wú)測(cè)定到載體滴度(vector titer)。
[0065] 人類(lèi)血液淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)（Cheadle，E.J.，et al.，Chi meric antigen receptors f or T~ce 11 based therapy. Chapter 36，in :''Antibody engineering:methods and protocols"，2nd Edition,Ed.P.Chames，Meth.Mol.Biol·907， 645-666(2012)，doi :10.1007/978-1-61779-974-7_36)所完成。簡(jiǎn)要而言，人類(lèi)淋巴細(xì)胞以 經(jīng)轉(zhuǎn)染二日的293T細(xì)胞的二日浮質(zhì)（supernatant)所轉(zhuǎn)導(dǎo)。該嵌合抗原受體#1138由20-35%的人類(lèi)T細(xì)胞所表現(xiàn)，其于第二日以流式細(xì)胞儀(flow cytometry)利用受引導(dǎo)至該抗 原嵌合受體細(xì)胞外IgGlCH2CH3結(jié)構(gòu)域的一抗體所測(cè)得。與抗原嵌合受體#1175的比較，參照 Hombach A，et al.所著內(nèi)容（Gene Ther.20100ct;17(10):1206-13.doi:10.1038/ gt.2010.91.Epub 2010Jun 17)，其以相同程序測(cè)得表現(xiàn)于^^(^的人類(lèi)了細(xì)胞上。
[0066]于細(xì)胞表面表現(xiàn)該嵌合抗原受體#1138的CD4+CD8+T細(xì)胞可利用特定節(jié)于于嵌合抗 原受體HRS3scFv結(jié)構(gòu)域的9G10抗體進(jìn)行記錄。經(jīng)該#1138嵌合抗原受體工程改造的1'細(xì)胞會(huì) 特定結(jié)合于表現(xiàn)出CD30的細(xì)胞并且變得活性化，該活性化現(xiàn)象表現(xiàn)于包括IFN-γ在內(nèi)的細(xì) 胞素借助增殖量以及于CD30+目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)的胞溶作用提升而增加分泌。值得注意的是，當(dāng)T 細(xì)胞受嵌合抗原受體#1138所刺激時(shí)，僅出現(xiàn)IL-2的背景濃度分泌。然而，當(dāng)T細(xì)胞受其生理 性T細(xì)胞受體及CD28刺激時(shí)，分泌出生理作用量的IL-2。T細(xì)胞# 1138的活性化作用針對(duì)特定 抗原，如該嵌合抗原受體的特定性所界定，因?yàn)镃D3(T細(xì)胞并不會(huì)驅(qū)動(dòng)T細(xì)胞的活化?？扇苄?⑶30累積于⑶30+淋巴癌患者血清中，其并不會(huì)阻礙于以嵌合抗原受體為媒介于lOμg/ml濃 度中的T細(xì)胞活化作用（Hombach A，et al.，Cancer Res.l998Mar 15;58(6):1116_9)。此原 因在于該嵌合抗原受體必須借助結(jié)合目標(biāo)抗原的多數(shù)相同目標(biāo)抗原以驅(qū)使T細(xì)胞活化，借 此進(jìn)行交聯(lián)，而此作用僅能發(fā)生于當(dāng)CD30于表面受到固定，或經(jīng)表現(xiàn)在目標(biāo)細(xì)胞表面時(shí)，但 當(dāng)⑶30蛋白質(zhì)呈現(xiàn)于溶液中時(shí)無(wú)法發(fā)生。
[0067]范例1:經(jīng)嵌合抗原受體#1138修改的Τ細(xì)胞對(duì)于CD30+腫瘤以及健康細(xì)胞的作用 [0068]將Τ細(xì)胞施以嵌合抗原受體#1138的修改工程
[0069] 具有#1138嵌合抗原受體的人類(lèi)周邊Τ細(xì)胞的移植，于轉(zhuǎn)導(dǎo)12小時(shí)后經(jīng)由雙色流式 細(xì)胞儀進(jìn)行評(píng)估，圖2顯示經(jīng)嵌合抗原受體工程的Τ細(xì)胞點(diǎn)墨分析(dot blot analysis)，表 現(xiàn)#1138嵌合抗原受體T細(xì)胞的數(shù)量為所有T細(xì)胞中的16.5%。
[0070] 具嵌合抗原受體#1138的T細(xì)胞以及受控制T細(xì)胞的純化作業(yè)
