一種從芹菜中分離純化芹菜苷的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于本發(fā)明屬于天然提取物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從芹菜中分離純化芹菜苷的方法。該方法采用芹菜為原料，通過(guò)乙醇浸提、聚酰胺樹脂柱層析初步分離和制備型高效液相精制的步驟進(jìn)一步分離獲得高純度芹菜苷。本發(fā)明中采用一種聚酰胺樹脂，對(duì)芹菜黃酮提取物初步純化，減少中間流程，提高分離純化芹菜苷效率；結(jié)合制備型高效液相色譜，具有上樣量大，分離周期短，獲得樣品純度高等優(yōu)點(diǎn)。整個(gè)工藝過(guò)程操作方便，能耗低，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】
一種從芹菜中分離純化芹菜苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于天然提取物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從芹菜中分離純化芹菜苷的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 芹菜是一種兩年生的傘形科草本植物，原產(chǎn)于地中海沿岸，在我國(guó)有著悠久的栽 培歷史。芹菜中黃酮類化合物是優(yōu)良的活性氧清除劑和脂質(zhì)抗氧化劑，具有多種生物活性， 如抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌、抗衰老等作用。
[0003] 芹菜中含量較高的黃酮類化合物芹菜苷，又名芹菜甙，英文名Apiin，是以芹菜素 為苷元的黃酮苷，分子式為C26H 28014，CAS號(hào)：26544-34-3，溶于熱水及熱乙醇，幾乎不溶于乙 醚。現(xiàn)已有相關(guān)分離純化芹菜苷的專利及文獻(xiàn)報(bào)道如：方法一，錢少華（專利申請(qǐng)?zhí)枺?99116604.3)通過(guò)重結(jié)晶方式從石崖茶中提取一種芹菜素和芹菜甙混合物;方法二，王克勤 [芹菜黃酮類物質(zhì)的分離純化與藥理功能研究，長(zhǎng)沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009]將芹菜醇提物先 用XDA-1樹脂進(jìn)行分離，再用聚酰胺樹脂進(jìn)行分離，然后用Sephadex LH-20柱色譜以及 HSCCC (高速逆流色譜分離)進(jìn)行分離，最終得到3種成分，其中一種黃酮類物質(zhì)為芹菜苷。 [0004]上述方法主要是對(duì)芹菜苷分離純化，方法一中利用重結(jié)晶方法，產(chǎn)量高，成本低， 但是很難得到高純度芹菜苷，方法二中結(jié)合大孔樹脂和聚酰胺樹脂，以及多種分離手段。分 離過(guò)程步驟較為繁瑣，而且生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，一次很難大量生產(chǎn)，并且生產(chǎn)所需成本較高。芹 菜苷具有多種生物活性，在抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌、抗衰老、降低心血管疾病等方面發(fā) 揮重要作用，但是高純度的芹菜苷價(jià)格高，所以需要找到一種快速、高效的提取方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷與不足，提供一種從芹菜中提取芹菜苷的高 效、簡(jiǎn)便的方法。
[0006] 為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種分離芹菜中芹菜苷的方法，依次包括以 下步驟：
[0007] (1)乙醇浸提
[0008] 取新鮮芹菜，洗凈除雜，干燥后粉碎，用一定體積濃度乙醇溶液放于反應(yīng)釜中浸 提，所述芹菜粉末與乙醇溶液的料液比為1:10~20(g/mL)，提取液經(jīng)過(guò)濾，減壓濃縮至棕黑 色浸膏，備用；
