甘氨雙唑鈉的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了甘氨雙唑鈉的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用，本發(fā)明提供的甘氨雙唑鈉的藥物組合物中含有甘氨雙唑鈉和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物化合物(Ⅰ)，甘氨雙唑鈉、化合物(Ⅰ)單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)肺癌具有抑制作用；甘氨雙唑鈉和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)肺癌的抑制效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療肺癌的藥物，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【專利說明】
甘氨雙η坐鈉的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及甘氨雙唑鈉的新用途，具體涉及甘氨雙唑鈉的藥 物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 甘氨雙唑鈉為腫瘤放療的增敏劑，屬于硝基咪唑類化合物，可將射線對(duì)腫瘤乏氧 細(xì)胞DNA的損傷固定，抑制其DNA損傷的修復(fù)，從而提高腫瘤乏氧細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種甘氨雙唑鈉的藥物組合物，該藥物組合物中含有甘氨 雙唑鈉和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，甘氨雙唑鈉和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同治療肺癌。
[0004] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0005] 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
[0007] -種甘氨雙唑鈉的藥物組合物，包括甘氨雙唑鈉、如權(quán)利要求1所述的化合物（I) 和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。
[0008] 進(jìn)一步地，藥學(xué)上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、 崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。
[0009] 進(jìn)一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0010] 上述化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將澤蘭粉碎，用65~85%乙醇 熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取， 分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁醇萃取物用 大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，收集70%洗脫 液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離， 依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步驟 (c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為10:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分 濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合 物⑴。
[0011] 進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)用75%乙醇熱回流提取，合并提取 液。
[0012] 進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0013]進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯進(jìn)行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0014] 上述化合物(I)在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 上述甘氨雙唑鈉的藥物組合物在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0017] 本發(fā)明提供的甘氨雙唑鈉的藥物組合物中含有甘氨雙唑鈉和一種結(jié)構(gòu)新穎的天 然產(chǎn)物，甘氨雙唑鈉和該天然產(chǎn)物單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)肺癌具有治療作用；二者聯(lián)合作用時(shí)，對(duì) 肺癌的治療效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療肺癌的藥物。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。
