靶向gpc3的嵌合抗原受體及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及靶向GPC3的嵌合抗原受體及其用途。具體而言，本發(fā)明提供一種多核苷酸序列，所述多核苷酸序列選自：(1)含有依次連接的CD8抗原的前導(dǎo)肽的編碼序列、抗GPC3單鏈抗體的編碼序列、人CD8α鉸鏈區(qū)的編碼序列、人CD8跨膜區(qū)的編碼序列、人41BB胞內(nèi)區(qū)的編碼序列、人CD3ζ胞內(nèi)區(qū)的編碼序列和任選的EGFR序列的含胞外結(jié)構(gòu)域III和胞外結(jié)構(gòu)域IV的片段的編碼序列的多核苷酸序列；和(2)(1)所述多核苷酸序列的互補序列。本發(fā)明提供該多核苷酸序列編碼的CAR及表達該CAR的T細胞。本發(fā)明制備的CAR?T細胞對特異性腫瘤細胞具強烈的殺傷功能，效靶比是20比1的情況下，殺傷效率超過90％。
【專利說明】
靶向GPC3的嵌合抗原受體及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于嵌合抗原受體領(lǐng)域，具體涉及靶向GPC3的嵌合抗原受體及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝癌在世界上最流行的腫瘤中位居第五并且在癌癥相關(guān)死亡的最常見原因中位 居第三（Bosch等，Gastroenterology 1 277: Sf5_Sl6，2〇〇4 ;El_Serag等，Gastroenterology 1 32:2557 76,2007)。根據(jù)美國癌癥學會，肝細胞癌(HCC)占肝癌病例的約75%，往往直到晚 期肝癌才會有癥狀。外科手術(shù)是肝癌的標準治療，因為這種類型的癌癥對大多數(shù)的化療藥 物反應(yīng)不好。因此，迫切需要開發(fā)具有不同作用機制的新藥物。
[0003]磷脂酰肌醇蛋白多糖3(Glypican 3，GPC3)是一種細胞表面蛋白，屬于硫酸乙酰肝 素蛋白多糖家族。GPC3基因編碼產(chǎn)生70kDa左右的前體核心蛋白，該前體蛋白能夠被弗林蛋 白酶(furin)剪切產(chǎn)生40kDa左右的可溶性的能夠進入血液的氨基端(N末端)肽和30kDa左 右含有2個硫酸乙酰肝素(HS)糖鏈的膜結(jié)合的竣基端(C末端)肽(Capurro等，Dev Ce 1114: 700 711，2008;Capurro等，Cancer Res 65:6245_6254,2005)〇
[0004] GPC3高度表達于胎兒肝臟，而不表達于正常成年人的肝組織，但在肝細胞肝癌中 恢復(fù)表達，與肝癌的發(fā)生發(fā)展有十分密切的關(guān)系，不僅在肝癌發(fā)生的早期檢出率較高，而且 隨著肝癌的發(fā)展，其檢出率也隨之增高。而GPC3的表達在肝腺癌，膽管細胞癌，肝轉(zhuǎn)移癌和 12種常見實體瘤和21種非肝癌細胞系中均未檢測出。此外，GPC3也在例如黑色素瘤，卵巢透 明細胞癌、卵黃囊瘤、神經(jīng)母細胞瘤等腫瘤中表達。考慮到GPC3在肝細胞肝癌，黑色素瘤等 腫瘤中特異性的高表達，其被認為是腫瘤免疫治療的一個候選靶標。
[0005] 嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR_T)T細胞是指經(jīng)基因修 飾后，能以MHC非限制性方式識別特定目的抗原，并且持續(xù)活化擴增的T細胞。2012年國際細 胞治療協(xié)會年會中指出生物免疫細胞治療已經(jīng)成為手術(shù)、放療、化療外的第四種治療腫瘤 的手段，并將成為未來腫瘤治療必選手段。CAR-T細胞回輸治療是當前腫瘤治療中最明確有 效的免疫治療形式。大量研究表明，CAR-T細胞可以有效的識別腫瘤抗原，引起特異性的抗 腫瘤免疫應(yīng)答，顯著改善患者的生存狀況。
[0006] 嵌合抗原受體(CAR)是CAR-T的核心部件，賦予Τ細胞HLA非依賴的方式識別腫瘤抗 原的能力，這使得經(jīng)過CAR改造的T細胞相較于天然T細胞表面受體TCR能夠識別更廣泛的目 標。CAR的基礎(chǔ)設(shè)計中包括一個腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen，TAA)結(jié)合區(qū)（通 常來源于單克隆抗體抗原結(jié)合區(qū)域的scFV段），一個胞外鉸鏈區(qū)，一個跨膜區(qū)和一個胞內(nèi)信 號區(qū)。目標抗原的選擇對于CAR的特異性、有效性以及基因改造 T細胞自身的安全性來講都 是關(guān)鍵的決定因素。
[0007] 隨著嵌合抗原受體T細胞(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR_T)技術(shù)的不 斷發(fā)展，目前CAR-T主要可劃分為四代。