[0071] T細(xì)胞#1138經(jīng)培養(yǎng)60小時(shí)，并以抗人類(lèi)IgG-Fc-FITC以及抗anti-CD3-PE抗體標(biāo) 記，前者為結(jié)合嵌合抗原受體的抗體，后者可辨識(shí)T細(xì)胞，再利用FACSAria III細(xì)胞分選儀 進(jìn)行分選。Gate經(jīng)設(shè)定為⑶3+嵌合抗原受體#1138+以及⑶3+嵌合抗原受體#1138_的1~細(xì)胞。 經(jīng)分選細(xì)胞的各分裝(aliquot)以FACS進(jìn)行再分析。CD3+#1138+以及CD3+#1138-T細(xì)胞的純 度分別為94.4 %及99.6%。
[0072] 同種異體⑶34+造血干細(xì)胞的分離作業(yè)
[0073] CD34+細(xì)胞利用密度離心（density centrifugation)以及磁性細(xì)胞分選（MACS) GM-CSF自自愿捐贈(zèng)者周邊血液進(jìn)行分離。細(xì)胞以抗CD34TO共輒mAb進(jìn)行標(biāo)記，且經(jīng)分離 (fractionated)且未分選(unsorted)細(xì)胞的各分裝經(jīng)流式細(xì)胞分選儀(FACS)進(jìn)行分析。經(jīng) 分離的⑶34+細(xì)胞純度為94.4%。
[0074] Myla細(xì)胞的CFSE標(biāo)記
[0075] Myla細(xì)胞以1.25μΜ CFSE標(biāo)記，并與經(jīng)分離的CD34+造血干細(xì)胞混合。經(jīng)CD34-PE mAb及CFSE+Myla細(xì)胞所辨識(shí)的⑶34+細(xì)胞可經(jīng)清楚區(qū)分，且兩者群體可經(jīng)獨(dú)立分析其存活 率。
[0076] 具#1138嵌合抗原受體T細(xì)胞的重新導(dǎo)向毒素對(duì)于⑶30+淋巴癌細(xì)胞以及⑶30+CD34 +造血干細(xì)胞
[0077] ⑶30+MyLa白血癌細(xì)胞與⑶30+⑶34+健康造血干細(xì)胞以及經(jīng)抗⑶30嵌合抗原受體# 1138工程的T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，控制組則以相同的CD30+細(xì)胞與來(lái)自相同捐贈(zèng)者及細(xì)胞制備 方法的不具嵌合抗原受體T細(xì)胞(T_cells#1138negative)進(jìn)行共培養(yǎng)。
[0078]目標(biāo)細(xì)胞總數(shù)經(jīng)由流式細(xì)胞分選儀(FACS)測(cè)定，且利用計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。 CD34+CD30+造血干細(xì)胞利用單株抗CD34-PE抗體染色辨識(shí)，并缺乏CSFE標(biāo)記，其與CFSE胞計(jì) Myla細(xì)胞不同。進(jìn)行三重復(fù)檢測(cè)，資料總結(jié)于圖3中。CD34+造血干細(xì)胞的數(shù)量無(wú)論在搭配不 具嵌合抗原受體(w/o)T細(xì)胞、具嵌合抗原受體T細(xì)胞(T-cells#1138)或于轉(zhuǎn)導(dǎo)程序后缺乏 嵌合抗原受體T細(xì)胞(T- cellS#1138negative)的情況下都并未增加。與CD34+CD30+健康細(xì) 胞，由于期望中的T細(xì)胞同種異體反應(yīng)(1'-06118#1138]16831：；^6)外，再加上嵌合抗原受體丁 細(xì)胞媒介的細(xì)胞殺死作用，經(jīng)⑶30+CFSE標(biāo)計(jì)的Myla細(xì)胞實(shí)質(zhì)上有所減少。
[0079]為測(cè)定T細(xì)胞嵌合抗原受體#1138對(duì)于CD30+健康細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的毒性，死亡目 標(biāo)細(xì)胞的數(shù)量利用常用的流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定。CD34+CD30+健康細(xì)胞借助抗CD34-PE抗體辨 識(shí)，并自CFSE標(biāo)計(jì)的Myla淋巴癌細(xì)胞中進(jìn)行區(qū)分。存活與死亡的目標(biāo)細(xì)胞以7-AAD染色測(cè) 定，資料總結(jié)于圖3中。
[0080] 結(jié)論