[0019] 實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0020]分離方法：（a)將澤蘭（3kg)粉碎，用75 %乙醇熱回流提?。?0L X 3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（4L)，依次用石油醚(4L X 3次）、乙酸乙酯（4L X 3次）和水飽和的正丁醇 (4LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 正丁醇萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫8個(gè) 柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃 縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1 (8個(gè)柱體積）、25:1 (8個(gè)柱體積）、15:1 (8個(gè)柱體 積)和5:1(10個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4用正 相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為10:1(8個(gè)柱體積）、5:1(10個(gè)柱體積)和2:1(5個(gè)柱體 積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)(純度大于98% )。
[0021] 結(jié)構(gòu)確證:冊(cè)431-]\^顯示[]\?^]+為111/2 419.3312，結(jié)合核磁特征可得分子式為 C28H44〇，不飽和度為7。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ρρπι，DMS〇-d6，500MHz): H-1 (1 · 68，m)，H-1 (1.95，m)，H-2(5.62，m)，H-3(5.63，m)，H-4(2.04，m)，H-4(2.31，m)，H-5(2.03，m)，H-7 (2.04，m)，H-7(2.31，m)，H-8(1.41，m)，H-9(0.97，m)，H-ll(1.26，m)，H-ll(1.51，m)，H-12 (l.ll，m)，H-12(1.92，m)，H-14(1.10，m)，H-15(1.03，m)，H-15(1.57，m)，H-16(1.25，m)，H-16(1.83，m)，H-17(1.04，m)，H-18(0.63，s)，H-19(0.81，s)，H-20(1.36，m)，H-21(0.92，d，J =6.5)，H-22(1.12，m)，H-22(1.51，m)，H-23(2.09，m)，H-23(2.11，m)，H-25(2.18，m)，H-26 (1.01，d，J = 7.0)，H-27(0.98，d，J = 7.0)，H-28(4.62，d，J=1.5)，H-28(4.69，s);核磁共振 碳譜數(shù)據(jù)Sc(ppm，DMS〇-d 6,125MHz) :37.1 (CH2，1-C)，123.3(CH，2-C)，125.5(CH，3-C)，37 ·4 (CH2,4-C)，52.6(CH，5-C)，211.2(C，6-C)，46.5(CH2,7-C)，35.3(CH，8-C)，52.2(CH，9-C)， 36.8(C，10-C)，20.8(CH2，11-C)，39.3(CH2，12-C)，42.3(C，13-C)，55.5(CH，14-C)，23·9 (CH2，15-C)，27.8(CH2，16-C)，55.7(CH，17-C)，11.9(CH 3，18-C)，13.2(CH3，19-C)，35.3(CH， 20-C) ,18.4(CH3,21-0,34.2(CH2,22-C), 31.1(CH2,23-0,156.3(C,24-C), 33.4(CH, 25-〇,21.8(013,26-〇,21.6(013,27-〇，105.7(012,28-〇。1!1-匪1?譜顯示五個(gè)甲基信號(hào)[3 H0.63(s，H3-18)，0.81(s，H3-19)，0.92(d，J = 6.5Hz，H3-21)，0.98(d，J = 7.0Hz，H3-27)和 1.01(d，J = 7.0Hz，H3-26)]，一個(gè)烯屬亞甲基[δH4·62(d，J=l·5Hz，H-28)和4·69(s，H-28)]，兩個(gè)烯屬次甲基質(zhì)子信號(hào)[δH5.62(m，H-2)和5.63(m，H-3)]。 13C-NMR譜顯示了28個(gè)碳 信號(hào)，包括五個(gè)甲基，十個(gè)亞甲基（一個(gè)烯屬亞甲基），九個(gè)次甲基(兩個(gè)烯屬次甲基），以及 四個(gè)季碳(一個(gè)烯烴季碳，一個(gè)羰基碳）。核磁數(shù)據(jù)表明該化合物為留體類化合物。HMBC譜中 1〇-210!1〇.92)與(：-17(3〇55.7)，(：-2〇(3〇35.3)和(：-22(3〇34.2) ;!12-28(3!14.62和4.69)與 C-23(SC31 · 1)，C-24(SC156.3)和C-25(SC33.4);以及Η-25(δΗ2· 18)與C-23(SC31 · 1)，C-24 0(：156.3)，(：-260〇21.8)，(：-270〇21.6)和(：-280(：1〇5.7)的相關(guān)性表明了該化合物的側(cè) 鏈結(jié)構(gòu)。HMBC 譜中 Μθ-18(δΗ0·63)與 C-120C39.3)，C-13(SC42.3)，C-140C55.5WPC-17(S C55.7);以及Μθ-19(δΗ0·81)與C-1(SC37.1)，C-5(SC52.6)，C-9(SC52.2WPC-10(SC36.8W9 相關(guān)性表明該化合物為四環(huán)結(jié)構(gòu)。