[0008] 第一代CAR-T細胞由胞外結(jié)合區(qū)-單鏈抗體(single chain fragment variable， scFV)、跨膜區(qū)（transmembrane region，TM)和胞內(nèi)信號區(qū)-免疫受體酪氨酸活化基序 (immunoreceptor tyrosine based activation motif，ITAM)組成，其中嵌合抗原受體各 部分按如下形式連接：scFv-TM-CD3G。第一代CAR雖然能夠看到一些特異性的細胞毒性，但 2006年對其進行臨床試驗總結(jié)的時候卻發(fā)現(xiàn)療效差強人意。究其原因是因為第一代CAR-T 細胞在病人體內(nèi)很快就會耗竭，其持久性很差，以至于CAR-T細胞還沒有來得及接觸到大量 的腫瘤細胞時就已經(jīng)凋亡了該種CAR-T細胞可以激發(fā)抗腫瘤的細胞毒性效應(yīng)，但是細胞因 子分泌比較少，但其在體內(nèi)的存活期較短不能激發(fā)持久的抗腫瘤效應(yīng)〔Zhang T等， Chimeric NKG2D-modified T cells inhibit systemic T-cell lymphoma growth in a manner involving multiple cytokines and cytotoxic pathways,Cancer Res 2007,67 (22)：11029-11036)〇
[0009 ]第二代CAR-T細胞優(yōu)化CAR設(shè)計中T細胞活化信號區(qū)仍然是研究的熱點。T細胞的完 全活化有賴于雙信號和細胞因子的作用。其中第一信號為特異性信號，由TCR識別抗原遞呈 細胞表面的抗原肽-MHC復(fù)合物所啟動;第二信號為協(xié)同刺激信號。早在1998年就出現(xiàn)了第 二代CAR(Finney HM等，J Immunol. 1998; 161 (6):2791-7)。第2代CAR在胞內(nèi)信號肽區(qū)添加 了一個協(xié)同刺激分子，即把協(xié)同刺激信號組裝到CAR里面，能夠更好的為CAR-T細胞提供活 化信號，這樣CAR識別腫瘤細胞后能夠同時活化協(xié)同刺激分子和胞內(nèi)信號，實現(xiàn)雙重活化， 能明顯提高T細胞增殖分泌能力和抗腫瘤效應(yīng)。第一個被詳細研究的T細胞共刺激信號受體 是CD28,它能夠與靶細胞表面的B7家族成員結(jié)合。CD28的共刺激能夠促進T細胞的增殖，IL-2的合成和表達以及增強T細胞抵抗凋亡的能力。隨后又出現(xiàn)了 CD134(0X40)和41BB(4-1BB) 等共刺激分子，以提高T細胞的細胞毒性、增殖活性，維持T細胞應(yīng)答，延長T細胞存活時間 等。這樣的第二代CAR在隨后的臨床試驗中產(chǎn)生了意想不到的效果，從2010年起基于第二代 CAR的臨床報道屢次引發(fā)震動，特別是對于復(fù)發(fā)性、難治性的ALL病人，其完全緩解率高達 90%以上。
[0010] 第三代CAR信號肽區(qū)整合2個以上的協(xié)同刺激分子，可使T細胞持續(xù)活化增殖，細胞 因子持續(xù)分泌，T細胞殺傷腫瘤細胞的能力更加顯著，即新一代的CAR可獲得更強的抗腫瘤 應(yīng)答（？1116]\^等，]\1〇111161.，2005，12(5) :933-941)。最典型的就是1]?611〇311幾116在 CD28刺激因子的作用下又加了一個41BB的刺激因子。
[0011] 第四代的CAR-T細胞則加入了細胞因子或共刺激配體，例如四代CAR可以產(chǎn)生IL-12,其能夠調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境-增加 T細胞的激活，同時激活固有免疫細胞使其發(fā)揮作用來清 除革抗原陰性的癌細胞，從而達到雙向調(diào)節(jié)的作用〔Chmielewski M，Abken H. TRUCKs: the fourth generation of CARs,Expert Opin Biol Ther.，2015;15(8):1145-54〕。
[0012] CAR-T細胞的一大優(yōu)點是它們是活性藥物，一旦輸入，生理機制會調(diào)控T細胞的平 衡、記憶形成和抗原驅(qū)動的擴增。然而，這種治療尚未完善，T細胞會脫靶而攻擊其他的組 織，或擴增量過高，超出治療所需。鑒于C A R - T細胞已被納入標準治療范圍，設(shè)計病人或藥物 可控的啟動或關(guān)閉機制來調(diào)控CAR-T細胞的存在是非常有用的。由于技術(shù)原因，關(guān)閉機制更 易應(yīng)用于T細胞。作為其中之一，iCas9系統(tǒng)正在臨床研究當中。細胞在表達iCas9時，使用小 分子化合物可誘導(dǎo)iCas9前體分子形成二聚體，激活凋亡途徑，從而實現(xiàn)清除細胞的目的。 在移植物抗宿主病中，小分子AP1903已被用于誘導(dǎo)iCas9二聚體和清除T細胞，表明了這種 方法的可行性（Making Better Chimeric Antigen Receptors for Adoptive T-cell Therapy，Clin Cancer Res;22(8)，2016年4月15日）〇
[0013] 另外，還可利用臨床上已經(jīng)使用的清除性抗體，使CAR-T細胞同時表達這些抗體針 對的蛋白，如tEGFR，在治療相關(guān)的毒性反應(yīng)產(chǎn)生或是治療已經(jīng)完成后，通過給予抗體藥物 清除相應(yīng)的CAR-T細胞（Rational development and characterization of humanized anti-EGFR variant III chimeric antigen receptor T cells for glioblastoma,Sci Transl Med 2015；7：275ra22)〇
