一種EpCAM特異性嵌合抗原受體及其編碼基因、應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種EpCAM特異性嵌合抗原受體，由人抗EpCAM的單鏈抗體、人抗體IgG1的CH2CH3、CD28的跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)、CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)、CD3ζ的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)串聯(lián)構(gòu)成。本發(fā)明還公開了上述嵌合抗原受體的氨基酸序列和核酸序列。本發(fā)明還公開了上述嵌合抗原受體在制備治療EpCAM相關(guān)腫瘤藥物中的應(yīng)用，即修飾T淋巴細胞，修飾后的淋巴細胞可用于EpCAM相關(guān)腫瘤的治療。
【專利說明】
一種EpCAM特異性嵌合抗原受體及其編碼基因、應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及細胞免疫技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種EpCAM特異性嵌合抗原受體及其編 碼基因、應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)上皮細胞粘附分子屬于黏附分子 家族，也稱為 17445八』6?40、1>〇?-1、1?八、0)326、了八〇5了01、0)17-^、6八733-2等<^?〇厶1是 一種由腫瘤相關(guān) |丐信號轉(zhuǎn)導(dǎo) I (tumor-associated calcium signal transducer 1，TACSTDI) 基因編碼的一個分子量30~40kDa的單次跨膜蛋白，參與調(diào)節(jié)細胞粘附、介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細 胞遷移、增殖和分化等功能（Kurtz JE，DufourP.Adecatumumab:an antl-EpCAM monoclonal antibody,from the bench to the bedside[J].Expert Opin BioITher, 2010,10(6):951-958；Trzpis M,McLaughlin PM,de LeijLM,et al.Epithelial cell adhesion molecule.More than a carcinoma marker andadhesion molecule[J].Am J Pathol，2007，171(2):386-395)。
[0003] EpCAM表達在人部分正常上皮細胞和大多數(shù)惡性上皮細胞表面，目前普遍認為它 對腫瘤的生物學(xué)特性起重要作用。病理情況下，EpCAM幾乎表達于所有的腺癌中，包括結(jié)直 腸腺癌、胃腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺腺癌、前列腺癌、胰腺癌以及肝細胞癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤 (Kurtz JE,Dufour P.Adecatumumab: an antl-EpCAM monoclonal antibody , from thebench to the bedside[j].Expert Opin BioITher,2010,10(6):951_958)。研究發(fā)現(xiàn) EpCAM也是一些腫瘤干細胞的標記物，Kimura等的研究發(fā)現(xiàn)EpCAM陽性的肝癌干細胞能夠誘 導(dǎo)免疫缺陷的小鼠發(fā)生腫瘤（Kimura 0，Takahashi T，Ishii N，et al .Characterization oftheepithe 1ia 1 cell adhesion molecule(EpCAM) + cell population in hepatocellularcarcinoma cell lines[J].Cancer Sci，2010，101(10):2145-2155·)〇將 肝細胞癌EpCAM陽性及陰性亞群細胞分別注射到免疫缺陷的小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示形成腫瘤 所需的癌細胞數(shù)EpCAM陽性者遠少于EpCAM陰性者，且注射EpCAM陽性癌細胞的小鼠所產(chǎn)生 的腫瘤比注射EpCAM陰性者更大，說明EpCAM陽性的癌細胞致瘤性比EpCAM陰性的癌細胞大。 肝細胞癌細胞系中EpCAM陽性的亞群克隆速率遠遠大于EpCAM陰性的亞群。研究還發(fā)現(xiàn)， EpCAM陽性的癌細胞可以分化為EpCAM陽性和陰性的細胞，而EpCAM陰性的癌細胞只能分化 為EpCAM陰性的細胞，說明EpCAM陽性的癌細胞具有多項分化的潛能。
[0004] EpCAM的表達與腫瘤的預(yù)后相關(guān)，可作為腫瘤靶向治療的一個靶位點。EpCAM的抗 體目前在歐洲得到FDA批準治療癌性腹水，但目前還沒有EpCAM的CART在臨床應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于【背景技術(shù)】存在的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種EpCAM特異性嵌合抗 原受體。
[0006] 本發(fā)明的目的還在于提供編碼上述嵌合抗原受體的基因。