[0009] (2)聚酰胺樹脂柱層析初步分離
[0010] 將棕黑色浸膏用純水溶解，樣品上聚酰胺樹脂并充分吸附，先用純水以l.〇BV/h~ 2. OBV/h流速水洗，水洗4BV~6BV;再用一定體積濃度的乙醇溶液以1. OBV/h~2. OBV/h等度 洗脫，醇洗4BV~6BV，收集該部分洗脫液，減壓濃縮得黃棕色浸膏。
[0011] (3)制備型高效液相精制
[0012] 將黃棕色浸膏溶于一定體積濃度的甲醇溶液中，用制備型高效液相色譜儀進(jìn)一步 分離純化，色譜柱為C18，流動(dòng)相為甲醇和Ο . 1 %甲酸水，控制一定流速進(jìn)行洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng) 為267nm和333nm，收集目標(biāo)組分餾分，將得到的餾分減壓濃縮、冷凍干燥、研磨過(guò)篩，得淡黃 色粉末，即得到所要分離的單體化合物。
[0013] 本發(fā)明步驟（1)中的"一定體積濃度乙醇溶液放于反應(yīng)釜中浸提"，其中乙醇體積 濃度為40 %~95 %，優(yōu)選體積濃度70 %乙醇浸提。
[0014] 本發(fā)明步驟(1)中的"反應(yīng)釜提取條件"，其中反應(yīng)釜溫度40°C~60°C，優(yōu)選50°C。
[0015] 本發(fā)明步驟（1)中的"反應(yīng)釜提取條件"，其中反應(yīng)釜轉(zhuǎn)速400r/min~600r/min，優(yōu) 選500r/min〇
[0016] 本發(fā)明步驟（1)中的"反應(yīng)釜提取條件"，其中反應(yīng)釜提取時(shí)間lh~3h，優(yōu)選1.5h~ 2.511，更優(yōu)選擇211。
[0017] 本發(fā)明步驟（1)中的"反應(yīng)釜提取條件"，其中反應(yīng)釜提取次數(shù)2~6次，優(yōu)選3~5 次，更優(yōu)選擇4次。
[0018] 本發(fā)明步驟（2)中的"按一定比例溶于純水中"，溶解方式：將溶解液于20KHz~ 40KHz的超聲頻率下超聲處理lOmin，得聚酰胺樹脂上樣液。
[0019] 本發(fā)明步驟(2)中的"聚酰胺樹脂初步分離"，所述棕黑色浸膏與純水用量比為1:3 ~5(g/mL);棕黑色浸膏與聚酰胺樹脂的用量比為1:40~50(g/mL)。
[0020] 本發(fā)明步驟（2)中的"用一定體積濃度的乙醇溶液以1. OBV/h~2 . OBV/h等度洗 脫"，一定體積濃度的乙醇其體積濃度為40%，70%或95%，優(yōu)選體積濃度70%乙醇洗脫。
[0021] 本發(fā)明步驟(3)的"將黃棕色浸膏溶于一定體積濃度的甲醇溶液"中，其中甲醇的 體積濃度為40%~55%，溶解方式:將溶解液于20KHz~40KHz的超聲頻率下超聲處理lOmin 中，得制備型高效液相上樣液。
[0022]本發(fā)明步驟(3)的"以甲醇和0.1 %甲酸水為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫"，洗脫方式有45%甲 醇-0.1 %甲酸水等度洗脫，50 %甲醇-0.1 %甲酸水等度洗脫，55 %甲醇-0.1 %甲酸水等度 洗脫，甲酸-〇. 1 %甲酸水梯度洗脫，優(yōu)選50 %甲醇-0.1 %甲酸水等度洗脫。
[0023]本發(fā)明步驟(3)中的"控制一定流速進(jìn)行洗脫"中，其洗脫流速為10mL/min~50mL/ min，優(yōu)選25mL/min進(jìn)行洗脫。
[0024] 本發(fā)明提供一種分離芹菜中芹菜苷的方法，首先采用聚酰胺初步分離，再用制備 型高效液相色譜進(jìn)行精制，所得目標(biāo)化合物純度高。除此之外，還具有以下優(yōu)勢(shì)：
[0025] (1)提取液經(jīng)過(guò)聚酰胺樹脂初步分離，可以去除提取液中大部分雜質(zhì)，簡(jiǎn)化混合物 組成，降低分離難度;并且還能減少制備次數(shù)，保護(hù)制備型高效液相色譜柱不被污染，從某 種意義上延長(zhǎng)了色譜柱壽命。只選擇一種樹脂分離，使得工藝簡(jiǎn)單，操作方便。