[0014] 特異性識別人GPC3的C末端表位的單克隆抗體己被公開在如，中國專利文獻 CN101186650A。此外據(jù)文獻Advances in Liver Cancer Antibody Therapies:A Focus on 617口化&113311(1]^8〇讓61丨11，8丨〇0^^8,2011年10月1日，25(5):275-284)，其他己知特異性 識別C末端表位的單克隆抗體包括GC33，其針對GPC3的抗原決定簇位于C端524-563位氨基 酸殘基。15例患者的GPC3-GC33抗體在治療HCC的I期臨床試驗中觀察到明顯的治療效果，推 測裸的抗體在對抗人的肝癌不能起到很好的療效。一個關(guān)于GPC3衍生肽疫苗的I期臨床試 驗所獲得的結(jié)果顯示，肝癌患者的中位總生存期與GPC3特異性CTL的頻率呈正相關(guān)，這項研 究表明GPC3針對性的T細胞可能是肝癌治療潛在靶標。
[0015] 本申請是以GPC3-GC33的scFV的重鏈和輕鏈作為CAR的結(jié)構(gòu)，同時也引入了tEGFR 結(jié)構(gòu)（截短的EGFRhtEGFR缺乏細胞外的N末端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)受體酪氨酸激酶活 性，但保留了天然氨基酸序列，屬于I型跨膜細胞表面定位，其空間構(gòu)象可與藥物級別的抗 EGFR單克隆抗體西妥昔單抗緊密結(jié)合(A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection，in vivo tracking,and ablation of engineered cells，BL00D，2011年8 月4日，118:1255-1263) JEGFR的主要功能:可以作為細胞表面的標記，同時也適合T細胞的 體內(nèi)追蹤可通過流式和免疫組化檢測;也可以在體內(nèi)被妥西單抗(cetuximab)清除。本發(fā)明 引入此tEGFR結(jié)構(gòu)既可以在使CAR-T細胞體內(nèi)進行很好的被示蹤，更重要的是此結(jié)構(gòu)可以作 為CAR-T細胞的安全開關(guān)：即不想其發(fā)揮作用時可加入妥西單抗，安全有效的控制輸注的針 對GPC3靶點的CAR-T細胞在體內(nèi)發(fā)揮作用。為臨床實驗和臨床治療奠定良好的基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明第一方面提供一種多核苷酸序列，所述多核苷酸序列選自：
[0017] (1)含有依次連接的CD8抗原的前導(dǎo)肽的編碼序列、抗GPC3單鏈抗體的編碼序列、 人CD8a鉸鏈區(qū)的編碼序列、人CD8跨膜區(qū)的編碼序列、人41BB胞內(nèi)區(qū)的編碼序列、人CD3G胞 內(nèi)區(qū)的編碼序列和任選的EGFR的含胞外結(jié)構(gòu)域III和胞外結(jié)構(gòu)域IV的片段的編碼序列的多 核苷酸序列;和
[0018] (2)(1)所述多核苷酸序列的互補序列。
[0019]在一個或多個實施方案中，所述⑶8抗原前導(dǎo)肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第1-21位氨基酸所示。
[0020]在一個或多個實施方案中，所述抗GPC3單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1第22-134位氨基酸所示。
[0021 ]在一個或多個實施方案中，所述抗GPC3單鏈抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列可如 SEQ ID NO: 1第150-264位氨基酸所示。
[0022]在一個或多個實施方案中，所述人CD8a鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第 265-311位氨基酸所示。
[0023] 在一個或多個實施方案中，所述人⑶8跨膜區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第312- 333位氨基酸所示。
[0024]在一個或多個實施方案中，所述人41BB胞內(nèi)區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第 334-381位氨基酸所示。
[0025]在一個或多個實施方案中，所述人CD3G胞內(nèi)區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第 382-492位氨基酸所示。
[0026]在一個或多個實施方案中，所述EGFR的片段含有EGFR的胞外結(jié)構(gòu)域III、胞外結(jié)構(gòu) 域IV以及跨膜區(qū)。
[0027]在一個或多個實施方案中，由EGFR的胞外結(jié)構(gòu)域III、胞外結(jié)構(gòu)域IV以及跨膜區(qū)組 成。
[0028]在一個或多個實施方案中，所述EGFR的片段含有人EGFR的第310-646位氨基酸序 列。
[0029]在一個或多個實施方案中，所述EGFR的片段由人EGFR的第310-646位氨基酸序列 組成。
[0030] 在一個或多個實施方案中，所述EGFR片段的氨基酸序列如SEQ ID N0:2第541-875 位氨基酸所示。
[0031] 在一個或多個實施方案中，所述多核苷酸序列編碼如SEQ ID N0: 2第1-492位所述 的氨基酸序列，或編碼如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