[0007] 本發(fā)明的目的還在于提供上述嵌合抗原受體的應(yīng)用。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出的一種EpCAM特異性嵌合抗原受體，其胞外抗原結(jié) 合區(qū)為人抗EpCAM的單鏈抗體。
[0009] 優(yōu)選地，所述人抗EpCAM的單鏈抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 優(yōu)選地，所述嵌人抗EpCAM的單鏈抗體的重鏈和輕鏈分子之間有個連接肽，其氨基 酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011] 優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體的氨基末端含有一個信號肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0012] 優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體由人抗EpCAM的單鏈抗體、人抗體IgGl的CH2CH3、CD28 的跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)、CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)、CD3G的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)串聯(lián)構(gòu)成。
[0013 ]優(yōu)選地，所述⑶28的跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)、CD 137胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)、⑶3ζ的胞內(nèi)信 號結(jié)構(gòu)串聯(lián)構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域為Τ細胞共刺激信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)。
[0014] 優(yōu)選地，所述Τ細胞共刺激信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列如SEQ ID Ν0.4所示。
[0015] 優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0016] 本發(fā)明還提出的編碼上述EpCAM特異性嵌合抗原受體的基因，其核酸序列如SEQ ID NO .6所示。
[0017] 本發(fā)明還提出的上述EpCAM特異性嵌合抗原受體在制備治療EpCAM相關(guān)腫瘤藥物 中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明根據(jù)2001年發(fā)表的人源抗人EpCAM抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)序列(Raum， 2001Cancer Immunol Immunother. Stefanie 2002，Int .J.Cancer)，經(jīng)過密碼子優(yōu)化，基因 合成抗EpCAM的ScFv序列，并將合成ScFv克隆到pSFG-CH2CH3-CD28-CD137-CD3G中，即構(gòu)建 成本發(fā)明的 EpCAM-scFv-CH2CH3-CD28-CDl 37-〇)3ζ 嵌合抗原受體。
[0019]本發(fā)明利用嵌合抗原受體與逆轉(zhuǎn)病毒包裝質(zhì)粒PeqPam3及RD114env在293Τ細胞包 裝成逆轉(zhuǎn)病毒，利用該病毒感染T淋巴細胞。利用Elisa檢測CAR-Τ細胞在抗原刺激下IFN-γ 的分泌，及通過流式檢測對EpCAM陽性的腫瘤細胞的殺傷作用。
[0020] 本發(fā)明公布EpCAM特異性的嵌合抗原受體的結(jié)構(gòu)，和體外感染T淋巴細胞的技術(shù)。 修飾后的T淋巴細胞釋放IFN- γ等殺傷腫瘤細胞。EpCAM特異性的嵌合抗原受體可以用于 EpCAM相關(guān)腫瘤(如腺癌、肝細胞癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤等)的靶向治療。
【附圖說明】
[0021] 圖1為本發(fā)明提出的EpCAM特異性嵌合抗原受體的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0022] 圖2為本發(fā)明所得EpCAM-scFv的PCR產(chǎn)物的電泳圖。
[0023]圖3為本發(fā)明所得EpCAM特異性嵌合抗原受體的電泳圖。
[0024]圖4為流式檢測EpCAM特異性CAR-Τ細胞中CAR分子的表達的結(jié)果圖。
[0025]圖5為流式細胞分析腫瘤細胞和T細胞的比例結(jié)果圖。
[0026]圖6為本發(fā)明所得嵌合抗原受體EpCAM特異性CAR-Τ細胞與淋巴瘤細胞的MTT檢測 結(jié)果圖。
[0027] 圖7為ELISA檢測本發(fā)明所得CAR-Τ細胞在受到EpCAM刺激后IFN- γ和IL2的表達結(jié) 果圖。
【具體實施方式】
[0028]下面，通過具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細說明。