[00811 具有抗⑶30嵌合抗原受體#1138的T細(xì)胞對(duì)于健康⑶30+⑶34+造血干細(xì)胞的毒性以 及對(duì)于目標(biāo)⑶30+淋巴癌細(xì)胞的毒性經(jīng)過(guò)測(cè)試并相互比對(duì)。來(lái)自一健康捐贈(zèng)者的T細(xì)胞經(jīng)工 程改造以表現(xiàn)出#1138嵌合抗原受體，且來(lái)自相同轉(zhuǎn)導(dǎo)批次不具嵌合抗原受體的T細(xì)胞經(jīng)由 細(xì)胞分選純化。該程序利用以比對(duì)嵌合抗原受體所媒介的特定毒性以及受該轉(zhuǎn)導(dǎo)程序本身 所誘發(fā)的任何非特定毒性。我方對(duì)于精純化T細(xì)胞#1138毒性對(duì)于CD34+同種異體造血干細(xì) 胞的反應(yīng)性進(jìn)行記錄。再者，我方并于同次測(cè)試中，借助混合不同標(biāo)記的目標(biāo)細(xì)胞，同時(shí)計(jì) 錄對(duì)于CD30+淋巴癌細(xì)胞以及對(duì)于CD30+CD34+造血干細(xì)胞的毒性。該程序可于同次測(cè)試中評(píng) 估直接毒性(direct toxicity)與間接毒性(bystander toxicity)，對(duì)于測(cè)試組與控制組 兩者的觀測(cè)時(shí)間皆為24小時(shí)。
[0082] 我方發(fā)現(xiàn)經(jīng)CFSE-labelled標(biāo)計(jì)的CD30+Myla淋巴癌細(xì)胞當(dāng)與T細(xì)胞#1138共培養(yǎng) 時(shí)，較與無(wú) #1138的Τ細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)有所下降。與此現(xiàn)象相符地，死亡Myla目標(biāo)細(xì)胞的數(shù)量與 T細(xì)胞#1138共培養(yǎng)時(shí)呈現(xiàn)實(shí)質(zhì)上增加，相反地，⑶34+健康造血干細(xì)胞與死亡⑶34+細(xì)胞的數(shù) 量皆未減少。值得注意地，雖然在⑶34+⑶30+細(xì)胞的附近區(qū)域發(fā)生T細(xì)胞#1138殺死對(duì)于⑶30 +腫瘤細(xì)胞的特定殺害情形，但我方并未觀測(cè)到對(duì)于CD34+造血干細(xì)胞的任何直接或間接毒 性。且具有嵌合抗原受體#1138的T細(xì)胞對(duì)于CD30+淋巴癌細(xì)胞表現(xiàn)出特定毒性，但并未對(duì)健 康的⑶30+CD34+造血干細(xì)胞表現(xiàn)毒性。
[0083] 范例2:經(jīng)嵌合抗原受體#1138工程改造的T細(xì)胞于鼠類(lèi)模式中對(duì)于人類(lèi)B細(xì)胞及T 細(xì)胞未出現(xiàn)毒素作用
[0084] 劑量選擇
[0085] 人類(lèi)CD34+造血干細(xì)胞由臍帶血中分離。新生Rag2-Z-common gamma chain-Z-小鼠 受移植3xl05的CD34+造血干細(xì)胞，以移植人類(lèi)造血系統(tǒng)。每只成功移植的小鼠動(dòng)物再個(gè)別以 單一靜脈注射的方式受移植2.5xl0 6的T細(xì)胞。
[0086] 動(dòng)物維持 [0087]物種：鼠類(lèi)
[0088]品系/族群:Rag2-/-c γ -Λ
[0089] 物種選擇:缺乏Τ細(xì)胞與Β細(xì)胞的小鼠樣本用以移植人類(lèi)造血系統(tǒng)；重建的造血系 統(tǒng)可近乎仿造人類(lèi)條件。
[0090] 動(dòng)物辨識(shí)
[0091] 表1
[0092]
[0093] 表1 :Α_Ε =繁殖組;m =雄性、w =雌性；1-6小鼠編號(hào) [0094] 人類(lèi)造血系統(tǒng)移植
[0095] Rag2 -/ -c γ -/ -小鼠受來(lái)自臍帶血并經(jīng)分離的人類(lèi)CD34 +造血干細(xì)胞（S0P-RepopCD34，Appendix 6)并于5周后以流式細(xì)胞儀紀(jì)錄周邊血液中的人類(lèi)CD45+及CD4+CD45+ T細(xì)胞，經(jīng)監(jiān)測(cè)成功建立成熟的人類(lèi)淋巴細(xì)胞。
[0096] 實(shí)驗(yàn)組別
[0097]該等動(dòng)物根據(jù)研究計(jì)劃分為三組測(cè)試組別，如下列所示各組。
[0098]表 2
[0100] 利用人類(lèi)造血系統(tǒng)的動(dòng)物過(guò)繼性細(xì)胞療法:利用尾部靜脈注射將具有#1138嵌合 抗原受體的⑶3+T細(xì)胞注入經(jīng)建立有自體移植人類(lèi)造血系統(tǒng)的Rag2 v_c γ 小鼠；控制組： 移植具有#1175嵌合抗原受體的⑶3+Τ細(xì)胞。
[0101] 移植人類(lèi)造血細(xì)胞于Rag2-ΛC γ -Λ小鼠