[0026] (2)采用制備型高效液相色譜法分離純化得到芹菜苷，具有樣品純度高，操作簡(jiǎn) 單，分離效率高，工藝周期短等優(yōu)點(diǎn)。
[0027] (3)提取，純化過(guò)程中沒(méi)有使用對(duì)環(huán)境和人體危害大的有機(jī)溶劑，操作中所用醇類 物質(zhì)可以回收使用并且聚酰胺樹脂再生后可以重復(fù)使用多次，降低對(duì)環(huán)境污染，節(jié)約成本， 綠色環(huán)保。
[0028] (4)優(yōu)化了柱層析的條件(洗脫液的組成，洗脫流速，洗脫體積），提高純化目標(biāo)物 質(zhì)的效率。
[0029] (5)優(yōu)化了制備型高效液相色譜的條件(洗脫流速，洗脫液的組成），提高純化芹菜 苷的效率，節(jié)約成本，適合實(shí)驗(yàn)室及工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 圖1是本發(fā)明方法流程圖。
[0031] 圖2是芹菜總黃酮的制備型高效液相色譜圖。
[0032]圖3是芹菜苷的HPLC圖及其UV圖。
[0033]圖4是芹菜苷正負(fù)離子模式下質(zhì)譜圖及其負(fù)離子模式下二級(jí)質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0034]為了讓發(fā)明的目的更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例和【附圖說(shuō)明】本發(fā)明技術(shù)方案， 但保護(hù)范圍不受此限制。芹菜中提取分離芹菜苷流程如圖1所示。
[0035] 實(shí)施例1
[0036] (1)芹菜黃酮提取物制備:將新鮮芹菜洗凈、除雜、干燥，取2kg干芹菜粉碎機(jī)粉碎， 按照料液比1:20(g/mL)加入體積濃度40%乙醇溶液，放入10L反應(yīng)釜，反應(yīng)釜溫度為50°C， 轉(zhuǎn)速為400r/min，每次提取時(shí)間1.5h，連續(xù)提取6次；提取液經(jīng)過(guò)濾、合并、減壓濃縮得棕黑 色浸膏18g，備用；
[0037] (2)聚酰胺樹脂粗分離:按照棕黑色浸膏與聚酰胺樹脂的用量比l:40(g/mL)，準(zhǔn)備 聚酰胺樹脂720mL，用大量的蒸餾水沖洗，除去漂浮的碎樹脂顆粒后裝于層析柱（5cmX 100cm)中，用體積濃度95%乙醇溶液置換樹脂中水，靜置過(guò)夜。再用體積濃度95%乙醇溶液 以2.OBV/h的流速淋洗至流出液與水按1:5比例混合無(wú)渾濁。再將上述聚酰胺樹脂中的乙醇 用大量的蒸餾水沖洗，至流出液無(wú)醇味。
[0038] 將上述棕黑色浸膏按照料液比l:3(g/mL)溶于54mL純水中超聲處理，超聲波頻率 28KHz，超聲時(shí)間1 Omin。樣品上聚酰胺樹脂并充分吸附，先用4BV水進(jìn)行洗脫，再用6BV體積 濃度為40 %乙醇洗脫，控制上樣及洗脫流速為2. OBV/h，收集體積濃度40 %乙醇洗脫液，減 壓濃縮得黃棕色浸膏5.4g。
[0039 ] (3)制備型高效液相色譜分離純化:取上述黃棕色浸膏按照料液比4:1 (mg/mL)溶 于體積濃度45%甲醇溶液中超聲處理，超聲波頻率28KHz，超聲時(shí)間lOmin。選擇色譜柱為 C18(ΙΟμπι，30mmX250mm)，流動(dòng)相為45%甲醇-0.1 %甲酸水，柱流速為25mL/min，紫外檢測(cè) 波長(zhǎng)為267nm和333nm，用45 %甲醇-0.1 %甲酸水平衡色譜柱20min，每次進(jìn)樣體積50mL，收 集目標(biāo)組分餾分，將得到的餾分合并、減壓濃縮、冷凍干燥、研磨過(guò)篩，得淡黃色粉末620mg， 純度為98.51%，其中該條件下芹菜總黃酮的制備型高效液相色譜圖見圖2,芹菜苷的高效 液相色譜圖及其紫外最大吸收譜圖見圖3。