[0032]在一個或多個實施方案中，所述多核苷酸序列含有SEQ ID NO: 1或其第1-1476位 所示的核苷酸序列，或由SEQ ID NO: 1或其第1-1476位所示的核苷酸序列組成。
[0033]本發(fā)明第二方面提供一種融合蛋白，所述融合蛋白選自：
[0034] (1)含有依次連接的CD8抗原的前導(dǎo)肽、抗GPC3單鏈抗體、人CD8a鉸鏈區(qū)、人CD8跨 膜區(qū)、人41BB胞內(nèi)區(qū)和人CD3G胞內(nèi)區(qū)的融合蛋白；和
[0035] (2)在（1)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且保留活 化T細胞活性的由（1)衍生的融合蛋白。
[0036] 在一個或多個實施方案中，所述抗GPC3單鏈抗體為抗GPC3單克隆抗體GC33。
[0037]在一個或多個實施方案中，所述⑶8抗原前導(dǎo)肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第1-21位氨基酸所示。
[0038]在一個或多個實施方案中，所述抗GPC3單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 1第22-134位氨基酸所示。
[0039]在一個或多個實施方案中，所述抗GPC3單鏈抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列可如 SEQ ID NO: 1第150-264位氨基酸所示。
[0040]在一個或多個實施方案中，所述人CD8a鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第 265-311位氨基酸所示。
[0041 ]在一個或多個實施方案中，所述人⑶8跨膜區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第312-333位氨基酸所示。
[0042]在一個或多個實施方案中，所述人41BB胞內(nèi)區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第 334-381位氨基酸所示。
[0043]在一個或多個實施方案中，所述人CD3G胞內(nèi)區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第 382-492位氨基酸所示。
[0044]在一個或多個實施方案中，所述EGFR的片段含有EGFR的胞外結(jié)構(gòu)域III、胞外結(jié)構(gòu) 域IV以及跨膜區(qū)。
[0045]在一個或多個實施方案中，由EGFR的胞外結(jié)構(gòu)域III、胞外結(jié)構(gòu)域IV以及跨膜區(qū)組 成。
[0046]在一個或多個實施方案中，所述EGFR的片段含有人EGFR的第310-646位氨基酸序 列。
[0047]在一個或多個實施方案中，所述EGFR的片段由人EGFR的第310-646位氨基酸序列 組成。
[0048] 在一個或多個實施方案中，所述EGFR片段的氨基酸序列如SEQ ID N0:2第541-875 位氨基酸所示。
[0049]在一個或多個實施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第1-492位 氨基酸所示。
[0050]本發(fā)明第三方面提供一種核酸構(gòu)建物，所述核酸構(gòu)建物含有本文所述的多核苷酸 序列。
[0051 ]在一個或多個實施方案中，所述核酸構(gòu)建物為載體。
[0052]在一個或多個實施方案中，所述核酸構(gòu)建物為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，含有復(fù)制起始位 點，3 ' LTR，5 ' LTR，以及本文所述的多核苷酸序列。
[0053]本發(fā)明第四方面提供一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒含有本文所述的核酸構(gòu)建 物，優(yōu)選含有所述載體，更優(yōu)選含有所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
[0054]本發(fā)明第五方面提供一種基因修飾的T細胞，所述細胞含有本文所述的多核苷酸 序列或核酸構(gòu)建物，或感染了本文所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，或穩(wěn)定表達本文所述的融合蛋白和 任選的EGFR的含胞外結(jié)構(gòu)域III、胞外結(jié)構(gòu)域IV和任選的跨膜區(qū)的片段。
[0055] 本發(fā)明第六方面提供一種藥物組合物，所述藥物組合物含有本文所述的基因修飾 的T細胞和藥學或生理學上可接受載體、稀釋劑或賦形劑。
[0056] 本發(fā)明第七方面提供本文所述的多核苷酸序列、融合蛋白、核酸構(gòu)建物或逆轉(zhuǎn)錄 病毒在制備活化的T細胞中的應(yīng)用。
[0057] 本發(fā)明第八方面提供本文所述的多核苷酸序列、融合蛋白、核酸構(gòu)建物、逆轉(zhuǎn)錄病 毒、或基因修飾的T細胞或其藥物組合物在制備治療GPC3介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途。 [0058]在一個或多個實施方案中，所述GPC3介導(dǎo)的疾病為肝癌。