[0102] 人類(lèi)⑶34+造血干細(xì)胞移植以及后續(xù)于小鼠周邊血液中人類(lèi)造血系統(tǒng)建立成果， 于移植5周后以流式細(xì)胞儀紀(jì)錄人類(lèi)CD4+及CD45+細(xì)胞加以評(píng)估。移植于12/21小鼠中的人類(lèi) 造血系統(tǒng)由人類(lèi)CD4+CD45T細(xì)胞表現(xiàn)于周邊血液中。假性移植(Mock-engrafted)與未接受 移植的Rag2+c γ +小鼠并未具有此等細(xì)胞。A、B、C、D及E等窩小鼠各移植有相同捐贈(zèng)者的 CD34+臍帶血細(xì)胞。僅成功移植的小鼠用于過(guò)繼性治療中。
[0103] 經(jīng)工程改造的人類(lèi)T細(xì)胞所表現(xiàn)的嵌合抗原受體#1138
[0104] 人類(lèi)⑶3+T細(xì)胞(與⑶34+細(xì)胞來(lái)自同一捐贈(zèng)者)經(jīng)體外工程以表現(xiàn)⑶30特定性的嵌 合抗原受體#1138,或作為控制組CEA特定性的嵌合抗原受體#1175。嵌合抗原受體#1175具 有CEA特定性的scFv BW431/26,而非嵌合抗原受體#1138的針對(duì)CD30特定性scFv HRS3且作 為研究中的控制組。人類(lèi)CD3+T細(xì)胞嵌合抗原受體借助流式細(xì)胞儀偵測(cè)嵌合抗原受體的細(xì) 胞外人類(lèi)IgG "間隔"域以及人類(lèi)CD3的方式進(jìn)行記錄。
[0105] 經(jīng)嵌合抗原受體工程改造的T細(xì)胞以靜脈注射自體移植的造血系統(tǒng)經(jīng)轉(zhuǎn)移至對(duì)應(yīng) 的小鼠（每只小鼠給予2.5x 106個(gè)具有嵌合抗原受體T細(xì)胞）。
[0106] 具#1138嵌合抗原受體的T細(xì)胞體內(nèi)毒性
[0107] 1.周邊血液計(jì)數(shù)與體重
[0108] 測(cè)試組于觀測(cè)期間都未觀測(cè)到明顯異常狀況，淋巴細(xì)胞百分比（約70%)、單核白 血球(monocyte)(約10% )以及顆粒性白血球(granulocyte)(約20-25% )于周測(cè)試組周邊 血液的細(xì)胞區(qū)室（cellular compartment)中與未接受T細(xì)胞或接受控制組嵌合抗原受體# 1175的控制組動(dòng)物并無(wú)差異。
[0109] 具有或不具抗⑶30T細(xì)胞#1138或控制組的抗CEA T細(xì)胞#1175小鼠周邊血液中的 ⑶30+T細(xì)胞及B細(xì)胞數(shù)量，于接受T細(xì)胞療法5日前以及接受T細(xì)胞療法第7、24、22、29、36、43 及50日后，以流式細(xì)胞儀進(jìn)行記錄。
[0110] 具有T細(xì)胞#1138條件的⑶30+CD4+T細(xì)胞以及⑶30+CD19+B細(xì)胞數(shù)量，于過(guò)繼性細(xì)胞 療法后7周觀測(cè)期間與接受T細(xì)胞療法5日前的細(xì)胞數(shù)量并無(wú)差異。CD30+CD4+T細(xì)胞的數(shù)量與 接受CEA特定性T細(xì)胞#1175的控制組細(xì)胞數(shù)量相同。
[0111] 各小鼠的體重于每周進(jìn)行測(cè)定，我方于觀測(cè)期間并未記錄到各小鼠體重產(chǎn)生任何 實(shí)質(zhì)變化。再者，受實(shí)驗(yàn)的各組別間亦無(wú)記錄到任何變化。
[0112] 2.嵌合抗原受體#1138的試管中刺激未具有毒性
[0113] 我方嘗試對(duì)于抗CD30嵌合抗原T細(xì)胞#1138施以經(jīng)放射線照射的9G10融合瘤 (hybridoma)細(xì)胞，其可產(chǎn)生抗獨(dú)特性抗體(anti-idiotypic antibody)9G10,此抗體特定 指向嵌合抗原受體#1138的HRS3scFV結(jié)構(gòu)域?？贵w9G10表現(xiàn)于產(chǎn)生細(xì)胞的抗體細(xì)胞表面，且 借助嵌合抗原受體交聯(lián)強(qiáng)烈活化經(jīng)工程改造的T細(xì)胞#1138。于此等測(cè)試條件中，受治療小 鼠的周邊血液中的CD30+CD4+T細(xì)胞或CD30+CD19+B細(xì)胞數(shù)量并未產(chǎn)生變化（圖5。）
[0114] 3. LCMV感染作為測(cè)試病原體后的免疫反應(yīng)無(wú)變化
[0115]為探究具有T細(xì)胞#1138時(shí)，淋巴細(xì)胞對(duì)于病原體的免疫反應(yīng)是否有所變化，故于T 細(xì)胞#1138過(guò)繼性療法7日后，使移植于Rag2-/-c γ -/-小鼠的人類(lèi)免疫系統(tǒng)感染淋巴球性 脈絡(luò)叢腦膜炎(lympho-choriomeningitis)病毒(LCMV)。