[0040] (4)化合物結(jié)構(gòu)鑒定:經(jīng)紫外光譜測(cè)定、高效液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定、以及核磁共振譜 氫譜和碳譜測(cè)定，分析該組分為芹菜苷，結(jié)構(gòu)如下：
[0042]芹菜苷：rnamax(甲醇）：267,339nm;ESI-MS(m/z) :563.10[M-H] -、565.2[M+H] + (具 體數(shù)據(jù)見圖4a和圖4b);負(fù)離子模式下二級(jí)質(zhì)譜中特征子離子碎片269.33(芹菜素碎片）（具 體數(shù)據(jù)見圖4(：); 1!1-匪1?(60冊(cè)!^，0150-(16)5??111:3.18~3.93(12!1，111，!1-2"~6"，!1-2"'~ 5"'），5.16(lH，d，J = 7.2Hz，H-r)，5.36(lH，d，J=1.2Hz，H-r'），6.43(lH，d，J = 2.1Hz，H-6)，6.81(lH，d，J = 2.1Hz，H-8)，6.86(lH，s，H-3)，6.94(2H，dd，J = 8.7,2.1Hz，H-3'，5'）， 7.96(2H，dd，J = 8.7,2.1Hz，H-2'，6'）；13C-NMR(150MHz，DMS0-d6)Sppm:60.5(C-6"），64.5 (C-5"，），69.8(C-4"），73.9(C-4"，），76.0(C-2"，），77.0(C-5"），75.7(C-2"），76.8(C-3"）， 79.3(C-3"'），94.8(C-8)，99.3(C-1"），99.9(C-6)，102.9(C-3)，105.3(C-10)，108.7(C-l"'），116.0(3'，C-5'），120.9(C-r)，128.6(2'，C-6'），156.9(C-5)，161.1(C-9)，161.4(C-4'），162.6(C-7)，164.3(C-2)，181.9(C-4)。
[0043]以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道序菜苷基本一致，鑒定為序菜苷（六口丨86]1；[117-0-0-0-apiofuranosyl( l-2)-0-D-glucopyranoside) 0
[0044] 實(shí)施例2
[0045] (1)芹菜黃酮提取物制備:將新鮮芹菜洗凈、除雜、干燥，取2kg干芹菜粉碎機(jī)粉碎， 按照料液比1:10(g/mL)加入體積濃度95%乙醇溶液，放入10L反應(yīng)釜，反應(yīng)釜溫度為40°C， 轉(zhuǎn)速為600r/min，每次提取時(shí)間lh，連續(xù)提取2次；提取液經(jīng)過(guò)濾、合并、減壓濃縮得棕黑色 浸膏26g，備用；
[0046] (2)聚酰胺樹脂粗分離:按照棕黑色浸膏與聚酰胺樹脂的用量比l:45(g/mL)，準(zhǔn)備 聚酰胺樹脂1170mL，用大量的蒸餾水沖洗，除去漂浮的碎樹脂顆粒后裝于層析柱（5cmX 100cm)中，用體積濃度95%乙醇溶液置換樹脂中水，靜置過(guò)夜。再用體積濃度95%乙醇溶液 以1.5BV/h的流速淋洗至流出液與水按1:5比例混合無(wú)渾濁。再將上述聚酰胺樹脂中的乙醇 用大量的蒸餾水沖洗，至流出液無(wú)醇味。
[0047] 將上述棕黑色浸膏按照料液比l:5(g/mL)于130mL純水中超聲處理，超聲波頻率 20KHz，超聲時(shí)間1 Omin。樣品上聚酰胺樹脂并充分吸附，先用6BV水進(jìn)行洗脫，再用5BV體積 濃度為95 %乙醇洗脫，控制上樣及洗脫流速為1.5BV/h，收集體積濃度95 %乙醇洗脫液，減 壓濃縮至黃棕色浸膏13.5g。
[0048] (3)制備型高效液相色譜分離純化:取上述黃棕色浸膏按照料液比5:1 (mg/mL)溶 于體積分?jǐn)?shù)55%甲醇溶液中超聲處理，超聲波頻率40KHz，超聲時(shí)間lOmin。選擇色譜柱為 C18(ΙΟμπι，30mmX250mm)，流動(dòng)相為55%甲醇-0.1 %甲酸水，柱流速為10mL/min，紫外檢測(cè) 波長(zhǎng)267和333nm，用55 %甲醇-0.1 %甲酸水流動(dòng)相平衡色譜柱20min，每次進(jìn)樣體積50mL， 收集目標(biāo)組分餾分，將得到的餾分合并、減壓濃縮、冷凍干燥、研磨過(guò)篩，得淡黃色粉末 81〇11^，純度為97.58%。