此外，Η 2-7(δΗ2.04和2.31)與C-5(SC52.6)，C-6(S 〇211.2)，(：-90〇52.2)和(：-140〇55.5)的相關(guān)性表明(：-6位為酮羰基。兩個(gè)低場碳信號(hào)[6 (：123.3(02)和125.5((：-3)]和質(zhì)子共振信號(hào)[5!15.62(111，!1-2)和5.63(111，!1-3)]，表明該化合 物含有一個(gè)兩取代雙鍵。N0ESY譜中，Η_12α與H-17的相關(guān)性表明H-17為α構(gòu)型。綜合氫譜、碳 譜、HMBC譜和N0ESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立 體構(gòu)型進(jìn)一步通過Ε⑶試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致。
[0022]該化合物化學(xué)式及碳原子編號(hào)如下：
[0024] 實(shí)施例2:藥理作用
[0025]本實(shí)施例使用右腋皮下接種肺癌瘤株細(xì)胞建立lewis肺癌小鼠模型，測(cè)定各組的 抑瘤率和Bcl-2及Bax表達(dá)水平，觀察藥物上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2的表達(dá)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來 抑制腫瘤生長的抗腫瘤作用。
[0026] 1、材料與方法
[0027] 1.1動(dòng)物
[0028] C57BL/6純系小鼠，雄性6~8周，（20±2)g，北京維通利華公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。
[0029] 1.2試劑與樣品
[0030] 甘氨雙唑鈉購自中國藥品生物制品檢定所?；衔铮↖)自制，制備方法見實(shí)施例1。 兔抗鼠 Bax單克隆抗體、兔抗鼠 Bcl-2單克隆抗體(SANTACRUZ公司）、二步法免疫組化檢測(cè)試 劑盒，DAB顯示劑(北京中杉金橋公司）。瘤株Lewis肺癌，Lewis肺癌荷瘤鼠由中科院腫瘤研 究所提供并傳代保種;Lewis肺癌維持在C57BL/6小鼠體內(nèi)，每2周傳代1次。
[0031] 1.3小鼠分組及模型制備
[0032] C57BL/6小鼠隨機(jī)分組，每組12只，分別為模型對(duì)照組(NS組）、甘氨雙唑鈉組、化合 物（I)組、甘氨雙唑鈉與化合物（I)組合物組。每只小鼠右腋皮下接種肺癌瘤株細(xì)胞，建立 lewis肺癌小鼠模型，從接種腫瘤次日開始，分別腹腔注射給藥。生理鹽水(NS)組:0.9%生 理鹽水0 · 2mL，連續(xù)10d;甘氨雙唑鈉組:40mg/(kg · d)，連續(xù)給藥10d;化合物（I)組:40mg/ (kg · d)，連續(xù)給藥10d;甘氨雙唑鈉與化合物（I)組合物組：40mgAkg · d)甘氨雙唑鈉+ 40mg/(kg · d)化合物（I)，連續(xù)給藥10d。末次給藥后24h，小鼠稱重，處死。
[0033] 1.5瘤重測(cè)定實(shí)驗(yàn)
[0034]末次給藥后24h將小鼠稱重，斷頸處死，剝?nèi)×鰤K稱重。
[0035] 抑瘤率（％ )=(模型組平均瘤重-治療組平均瘤重)/模型組平均瘤重X 100%。
[0036] 1.6Lewis肺癌Bcl_2、Bax表達(dá)變化的測(cè)定實(shí)驗(yàn)
[0037]免疫組化法測(cè)定Bcl_2、Bax表達(dá)。瘤塊以石蠟包埋制成4μπι厚的切片，脫蠟、水化 后，3 %Η202滅活內(nèi)源性過氧化物酶，高壓抗原修復(fù)，后續(xù)步驟按照二步法免疫組化檢測(cè)試 劑盒說明書操作。陰性對(duì)照以0.01mol/LPBS(pH=7.4)代替一抗。在光學(xué)顯微鏡下觀察鹽水 對(duì)照組和各給藥實(shí)驗(yàn)組樣本的免疫組化切片。
[0038] 結(jié)果判定:每張切片在5~10個(gè)高倍視野下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100~200 個(gè)細(xì)胞，共1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算每張切片陽性細(xì)胞數(shù)所占比例。Bcl-2在胞漿出現(xiàn)棕黃色染色 為陽性染色。Bax在胞衆(zhòng)和(或)胞膜出現(xiàn)棕黃色染色為陽性染色。
[0039] 1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0040]數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，單因素方差分析。
[0041 ] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0042] 2.1對(duì)Lewis肺癌模型小鼠實(shí)體瘤的影響
[0043]與模型對(duì)照組比較，甘氨雙唑鈉與化合物（I)組合物組瘤重明顯減小(P<0.01)， 抑瘤率明顯增加(p<〇. 01);與模型對(duì)照組比較，甘氨雙唑鈉組、化合物（I)組瘤重減小(p< 0.05)，抑瘤率增加(P<0.05)。結(jié)果見表1。
[0044] 2.2對(duì)Lewis肺癌模型小鼠 Bcl-2及Bax表達(dá)的影響
[0045]與模型對(duì)照組比較，甘氨雙唑鈉與化合物（I)組合物組Bcl-2表達(dá)明顯降低（P< 0.01 )，Bax表達(dá)明顯升高(P < 0.01);與模型對(duì)照組比較，甘氨雙唑鈉組、化合物（I)組Be 1 -2 表達(dá)降低(P<〇.〇5)，Bax表達(dá)升高(P<0.05)。結(jié)果見表1。