[0116]此次試驗(yàn)基于在免疫健全個(gè)體內(nèi)的全身性LCMV感染受特定的⑶8+及⑶4+T細(xì)胞活 化所控制的事實(shí)，其可于感染部位產(chǎn)生發(fā)炎浸潤(rùn)并短暫表現(xiàn)出高濃度的CD30。未移植T細(xì)胞 及B細(xì)胞免疫系統(tǒng)的Rag2+c γ +小鼠無(wú)法產(chǎn)生抗LCMV的T細(xì)胞反應(yīng)。經(jīng)移植有人類(lèi)免疫系 統(tǒng)的擬人化Rag2+c γ +小鼠受質(zhì)疑其是否可于感染LCMV后產(chǎn)生發(fā)炎浸潤(rùn)。
[0117]我方借助對(duì)腳板局部施以病毒，使免疫系統(tǒng)對(duì)抗LCMV，此為典型的感染試驗(yàn)，可由 感染部位在數(shù)日內(nèi)的腫脹現(xiàn)象表現(xiàn)出抗病毒免疫反應(yīng)。
[0118] 我方于此紀(jì)錄腳板感染部位的腫脹進(jìn)行記錄，亦即一般所知免疫健全野生型小鼠 如balb/c小鼠所會(huì)產(chǎn)生的現(xiàn)象。受此感染路徑施作的實(shí)驗(yàn)用小鼠都未發(fā)生體重下降的情 形。資料顯示局部LCMV感染于經(jīng)重建的Rag2 v_c γ 小鼠受到抗⑶30嵌合抗原受體T細(xì)胞# 1138治療后受到局部控制，于研究中無(wú)任何小鼠死亡。
[0119] 然而，經(jīng)觀察約有30%的體重下降情形（于第10日至第27日平均自18g下降至 12g)。接受9G10抗體細(xì)胞以刺激受到抗CD30T細(xì)胞#1138所控制LCMV感染的小鼠，體重較無(wú) 大幅變化。相較之下，擬人化Rag2+cy+小鼠于抗CEA的T細(xì)胞#1175治療后并未表現(xiàn)出體 重變化。
[0120]資料顯示，具有抗CD30T細(xì)胞#1138的擬人化小鼠可對(duì)所有經(jīng)由腳板腫脹表現(xiàn)出的 LCMV感染建立細(xì)胞免疫反應(yīng)。然而，在受到抗CD30T細(xì)胞#1138治療的小鼠中，對(duì)于LCMV感染 的反應(yīng)可能與適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子(cytokine)釋放并發(fā)癥相關(guān)，因?yàn)榧毙訲細(xì)胞#1138活性化導(dǎo) 致了食物攝取量降低與體重減輕。此與接受抗CEA#1175嵌合抗原受體T細(xì)胞的控制組小鼠 相反，其于該等小鼠體內(nèi)并無(wú)目標(biāo)存在，故并未活性化。
[0121] 4.血清病理
[0122] 各實(shí)驗(yàn)組別小鼠的血清GOT(天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)經(jīng)紀(jì)錄，另外于各組中有一只 小鼠受全身性感染LCMV。血清GOT及GPT(谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶）利用Insti tut fiir Klinische 〇1611^6，1]1111^1;[1111<^5111依據(jù)其標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序進(jìn)行測(cè)定。于1'細(xì)胞療法后長(zhǎng)達(dá)57 日的觀測(cè)期內(nèi)，并未觀測(cè)到血清GOT含量產(chǎn)生顯著變化。
[0123] 結(jié)論
[0124] T細(xì)胞#1138對(duì)于健康的自體移植⑶30+淋巴細(xì)胞毒性，經(jīng)于完整重建有人類(lèi)造血 系統(tǒng)的Rag2+cy+小鼠體內(nèi)受到測(cè)試。來(lái)自三名捐贈(zèng)者的T細(xì)胞受抗CD30嵌合抗原受體# 1138的工程改造，而控制組則受抗CEA嵌合抗原受體#1175所改造，并經(jīng)測(cè)試對(duì)于自體移植 健康CD30+淋巴細(xì)胞的自體免疫反應(yīng)，尤其對(duì)于CD30+CD19+B細(xì)胞以及CD30+CD4+T細(xì)胞的消滅 作用。測(cè)試組與實(shí)驗(yàn)組兩者各總觀察時(shí)間皆為60日。
[0125] 受治療小鼠皆未產(chǎn)生疾病征兆，CD30+⑶19+B細(xì)胞及⑶30+⑶4+T細(xì)胞于周邊血液中 的發(fā)生率皆未變化。缺乏自體免疫毒性征兆的現(xiàn)象，借助對(duì)經(jīng)工程改造的T細(xì)胞#1138施以 結(jié)合于嵌合抗原受體結(jié)合域以誘發(fā)嵌合抗原受體訊號(hào)傳遞以及Τ細(xì)胞活性化的抗獨(dú)特性抗 體9G10來(lái)加以刺激。周邊血液中的⑶30+⑶19+Β細(xì)胞及⑶30+CD4+T細(xì)胞的發(fā)生率皆未觀測(cè)到 有所變化。