[0049] (4)化合物結(jié)構(gòu)鑒定：目標(biāo)組分結(jié)構(gòu)鑒定同具體實(shí)施1中步驟(4)化合物結(jié)構(gòu)鑒定。
[0050] 實(shí)施例3
[0051 ] (1)芹菜黃酮提取物制備:將新鮮芹菜洗凈、除雜、干燥，取2kg干芹菜粉碎機(jī)粉碎， 按照料液比1:20(g/mL)加入體積濃度75%乙醇溶液，放入10L反應(yīng)釜，反應(yīng)釜溫度為60°C， 轉(zhuǎn)速500r/min進(jìn)行，每次提取時(shí)間2h，連續(xù)提取3次；提取液經(jīng)過(guò)濾、合并、減壓濃縮得棕黑 色浸霄24g，備用；
[0052] (2)聚酰胺樹脂粗分離:按照棕黑色浸膏與聚酰胺樹脂的用量比l:50(g/mL)，準(zhǔn)備 聚酰胺樹脂1200mL，用大量的蒸餾水沖洗，除去漂浮的碎樹脂顆粒后裝于層析柱（5cmX 100cm)中，用體積濃度95%乙醇溶液置換樹脂中水，靜置過(guò)夜。再用體積濃度95%乙醇溶液 以1. OBV/h的流速淋洗至流出液與水按1:5比例混合無(wú)渾濁。再將上述聚酰胺樹脂中的乙醇 用大量的蒸餾水沖洗，至流出液無(wú)醇味。
[0053] 將上述棕黑色浸膏按照料液比l:4(g/mL)溶于96mL純水中超聲處理，超聲波頻率 24KHz，超聲時(shí)間lOmin。樣品上聚酰胺樹脂并充分吸附，先用5BV水進(jìn)行洗脫，再用4BV體積 濃度為75 %乙醇洗脫，控制上樣及洗脫流速為1. OBV/h，收集體積濃度75 %乙醇洗脫液，減 壓濃縮至黃棕色浸膏6.25g。
[0 05 4 ] (3)制備型高效液相色譜分離純化:取上述黃棕色浸膏按照料液比6:1 (m g /m L)溶 于體積濃度50%甲醇溶液中超聲處理，超聲波頻率32KHz，超聲時(shí)間lOmin。選擇色譜柱為 C18(ΙΟμπι，30mmX250mm)，流動(dòng)相為50%甲醇-0.1 %甲酸水，柱流速為50mL/min，紫外檢測(cè) 波長(zhǎng)為26711111和33311111，用50%甲醇-0.1%甲酸水流動(dòng)相平衡色譜柱201^11，每次進(jìn)樣體積 50mL，收集目標(biāo)組分餾分，將得到的餾分減壓濃縮、冷凍干燥、研磨過(guò)篩，得淡黃色粉末 75〇11^，純度為97.65%。
[0055] (4)化合物結(jié)構(gòu)鑒定：目標(biāo)組分結(jié)構(gòu)鑒定同具體實(shí)施1中步驟(4)中化合物結(jié)構(gòu)鑒 定。
[0056] 實(shí)施例4
[0057] (1)芹菜黃酮提取物制備:將新鮮芹菜洗凈、除雜、干燥，取2kg干芹菜粉碎機(jī)粉碎， 按照料液比1:10(g/mL)加入體積濃度40%乙醇溶液，放入10L反應(yīng)釜，反應(yīng)釜溫度為40°C， 轉(zhuǎn)速為400r/min，每次提取時(shí)間2.5h，連續(xù)提取5次；提取液經(jīng)過(guò)濾、合并、減壓濃縮得棕黑 色浸膏20g，備用；
[0058] (2)聚酰胺樹脂粗分離:按照棕黑色浸膏與聚酰胺樹脂的用量比l:40(g/mL)，準(zhǔn)備 聚酰胺樹脂800mL，用大量的蒸餾水沖洗，除去漂浮的碎樹脂顆粒后裝于層析柱（5cmX 100cm)中，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液置換樹脂中水，靜置過(guò)夜。再用體積濃度95%乙醇溶液 以2.OBV/h的流速淋洗至流出液與水按1:5比例混合無(wú)渾濁。再將上述聚酰胺樹脂中的乙醇 用大量的蒸餾水沖洗，至流出液無(wú)醇味。
[0059] 將上述棕黑色浸膏按照料液比l:3(g/mL)溶于60mL純水中超聲處理，超聲波頻率 32KHz，超聲時(shí)間1 Omin。樣品上聚酰胺樹脂并充分吸附，先用5BV水進(jìn)行洗脫，再用4BV體積 濃度為40 %乙醇洗脫，控制上樣及洗脫流速為2. OBV/h，收集體積濃度40 %乙醇洗脫液，減 壓濃縮至黃棕色浸膏5.2g。