【附圖說明】
[0059]圖1為實施例1制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體GPC3-41BBZ的結(jié)構(gòu)示意圖。其中，VL為 輕鏈可變區(qū)；Lk為接頭(G4S)3;Vh為重鏈可變區(qū);Η表示CD8a鉸鏈區(qū)；TM為CD8a跨膜區(qū)；41BB表 示41BB胞內(nèi)區(qū)；⑶3z表示⑶3ζ胞內(nèi)區(qū)；SP表示前導(dǎo)序列。
[0060]圖2為實施例1制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體GPC3-41BBZ的部分測序結(jié)果峰值圖。 [00611圖3為實施例2制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體GPC3-tEGFR的結(jié)構(gòu)示意圖。其中，VL為 輕鏈可變區(qū)；Lk為接頭(G4S) 3;Vh為重鏈可變區(qū);Η表示CD8a鉸鏈區(qū)；TM為CD8a跨膜區(qū)；41BB表 示41BB胞內(nèi)區(qū)；⑶3z表示⑶3ζ胞內(nèi)區(qū)；2A為T2A多肽;SP表示前導(dǎo)序列。
[0062]圖4為實施例2制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體GPC3-tEGFR的部分測序結(jié)果峰值圖。 [0063] 圖5為流式細胞儀顯示逆轉(zhuǎn)錄病毒感染T細胞72小時的GPC3-GC33-CAR+表達效率。 [0064] 圖6為流式細胞儀顯示逆轉(zhuǎn)錄病毒感染T細胞72小時的GPC3-GC33-tEGFR-CAR+表 達效率。
[0065] 圖7為制備3天的GPC3-GC33-CART細胞與靶細胞共培養(yǎng)5小時INF- γ的分泌。
[0066] 圖8為制備3天的GPC3-GC33-tEGFR-CART細胞與靶細胞共培養(yǎng)5小時INF- γ的分 泌。
[0067]圖9為制備3天的GPC3-GC33-CART細胞與靶細胞共培養(yǎng)5小時后對腫瘤細胞的殺傷 作用。
[0068] 圖10為制備3天的GPC3-GC33-tEGFR-CART細胞與靶細胞共培養(yǎng)5小時后對腫瘤細 胞的殺傷作用。
【具體實施方式】
[0069]本發(fā)明提供一種靶向GPC3的嵌合抗原受體(CAR)。該CAR含有依次連接的抗GPC3單 鏈抗體、人CD8a鉸鏈區(qū)、人CD8跨膜區(qū)、人41BB胞內(nèi)區(qū)、人CD3G胞內(nèi)區(qū)。
[0070]適用于本發(fā)明的抗GPC3單鏈抗體可來自特異性識別人GPC3的C末端表位的單克隆 抗體。這類單克隆抗體包括但不限于CN101186650A以及文獻〔Advances in Liver Cancer Antibody Therapies：A Focus on Glypican_3and Mesothelin，BioDrugs，2011年10月1 日；25(5): 275-284〕中公開的抗體，如針對GPC3的抗原決定簇位于C端524-563位氨基酸殘 基的GC33和hGC33單克隆抗體，以及GPC3-C02和1G12單克隆抗體等。其它識別GPC3的C末端 表位的單克隆抗體也可以合適的方式運用于本發(fā)明。這些被公開的單克隆抗體可以用于制 備本發(fā)明CAR中的單鏈抗體部分。
[0071]在某些實施方案中，適用于本發(fā)明的抗GPC3單鏈抗體含有特異性識別人GPC3的C 末端表位的單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)。任選地，所述輕鏈可變區(qū)和重鏈可變 區(qū)可通過接頭序列連接在一起。在某些實施方案中，所述單克隆抗體是GC33。在某些實施方 案中，所述抗GPC3單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:2的第22 -134位氨基 酸殘基所示。在其它實施方案中，所述抗GPC3單鏈抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:2的第150 - 264位氨基酸殘基所示。
[0072] 適用于本發(fā)明的人CD8a鉸鏈區(qū)的氨基酸序列可如SEQ ID N0: 2第265-311位氨基 酸所示。
[0073]適用于本發(fā)明的人CD8跨膜區(qū)可以是本領(lǐng)域常用于CAR的各種人CD8跨膜區(qū)序列。 在某些實施方案中，所述人CD8跨膜區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0: 2第312-333位氨基酸所 不。
[0074]適用于本發(fā)明的41BB可以是本領(lǐng)域已知的各種用于CAR的41BB。作為示范性例子， 本發(fā)明使用SEQ ID N0:2第334-381位氨基酸序列所示的41BB。
[0075] 適用于本發(fā)明的人CD3G胞內(nèi)區(qū)可以是本領(lǐng)域常規(guī)用于CAR的各種人CD3G胞內(nèi)區(qū)。 在某些實施方案中，所述人⑶3ζ胞內(nèi)區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:2第382-492位氨基酸所 不。