[0126] 經(jīng)抗CD30T細(xì)胞# 1138治療的擬人化小鼠體內(nèi)，淋巴細(xì)胞對(duì)于病原體的反應(yīng)，并未 產(chǎn)生如轉(zhuǎn)移Τ細(xì)胞#1138的7日后感染淋巴球性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)所表現(xiàn)出的變化。 然而，受治療的小鼠發(fā)生約30%的體重下降（第10日與第27日相比）。由于移植有Τ細(xì)胞# 1175的小鼠并未于LCMV感染后產(chǎn)生體重下降，我方定論具有Τ細(xì)胞#1138的小鼠體內(nèi)抗LCMV 免疫反應(yīng)產(chǎn)生了適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子釋放并發(fā)癥，其源自對(duì)于CD30+目標(biāo)細(xì)胞的急性活化而導(dǎo) 致食物攝取量減少。感染過(guò)程中無(wú)任何小鼠死亡。
[0127] 于本試驗(yàn)條件下，Τ細(xì)胞#1138過(guò)繼性療法保留了 Β細(xì)胞及Τ細(xì)胞于周邊血液中的數(shù) 量，并對(duì)于一受測(cè)病原體產(chǎn)生了細(xì)胞免疫保護(hù)。
[0128] 范例3:經(jīng)#1138嵌合抗原受體修改的Τ細(xì)胞特定延伸
[0129] 以嵌合抗原受體#1138及#946進(jìn)行Τ細(xì)胞工程
[0130] 具有#1138以及作為比對(duì)的#946的人類(lèi)周邊Τ細(xì)胞移植(參照Hombach A，et.Al.， Gene Ther.20100ct;17(10):1206-13.doi:10.1038/gt.2010.91.Epub 2010Jun 17)具有 CEA特定性scFv結(jié)合域CEA，受雙色流細(xì)胞分選儀(FACS)于轉(zhuǎn)導(dǎo)12小時(shí)后進(jìn)行評(píng)估。
[0131] 具有嵌合抗原受體#1138及#946的T細(xì)胞監(jiān)測(cè)作業(yè)
[0132] 其后，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)于Xviv〇15培養(yǎng)液輔以10%FCS及IL-2(500U/ml)，每周更換 一次培養(yǎng)液，每3日添加一次IL-2。于不同時(shí)間點(diǎn)移出一份細(xì)胞樣本，且CD3+T細(xì)胞經(jīng)利用 FITC共輒抗鼠類(lèi)及PE共輒抗人類(lèi)IgGIFc抗體分析其嵌合抗原受體表現(xiàn)，資料總結(jié)于圖6中。
[0133] 結(jié)論
[0134] 具#1138嵌合抗原受體T細(xì)胞的數(shù)量于進(jìn)一步培養(yǎng)達(dá)300小時(shí)后，較#946嵌合抗原 受體T細(xì)胞數(shù)量實(shí)質(zhì)上增加，并增加超過(guò)所有具#1138嵌合抗原受體T細(xì)胞的90%，相較之 下，具#946嵌合抗原受體的T細(xì)胞增加50%。
[0135] 范例4: B細(xì)胞的特定胞溶現(xiàn)象
[0136]如圖7A所示，B細(xì)胞根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序自PBMC分離。另外，T細(xì)胞自PBMC分離病移植有嵌 合抗原受體#1138,經(jīng)CFSE標(biāo)記并分為CAR+及CAIT群體。自體移植B細(xì)胞根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序以 SCD40L/IL-4活化96小時(shí)，以PKH26標(biāo)記并以流式細(xì)胞儀的細(xì)胞分選功能分選為CD30+及 CD30_群體。經(jīng)標(biāo)技的T細(xì)胞以B細(xì)胞共培養(yǎng)(2.5xl04/well)24小時(shí)，取回后以7-AAD染色并以 流式細(xì)胞儀分析?？刂平M部分，代表惡性T細(xì)胞的My la細(xì)胞的目標(biāo)細(xì)胞溶解，以XTT進(jìn)行存活 力試驗(yàn)加以測(cè)定。如圖7B所示，CD19+B細(xì)胞并無(wú)受CAR+或CARl細(xì)胞導(dǎo)制的顯著胞溶現(xiàn)象，反 之當(dāng)CD30+Myla細(xì)胞與#1138嵌合抗原受體共培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生了實(shí)質(zhì)上的胞溶。