[0029]實施例1 :EpCAM特異性嵌合抗原受體逆轉(zhuǎn)病毒載體的構(gòu)建 [0030]本發(fā)明提出的一種EpCAM特異性嵌合抗原受體，由人抗EpCAM的單鏈抗體、人抗體 IgGl的CH2CH3、CD28的跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)、CD137的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)、CD3G的胞內(nèi)信號結(jié) 構(gòu)串聯(lián)構(gòu)成，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0031] 1、利用2001年發(fā)表的人源抗人EpCAM單克隆抗體序列，選出VH和VL的序列，用于設(shè) 計CAR載體中的scFv序列，采用金斯瑞生物技術(shù)公司OptimumGeneTM基因設(shè)計軟件對密碼子 進行進一步優(yōu)化，在優(yōu)化的序列兩端分別加上NcoI，BAMHI酶切位點，優(yōu)化后的序列由南京 金斯瑞生物技術(shù)公司完成基因合成，合成后的序列克隆在PCDNA3載體，質(zhì)粒命名為EpCAM-scFv-pCDNA3〇
[0032] 其中插入的EpCAM-scFv序列部分可以經(jīng)由PCR進行擴增得到，接著進行檢測，如圖 2所示，其中條帶1為EpCAM-scFv的PCR產(chǎn)物，750bp左右;條帶2為100bp的參照條帶。
[0033] 2、EpCAM-scFv-pCDNA3質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Ncol和BAMHI酶切，酶切體系如下：2yg EpCAM-scFv-pCDNA3、lyL NcoI、lyL BamHI、2yL 10X酶切緩沖液，用水補到20yL，37°C水浴 中過夜，酶切產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外下切取目的條帶，采用DNA凝膠回收試劑 盒(AXYGEN公司）回收目的片段;用同樣的方法Ncol和BAMHI酶切pSFG-CH2CH3-CD28-CD137-CD3G載體，用瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段。將回收后的EpCAM-ScFv與酶切載體通過 T4DNA連接酶連接，反應(yīng)體系如下：2yL EpCAM-ScFv、2yL載體酶切產(chǎn)物、lyL 10X連接緩沖 液，lyL連接酶，用水補到10yL，16 °C水浴中過夜。取連接產(chǎn)物加入到DH5a感受態(tài)中[參考《分 子克隆》第三版中大腸桿菌感受態(tài)制備(CaCl2法）]，放置37°C細菌培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。挑取 單個菌落，擴大培養(yǎng)，提取陽性克隆的質(zhì)粒，經(jīng)酶切（圖3)和測序，將正確的載體命名為 EpCAM-scFv-CH2CH3-CD28-CDl 37-〇)3ζ，即本發(fā)明提出的EpCAM特異性嵌合抗原受體。
[0034]將所得EpCAM特異性嵌合抗原受體進行檢測，其結(jié)果如圖3所示，其中條帶1為 100bp的對照條帶，條帶2為所得EpCAM特異性嵌合抗原受體。
[0035]實施例2: EpCAM特異性嵌合抗原受體修飾的T淋巴細胞的制備 [0036] 1.含EpCAM特異性嵌合抗原受體逆轉(zhuǎn)病毒的包裝
[0037]用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒內(nèi)（天根生物）的操作說明書提取逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝載 體PRD114和EpCAM-scFv-CH2CH3-CD28-CD137-CD3G逆轉(zhuǎn)錄病毒載體共轉(zhuǎn)染到293T細胞中， 轉(zhuǎn)染后48h收集細胞上清，4000rpm離心10min，去除上清中的細胞及細胞碎片。用0.45μπι的 濾膜過濾，分裝凍存，備用。
[0038] 2. Τ淋巴細胞的制備
[0039]采取20mL健康志愿者的新鮮抗凝血，用淋巴分離液(GE公司）分立外周血單核細胞 (PBMC)。分離后的細胞用CD3和CD28平板刺激48h，用T淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551(TAKARA公 司）加3%自身血漿進行誘導(dǎo)，得到T淋巴細胞。
[0040] 3.CAR-T細胞的制備
[0041 ] 用50yg/mL的RetroNectin(TAKARA公司）包被非組織培養(yǎng)板24孔板，每孔加入500μ L，4°C過夜。每孔再加入500yL病毒上清，37°C孵育30min。去除病毒上清，再加入500yL病毒 上清，37°C孵育30min，除病毒上清，每孔加入1.5mL病毒上清，再加入0.5mL稀釋后的T淋巴 細胞，從而獲得 EpCAM-scFv-CH2CH3-CD28-CD137-CD3G 細胞，即 EpCAM 特異性CAR-T 細胞。 [0042] 4.流式檢測EPCAM特異性CAR-T細胞中CAR分子的表達
[0043] 將CAR-T細胞加入5yL FITC標記的抗Fc抗體(Jackson公司），37°C孵育lh后，進行 流式檢測，檢測結(jié)果如圖4所示:其中左圖為對照的T淋巴細胞，右圖為感染嵌合抗原受體的 逆轉(zhuǎn)錄病毒的T淋巴細胞，由圖4可知:本方法所得CAR-T細胞的效率大于90%。
[0044]實施例3:嵌合抗原受體EpCAM特異性CAR-T細胞對EpCAM相關(guān)腫瘤的殺傷作用 [0045] 1. CAR-T細胞對腫瘤的殺傷力檢測