[0076] 本發(fā)明的CAR在5'端還可含有來自⑶8的前導(dǎo)序列。適用于本發(fā)明的⑶8前導(dǎo)序列 的一個例子的氨基酸序列可如SEQ ID NO:2第1-21位氨基酸所示。
[0077] 形成本發(fā)明的融合蛋白的上述各部分，如CD8抗原的前導(dǎo)肽、抗GPC3單鏈抗體的輕 鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)、人⑶8α鉸鏈區(qū)、人⑶8跨膜區(qū)、41BB和人⑶3ζ胞內(nèi)區(qū)等，相互之間可 直接連接，或者可通過接頭序列連接。接頭序列可以是本領(lǐng)域周知的適用于抗體的接頭序 列，例如含G和S的接頭序列。通常，接頭含有一個或多個如后重復(fù)的基序。例如，該基序可以 是6663、66663、33336、63634和66366。優(yōu)選地，該基序在接頭序列中是相鄰的，在重復(fù)之間 沒有插入氨基酸殘基。接頭序列可以包含1、2、3、4或5個重復(fù)基序組成。接頭的長度可以是3 ~25個氨基酸殘基，例如3~15、5~15、10~20個氨基酸殘基。在某些實施方案中，接頭序列 是多甘氨酸接頭序列。接頭序列中甘氨酸的數(shù)量無特別限制，通常為2~20個，例如2~15、2 ~10、2~8個。除甘氨酸和絲氨酸來，接頭中還可含有其它已知的氨基酸殘基，例如丙氨酸 (Α)、亮氨酸(L)、蘇氨酸(Τ)、谷氨酸(Ε)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。作為例 子，接頭可由以下氨基酸序列組成：G(SGGGG) 2SGGGLGSTEF(SEQ ID N0:7)、RSTSGLGGGS (GGGGS)2G(SEQ ID N0:8)、QLTSGLGGGS(GGGGS)2G(SEQ ID N0:9)、GGGS(SEQ ID N0:10)、 GGGGS(SEQ ID N0:11)、SSSSG(SEQ ID N0:12)、GSGSA(SEQ ID N0:13)、GGSGG(SEQ ID NO: 14)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID N0:15)、SSSSGSSSSGSSSSG(SEQ ID N0:16)、 GSGSAGSGSAGSGSA(SEQIDN0:17)和GGSGGGGSGGGGSGG(SEQIDN0:18)等。
[0078] 在某些實施方案中，本發(fā)明抗GPC3單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)之間由 (GGGS)n連接，其中η為1~5的整數(shù)。
[0079]在某些實施方案中，本發(fā)明CAR的氨基酸序列如SEQ ID Ν0: 2第1-492位氨基酸所 不。
[0080]應(yīng)理解，在基因克隆操作中，常常需要設(shè)計合適的酶切位點，這勢必在所表達的氨 基酸序列末端引入了一個或多個不相干的殘基，而這并不影響目的序列的活性。為了構(gòu)建 融合蛋白、促進重組蛋白的表達、獲得自動分泌到宿主細胞外的重組蛋白、或利于重組蛋白 的純化，常常需要將一些氨基酸添加至重組蛋白的N-末端、C-末端或該蛋白內(nèi)的其它合適 區(qū)域內(nèi)，例如，包括但不限于，適合的接頭肽、信號肽、前導(dǎo)肽、末端延伸等。因此，本發(fā)明的 融合蛋白（即所述CAR)的氨基端或羧基端還可含有一個或多個多肽片段，作為蛋白標簽。任 何合適的標簽都可以用于本文。例如，所述的標簽可以是FLAG，HA，HAl， C-MyC，P〇ly-His， Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，ΕΕ，Τ7,4Α6, ε，B，gE以及Tyl。這些標簽可用于對蛋白進行純 化。
[0081 ] 本發(fā)明也包括SEQ ID N0: 2第1-492位氨基酸序列所示的CAR的突變體。這些突變 體包括：與該CAR具有至少80 %，優(yōu)選至少85 %，優(yōu)選至少90%，優(yōu)選至少95%，優(yōu)選至少 97%的序列相同性并保留該CAR的生物學活性（如活化T細胞）的氨基酸序列?？刹捎美?NCBI的BLASTp計算兩條比對的序列之間的序列相同性。
[0082]突變體還包括:在SEQ ID N0:2第1-492位氨基酸序列所示的序列中具有一個或數(shù) 個突變(插入、缺失或取代）、同時仍保留該CAR的生物學活性的氨基酸序列。所述數(shù)個突變 通常指1 一 10個以內(nèi)，例如1 一8個、1 一5個或1 一3個。取代優(yōu)選是保守性取代。例如，在本領(lǐng) 域中，用性能相近或相似的氨基酸進行保守性取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)或多肽的功能。 "性能相近或相似的氨基酸"包括例如，具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族，這些家族包括 具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸）、具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如天冬 氨酸、谷氨酸）、具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨 酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異 亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、具有β-分支側(cè)鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨 酸、異亮氨酸)和具有芳香側(cè)鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）。因此，在 本發(fā)明多肽中用來自同一側(cè)鏈類的另一氨基酸殘基替換一個或幾個位點，將不會在實質(zhì)上 影響其活性。