再者，相較于不 具嵌合抗原受體的T細(xì)胞，CD19+B細(xì)胞的CD30+及CD3(T細(xì)胞兩者由具有嵌合抗原受體#1138 的T細(xì)胞所導(dǎo)致的胞溶現(xiàn)象并無(wú)實(shí)質(zhì)差異。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有一嵌合抗原受體的T細(xì)胞，用于過(guò)繼性細(xì)胞療法中，以治療一個(gè)體內(nèi)的CD30+ 癌癥，特指CD30+白血病或CD30+淋巴癌，借以使嵌合抗原受體自Ν端(N-terminus)至C端(C-terminus)具有下列結(jié)構(gòu)域： 一抗CD30單鏈抗體域，更具體的，SEQ ID No.2的HRS3scFv或其一同源物，其可特定結(jié) 合于與SEQ ID吣.2具有至少70%辨識(shí)度的0)30; 選擇性一間隔域（spacer domain); 一穿膜域（transmembrane domain);以及 一細(xì)胞衆(zhòng)訊號(hào)傳遞域(cytoplasmatic signalling domain)； 其特征在于:該具有嵌合抗原受體的T細(xì)胞對(duì)于CD30+癌細(xì)胞具有毒性，更具體的，對(duì)于 CD30+白血病細(xì)胞或CD30+淋巴癌瘤具有毒性，但對(duì)于該個(gè)體體內(nèi)的CD30+非癌細(xì)胞則不具 有毒性。2. 如權(quán)利要求1所述的Τ細(xì)胞，用于過(guò)繼性細(xì)胞療法中，以治療一個(gè)體內(nèi)的CD30+癌癥，進(jìn) 一步具有一開(kāi)端序列（leader sequence)，其位于Ν端至抗0)30單鏈抗體域。3. 如權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)所述的T細(xì)胞，用于過(guò)繼性細(xì)胞療法中，以治療一個(gè)體內(nèi)的 CD30+癌癥，其中該抗CD30單鏈抗體域?yàn)镾EQIDNo.2的該HRS3scFV或其一同源物，其特定 結(jié)合于由SEQ ID No.2的HRS3scFV勝肽所辨識(shí)的相同抗原決定位。4. 如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的T細(xì)胞，用于過(guò)繼性細(xì)胞療法中，以治療一個(gè)體內(nèi)的 ⑶30+癌癥，其中該結(jié)構(gòu)域?yàn)镾EQ. ID. No. 5的一IgGiOKCro結(jié)構(gòu)域或其同源物，其具有達(dá)70% 的辨適度，較佳者，該間隔域?yàn)镾EQ. ID. No. 5的一突變IgGiOKaK結(jié)構(gòu)域。5. 如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的T細(xì)胞，用于過(guò)繼性細(xì)胞療法中，以治療一個(gè)體內(nèi)的 ⑶30+癌癥，其中該穿膜域衍生自⑶28。6. 如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的T細(xì)胞，用于過(guò)繼性細(xì)胞療法中，以治療一個(gè)體內(nèi)的 CD30+癌癥，其中該細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有一⑶3zeta或FcEpsilonRl珈瑪訊號(hào)傳遞鏈或一共激 域，例如其中該細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?yàn)镾EQ. ID. No. 7的一⑶3zeta訊號(hào)傳遞域或其同源物，其具有 至少70%的同源性，或其中該細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?yàn)镾EQ. ID.No.8的FcEpsiIon受體珈瑪訊號(hào)傳遞 鏈或其同源物，其具有至少70 %的同源性。7. 如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的T細(xì)胞，用于過(guò)繼性細(xì)胞療法中，以治療一個(gè)體內(nèi)的 CD30+癌癥，其中該細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?yàn)樵揅D28訊號(hào)傳遞域，尤指缺乏lck結(jié)合部分的一 CD28結(jié) 構(gòu)域，如Seq. ID. No. 6所示結(jié)構(gòu)域。8. 