[ΟΟ?Ο ] (3)制備型高效液相色譜分離純化:取上述黃棕色浸膏按照料液比5:1 (mg/mL)溶 于體積分?jǐn)?shù)40 %甲醇溶液中超聲處理，超聲波頻率20KHz，超聲時(shí)間lOmin。選擇色譜柱為 C18( 10ym，3(toimX 25(toim)，流動(dòng)相為甲醇-0 · 1 %甲酸水，洗脫梯度如下：40%甲醇-0 · 1 %甲 酸水Omin~3min; 45 %甲醇-〇 · 1 %甲酸水5min~25min; 90 %甲醇-〇 · 1 %甲酸水27min~ 35min;40%甲醇-〇. 1 %甲酸水40min~45min，柱流速為25mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為267nm和 333nm，用40%甲醇-0.1 %甲酸水流動(dòng)相平衡色譜柱20min，每次進(jìn)樣體積50mL，收集目標(biāo)組 分餾分，將得到的餾分減壓濃縮、冷凍干燥、研磨過(guò)篩，得淡黃色粉末600mg，純度為 98.78%〇
[0061] (4)化合物結(jié)構(gòu)鑒定：目標(biāo)組分結(jié)構(gòu)鑒定同具體實(shí)施1中步驟(4)化合物結(jié)構(gòu)鑒定。
[0062] 實(shí)施例5 (1)芹菜黃酮提取物制備:將新鮮芹菜洗凈、除雜、干燥，取2kg干芹菜粉碎 機(jī)粉碎，按照料液比1: 20(g/mL)加入體積濃度75%乙醇溶液，放入10L反應(yīng)釜，反應(yīng)釜溫度 為60°C，轉(zhuǎn)速500r/min進(jìn)行，每次提取時(shí)間2h，連續(xù)提取4次;提取液經(jīng)過(guò)濾、合并、減壓濃縮 得棕黑色浸膏26g，備用；
[0063] (2)聚酰胺樹脂粗分離:按照棕黑色浸膏與聚酰胺樹脂的用量比l:45(g/mL)，準(zhǔn)備 聚酰胺樹脂1170mL，用大量的蒸餾水沖洗，除去漂浮的碎樹脂顆粒后裝于層析柱（5cmX 100cm)中，用體積濃度95%乙醇溶液置換樹脂中水，靜置過(guò)夜。再用體積濃度95%乙醇溶液 以1.5BV/h的流速淋洗至流出液與水按1:5比例混合無(wú)渾濁。再將上述聚酰胺樹脂中的乙醇 用大量的蒸餾水沖洗，至流出液無(wú)醇味。
[0064] 將上述棕黑色浸膏按照料液比l:3(g/mL)溶于78mL純水中超聲處理，超聲波頻率 40KHz，超聲時(shí)間1 Omin。樣品上聚酰胺樹脂并充分吸附，先用5BV水進(jìn)行洗脫，再用5BV體積 濃度為75%乙醇洗脫，控制上樣及洗脫流速為2. OBV/h，收集體積濃度75%乙醇洗脫液，減 壓濃縮至黃棕色浸膏6.77g。
[0065 ] (3)制備型高效液相色譜分離純化:取上述黃棕色浸膏按照料液比4:1 (mg/mL)溶 于體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液中超聲處理，超聲波頻率24KHz，超聲時(shí)間lOmin。選擇色譜柱為 C18(ΙΟμπι，30mmX250mm)，流動(dòng)相為50%甲醇-0.1 %甲酸水，柱流速為25mL/min，紫外檢測(cè) 波長(zhǎng)267nm和333nm，用50%甲醇-0.1%甲酸水的流動(dòng)相平衡色譜柱20min，每次進(jìn)樣體積 50mL，收集目標(biāo)組分餾分，將得到的餾分減壓濃縮、冷凍干燥、研磨過(guò)篩，得淡黃色粉末 78〇11^，純度為98.23%。