[0046] 表1對(duì)小鼠體內(nèi)Lewis肺癌生長及Bcl-2、Bax表達(dá)水平的影響(X 土 s，n = 10)
[0048]肺癌的發(fā)生是一個(gè)涉及多因素多階段的復(fù)雜過程，近年來研究表明，肺癌的發(fā)生 可能是由于細(xì)胞凋亡與增殖失衡造成的。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自身的一種主動(dòng)的、生理性死亡 機(jī)制，細(xì)胞調(diào)亡過程受促調(diào)亡因子和調(diào)亡抑制因子的共同調(diào)節(jié)。其中Bcl-2和Bax屬于Bcl-2 同一家族，與人類多種腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系的基因。Bcl-2是從人類濾泡型非霍奇金B(yǎng)細(xì) 胞淋巴瘤克隆到的原癌基因，其通過穩(wěn)定線粒體膜的功能，阻止線粒體釋放Caspase、凋亡 誘導(dǎo)因子和細(xì)胞色素 C等作用抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-2通過抑制細(xì)胞凋亡而參與腫瘤的發(fā)生。 Bax基因具有拮抗Bcl-2的作用，是促凋亡基因。當(dāng)Bax蛋白大量表達(dá)，并與Bcl-2蛋白形成異 源二聚體時(shí)加速細(xì)胞死亡，Bcl-2和Bax的表達(dá)程度對(duì)決定細(xì)胞接受凋亡信號(hào)后存活與否起 關(guān)鍵作用。目前，多數(shù)研究表明，Bcl-2與Bax的表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)，Bcl-2過量表達(dá)，細(xì)胞存 活;Bax蛋白過量表達(dá)，細(xì)胞死亡。
[0049]結(jié)果表明，甘氨雙唑鈉、化合物（I)單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)肺癌具有抑制作用;甘氨雙唑鈉 和化合物(I)聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)肺癌的抑制效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療肺癌的藥物。
[0050]上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物α)，2. -種甘氨雙唑鈉的藥物組合物，其特征在于:包括甘氨雙唑鈉、如權(quán)利要求1所述的 化合物(I)和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的甘氨雙唑鈉的藥物組合物，其特征在于:藥學(xué)上可以接受的載 體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載 體或潤滑劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的甘氨雙唑鈉的藥物組合物，其特征在于:所述劑型包括片劑、 膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射 劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將澤 蘭粉碎，用65~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯 和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步 驟(a)中正丁醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫8 個(gè)柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫 濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫 得到4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為10:1、5:1和2:1 的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相 硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱體積洗脫液，洗 脫液減壓濃縮得到化合物(I)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)用75%乙醇熱回 流提取，合并提取液。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為AB-8型 大孔吸附樹脂。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中用二氯甲烷代 替乙酸乙酯進(jìn)行萃取，得到二氯甲烷萃取物。9. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求2~4任一所述的甘氨雙唑鈉的藥物組合物在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng) 用。
【文檔編號(hào)】A61K31/4178GK105949263SQ201610403474
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月7日
【發(fā)明人】黃芳
【申請(qǐng)人】黃芳