如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的T細(xì)胞，用于過(guò)繼性細(xì)胞療法中，以治療一個(gè)體內(nèi)的 ⑶30+癌癥，其中該嵌合抗原受體為SEQ. ID.No. 3的一多勝肽。9. 如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的T細(xì)胞，用于過(guò)繼性細(xì)胞療法中，以治療一個(gè)體內(nèi)的 ⑶30+癌癥，其中該⑶30+癌癥為何杰金氏淋巴癌(Hodgkin's Lymphoma)、間變性大細(xì)胞淋巴 癌（anaplastic large cell lymphoma)、急性淋巴性白血病（acute lymphocytic leukaemia)、皮膚淋巴癌（cutaneous lymphoma)、蕈樣霉菌?。╩ycosis fungoides)、淋巴 增生性疾病（lymphoprol if era tive diseases)、全身性肥大細(xì)胞增生癥（systemic mastocytosis)、畸胎癌（teratocarcinoma)、干細(xì)胞衍生性惡性腫瘤（stem cell derived malignancies)、癌干細(xì)胞（cancer stem cells)其中任一者。10. 如前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的T細(xì)胞，用于過(guò)繼性細(xì)胞療法中，以治療一個(gè)體內(nèi)的 CD30 +癌癥，其中該CD30 +癌癥為一 B細(xì)胞淋巴癌，尤指一何杰金氏淋巴癌（Hodgkin's Lymphoma)或非何杰金氏B細(xì)胞淋巴癌(non-Hodgkin' s B-cell Lymphoma)，或一T細(xì)胞淋巴 癌，尤指蕈樣霉菌病(mycosis fungoides)或塞札里淋巴癌(S6zary lymphoma)。11. 一種SEQ. ID. No . 3所示的多勝肽或其一同源物，其具有至少90 %的辨適度，借以使 該多勝肽當(dāng)表現(xiàn)為一T細(xì)胞的嵌合抗原受體時(shí)，對(duì)于CD30+癌癥表現(xiàn)依毒性作用，并且對(duì) CD30+非癌細(xì)胞不具有毒性作用。12. -種核酸分子，其具有一核酸序列，可編碼出如權(quán)利要求11所述的多勝肽，如 Seq. ID.No.4所示的核酸。13. -種載體，其具有如權(quán)利要求12所述的該核酸序列。14. 一種細(xì)胞、細(xì)胞株或具有如權(quán)利要求13所述的一載體如權(quán)利要求12所述的該核酸 序列的一宿主細(xì)胞。15. -種套件或系統(tǒng)，其具有如權(quán)利要求13所述的一載體、如權(quán)利要求14所述的一細(xì) 胞、細(xì)胞株或一宿主細(xì)胞、如權(quán)利要求12所述的該核酸分子以及/或如權(quán)利要求11所述的該 勝肽，用以制造表現(xiàn)該嵌合抗原受體的T細(xì)胞。16. -種如權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的嵌合抗原受體，用以改善一經(jīng)基因工程改造以 表現(xiàn)該嵌合抗原受體的淋巴細(xì)胞的持久性與放大作用。17. -種HRS3scFV勝肽，或可編碼出相同勝肽或該勝肽或該結(jié)合于CD30的核酸序列同 源物的核酸序列，或具有CD30結(jié)合特性的多勝肽，用以當(dāng)該勝肽為一嵌合抗原受體的細(xì)胞 外部分(extracellular moiety)或融合于具任何其他特定性的一嵌合抗原受體的細(xì)胞外 部分，且受經(jīng)基因工程改造的淋巴細(xì)胞所表現(xiàn)，或與具任何其他特定性的一嵌合抗原受體 由該經(jīng)基因工程改造的淋巴細(xì)胞所共同表現(xiàn)時(shí)，改善任何經(jīng)基因工程改造以表現(xiàn)該勝肽的 淋巴細(xì)胞的持久性與放大作用。18. 用于如權(quán)利要求17所述用途的該HRS3scFV勝肽，或可編碼出相同勝肽或該勝肽或 該結(jié)合于CD30的核酸序列同源物的核酸序列，或具有CD30結(jié)合特性的多勝肽，其中該同源 物為特定結(jié)合于由該HRS3scF V勝肽所辨識(shí)的CD30的相同抗原決定位的同源物。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK105940102SQ201480047265
【公開(kāi)日】2016年9月14日
【申請(qǐng)日】2014年8月26日
【發(fā)明人】馬庫(kù)斯·切米萊沃斯基, 安德利亞斯·洪巴赫, 海瑞克·亞柏坎
【申請(qǐng)人】盈諾百有限公司