[0046] 將EpCAM陽性的結(jié)腸癌細胞HT-29用培養(yǎng)基調(diào)整到5 X 106/mL，每孔50yL，按效應(yīng)細 胞和靶細胞比為4:1，加入瘤細胞2.5 X 105個，待細胞完全貼壁后，收集T細胞和CAR-T細胞， 調(diào)整細胞濃度為1.25X 106/mL，每孔50yL，然后分別進行流式細胞(培養(yǎng)24h)和MTT檢測(培 養(yǎng)4h)。
[0047]首先，收集細胞進行CD3的染色，進行流式細胞分析腫瘤細胞(CD3J和T細胞(CD3+) 的比例，其結(jié)果如圖5所示。由圖5可知:本發(fā)明所得嵌合抗原受體EpCAM特異性CAR-T細胞能 有效殺傷結(jié)腸癌細胞。
[0048] 其次，同樣的實驗棄上清加入100yL稀釋的CCK8,孵育4小時，酶標儀檢測0D450的 吸光值。其檢測結(jié)果如圖6所示，CAR-T細胞對EpCAM表達的腫瘤的殺傷率高于EpCAM不表達 的腫瘤細胞;CAR-T細胞對相關(guān)腫瘤殺傷作用高于T細胞，高于單純培養(yǎng)基。
[0049] 2.ELISA檢測CAR-T細胞在受到EPCAM刺激后IFN-γ和IL2的表達 [0050] 將結(jié)腸癌細胞HT-29用培養(yǎng)基調(diào)整到5X106/mL，每孔50yL，加入結(jié)腸癌細胞HT-29 2.5 X 105個，待細胞完全貼壁后，收集T和CAR-T細胞，調(diào)整細胞濃度為1 X 106/mL，每孔50yL， 培養(yǎng)24h。收集上清液，利用ELISA試劑盒檢測IFN- γ和IL2的表達。
[0051 ]其結(jié)果如圖7所示，EpCAM特異性嵌合抗原受體修飾的Τ淋巴細胞在收到EpCAM陽性 的結(jié)腸癌細胞HT-29刺激后表達和分泌IFN- γ和IL2。
[0052]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其 發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種EpCAM特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗原受體的胞外抗原結(jié)合區(qū) 為人抗EpCAM的單鏈抗體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述EpCAM特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述人抗EpCAM的單鏈 抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述EpCAM特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌人抗EpCAM 的單鏈抗體的重鏈和輕鏈分子之間有個連接肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述EpCAM特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗 原受體的氨基末端含有一個信號肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述EpCAM特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗 原受體由人抗EpCAM的單鏈抗體、人抗體I gG 1的CH2CH3、CD28的跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)、 CDl 37的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)、CD3G的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)串聯(lián)構(gòu)成。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述EpCAM特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述CD28的 跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)、CD137胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)、CD3G的胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)串聯(lián)構(gòu)成的結(jié)構(gòu)域為T 細胞共刺激信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述EpCAM特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述T細胞共刺激信號 傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述EpCAM特異性嵌合抗原受體，其特征在于，所述嵌合抗 原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。9. 編碼如權(quán)利要求1-8任一項所述EpCAM特異性嵌合抗原受體的基因，其特征在于，其 核酸序列如SEQ ID NO.6所示。10. 如權(quán)利要求1-8任一項所述EpCAM特異性嵌合抗原受體在制備治療EpCAM相關(guān)腫瘤 藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/62GK105949323SQ201610483048
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】宋曉彤, 許國貞, 劉振云
【申請人】安徽未名細胞治療有限公司