[0066] (4)化合物結(jié)構(gòu)鑒定：目標(biāo)組分結(jié)構(gòu)鑒定同具體實(shí)施1中步驟(4)化合物結(jié)構(gòu)鑒定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種從芹菜中分離純化芹菜苷的方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 乙醇浸提 干燥的芹菜粉末用體積濃度40 %~95 %乙醇溶液于反應(yīng)釜中浸提，芹菜粉末與乙醇溶 液的料液比為1:10~20(g/mL)，提取液經(jīng)過(guò)濾，減壓濃縮至棕黑色浸膏，備用； (2) 聚酰胺樹脂柱層析初步分離 將棕黑色浸膏按一定比例溶于純水中，樣品上聚酰胺樹脂并充分吸附，先用純水以 1. OBV/h~2 . OBV/h流速水洗，水洗4BV~6BV;再用一定體積濃度乙醇溶液以1.0 BV/h~ 2. OBV/h等度洗脫，醇洗4BV~6BV，收集該部分洗脫液，減壓濃縮得黃棕色浸膏； (3) 制備型尚效液相精制 將黃棕色浸膏溶于一定體積濃度的甲醇溶液中，用制備型高效液相色譜儀進(jìn)一步分離 純化，色譜柱為C18,流動(dòng)相為甲醇和0.1 %甲酸水，控制一定流速進(jìn)行洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為 267nm和333nm，收集目標(biāo)組分餾分，將得到的餾分減壓濃縮、冷凍干燥、研磨過(guò)篩，得淡黃色 粉末，即芹菜苷。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述乙醇溶液體積濃度為70 %。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中浸提條件為:提取溫度40°C~60 °C ;反應(yīng)釜轉(zhuǎn)速400r/min~600r/min;提取時(shí)間Ih~3h;反應(yīng)釜提取次數(shù)2~6次。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（1)中浸提條件為:溫度50°C ;反應(yīng)釜 轉(zhuǎn)速500r/min;提取時(shí)間1.5h~2.5h;反應(yīng)釜提取次數(shù)3~5次。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述棕黑色浸膏按一定比例溶 于純水中，溶解方式:將溶解液置于20KHz~40KHz的超聲頻率下超聲處理lOmin，得聚酰胺 樹脂上樣液。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述棕黑色浸膏與純水的用量 比為1:3~5(g/mL);棕黑色浸膏與聚酰胺樹脂的用量比為1:40~50(g/mL)。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述用一定體積濃度乙醇溶液 以1.0BV/h~2.0BV/h等度洗脫，一定體積濃度的乙醇其體積濃度為40 %，70 %或95 %。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述用一定體積濃度乙醇溶液 以1.0BV/h~2.0BV/h等度洗脫，一定體積濃度的乙醇其體積濃度為70%。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述將黃棕色浸膏溶于一定體 積濃度的甲醇溶液中，其甲醇體積濃度為40 %~55 %，溶解方式:將溶解液于20KHz~40KHz 的超聲頻率下超聲處理l〇min，得制備型高效液相上樣液。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的以甲醇和0.1%甲酸水 為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫時(shí)，其洗脫方式有45 %甲醇-0.1 %甲酸水等度洗脫，50 %甲醇-0.1 %甲 酸水等度洗脫，55 %甲醇-0.1 %甲酸水等度洗脫或甲醇-0.1 %甲酸水梯度洗脫。
【文檔編號(hào)】C07H1/08GK105949256SQ201610363939
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月30日
【發(fā)明人】徐鑫, 莊林武, 張?zhí)锾? 宋丹丹, 劉國(guó)艷
【申請(qǐng)人】揚(yáng)州大學(xué)