[0083] 本發(fā)明包括編碼本發(fā)明融合蛋白的多核苷酸序列。本發(fā)明的多核苷酸序列可以是 DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNAANA可以是單鏈的或是 雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。本發(fā)明也包括編碼融合蛋白的多核苷酸序列的簡并 變異體，即編碼相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。
[0084] 本文所述的多核苷酸序列通?？梢杂肞CR擴增法獲得。具體而言，可根據(jù)本文所公 開的核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關(guān)序列。當序列較長時，常常需 要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。例如，在 某些實施方案中，編碼本文所述融合蛋白的多核苷酸序列如如SEQ ID NO: 1第1 一 1476位核 苷酸所示。
[0085]在某些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸序列還包含編碼EGFR的片段的核苷酸序 列。
[0086] 適用于本發(fā)明的EGFR可以是本領(lǐng)域周知的EGFR，例如來自人的EGFLEGFR含有N末 端胞外結(jié)構(gòu)域I和II，胞外結(jié)構(gòu)域III，胞外結(jié)構(gòu)域IV，跨膜區(qū)，近膜區(qū)結(jié)構(gòu)域以及酪氨酸激 酶結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明優(yōu)選使用截短的EGFR( "tEGFR"，即本文所述的EGFR的片段），尤其是不包 括其胞內(nèi)區(qū)域(近膜區(qū)結(jié)構(gòu)域及酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域)的截短的EGFR。在某些實施方案中，還 可以進一步將不包括胞內(nèi)區(qū)域的EGFR進一步截短成不包括胞外結(jié)構(gòu)域I和II。因此，在某些 實施方案中，本發(fā)明使用的tEGFR含有EGFR的胞外結(jié)構(gòu)域III、胞外結(jié)構(gòu)域IV以及跨膜區(qū)，或 由EGFR的胞外結(jié)構(gòu)域III、胞外結(jié)構(gòu)域IV以及跨膜區(qū)組成。在某些實施方案中，所述tEGFR含 有人EGFR的第310-646位氨基酸序列，或由人EGFR的第310-646位氨基酸序列組成，其中第 310-480位氨基酸序列為人EGFR的胞外結(jié)構(gòu)域III，第481-620為人EGFR的胞外結(jié)構(gòu)域IV，第 621-646位氨基酸為人EGFR的跨膜區(qū)。在某些實施例中，所述tEGFR的氨基酸序列的胞外結(jié) 構(gòu)域III和IV如SEQ ID N0: 2第541-852位氨基酸所示的氨基酸序列。在某些實施方案中，所 述tEGFR的跨膜區(qū)序列如SEQ ID N0:2第853-875位氨基酸所示。
[0087]為促進tEGFR的表達，還可在其N端設(shè)置前導(dǎo)序列。在某些實施方案中，本發(fā)明使用 來自GM-CSF受體（"GMCSFR"）α鏈的信號肽。在某些實施方案中，所述信號肽的氨基酸序列如 SEQ ID Ν0:2第519-540位氨基酸所示。
[0088]除此之外，可通過T2A多肽的編碼序列將所述信號肽及tEGFR的編碼序列與本發(fā)明 CAR中人CD3G胞內(nèi)區(qū)的編碼序列相連。在一個或多個實施方案中，所述T2A肽的氨基酸序列 如SEQ ID NO: 1第493-518位氨基酸所示。
[0089]因此，在某些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸序列含有本發(fā)明CAR的編碼序列、T2A 多肽的編碼序列、來自GM-CSF受體α鏈的信號肽的編碼序列、以及tEGFR的編碼序列。在某些 實施方案中，本發(fā)明多核苷酸的序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0090] 本發(fā)明也涉及核酸構(gòu)建物，該核酸構(gòu)建物含有本文所述的多核苷酸序列，以及與 這些序列操作性連接的一個或多個調(diào)控序列。本發(fā)明所述的多核苷酸序列可以多種方式被 操作以保證所述融合蛋白（CAR和/或tEGFR)的表達。在將核酸構(gòu)建物插入載體之前可根據(jù) 表達載體的不同或要求而對核酸構(gòu)建物進行操作。利用重組DNA方法來改變多核苷酸序列 的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。
[0091] 調(diào)控序列可以是合適的啟動子序列。啟動子序列通常與待表達蛋白的編碼序列操 作性連接。啟動子可以是在所選擇的宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核苷酸序列，包括突 變的、截短的和雜合啟動子，并且可以從編碼與該宿主細胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽 的基因獲得。
[0092] 調(diào)控序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，由宿主細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。 終止子序列與編碼該多肽的核苷酸序列的3'末端操作性連接。在選擇的宿主細胞中有功能 的任何終止子都可用于本發(fā)明。
[0093]調(diào)控序列也可以是合適的前導(dǎo)序列，對宿主細胞翻譯重要的mRNA的非翻譯區(qū)。前 導(dǎo)序列與編碼該多肽的核苷酸序列的5'末端可操作連接。在選擇的宿主細胞中有功能的任 何終止子都可用于本發(fā)明。
[0094] 在某些實施方案中，所述核酸構(gòu)建物是載體。通常通過可操作地連接本發(fā)明的多 核苷酸序列至啟動子，并將構(gòu)建體并入表達載體，實現(xiàn)本發(fā)明多核苷酸序列的表達。該載體 對于復(fù)制和整合真核細胞可為合適的。典型的克隆載體包含可用于調(diào)節(jié)期望核酸序列表達 的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子、起始序列和啟動子。
[0095] 本發(fā)明的多核苷酸序列可被克隆入許多類型的載體。例如，可被克隆入質(zhì)粒、噬菌 粒、噬菌體衍生物、動物病毒和粘粒。進一步地，載體是表達載體。表達載體可以以病毒載體 形式提供給細胞。病毒載體技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的并在例如Sambrook等（2001， Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York) 和其他病毒學和分子生物學手冊中進行了描述?？捎米鬏d體的病毒包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病 毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒和慢病毒。
[0096] 通常，合適的載體包含在至少一種有機體中起作用的復(fù)制起點、啟動子序列、方便 的限制酶位點和一個或多個可選擇的標記(例如，W0 01/96584;W001/29058;和美國專利號 6,326,193)。
[0097] 例如，在某些實施方案中，本發(fā)明使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體含有復(fù) 制起始位點，3'LTR，5'LTR，本文所述的多核苷酸序列，以及任選的可選擇的標記。
[0098] 合適的啟動子的一個例子為即時早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。該啟動子序 列是能夠驅(qū)動可操作地連接至其上的任何多核苷酸序列高水平表達的強組成型啟動子序 列。合適的啟動子的另一個例子為延伸生長因子-MEF-Ια)。然而，也可使用其他組成型啟 動子序列，包括但不限于類人猿病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺 陷病毒(HIV)長末端重復(fù)(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、鳥類白血病病毒啟動子、EB病毒即時 早期啟動子、魯斯氏肉瘤病毒啟動子、以及人基因啟動子，諸如但不限于肌動蛋白啟動子、 肌球蛋白啟動子、血紅素啟動子和肌酸激酶啟動子。進一步地，也可考慮使用誘導(dǎo)型啟動 子。誘導(dǎo)型啟動子的使用提供了分子開關(guān)，其能夠在期限表達時打開可操作地連接誘導(dǎo)型 啟動子的多核苷酸序列的表達，而在當表達是不期望的時關(guān)閉表達。誘導(dǎo)型啟動子的例子 包括但不限于金屬硫蛋白啟動子、糖皮質(zhì)激素啟動子、孕酮啟動子和四環(huán)素啟動子。
[0099] 為了評估CAR多肽或其部分的表達，被引入細胞的表達載體也可包含可選擇的標 記基因或報道基因中的任一個或兩者，以便于從通過病毒載體尋求被轉(zhuǎn)染或感染的細胞群 中鑒定和選擇表達細胞。在其他方面，可選擇的標記可被攜帶在單獨一段DNA上并用于共轉(zhuǎn) 染程序。可選擇的標記和報道基因兩者的側(cè)翼都可具有適當?shù)恼{(diào)節(jié)序列，以便能夠在宿主 細胞中表達。有用的可選擇標記包括例如抗生素抗性基因，諸如neo等等。
[0100] 報道基因用于鑒定潛在轉(zhuǎn)染的細胞并用于評價調(diào)節(jié)序列的功能性。在DNA已經(jīng)被 引入受體細胞后，報道基因的表達在合適的時間下進行測定。合適的報道基因可包括編碼 熒光素酶、半乳糖苷酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、分泌型堿性磷酸酶或綠色螢光蛋白基因的基 因。合適的表達系統(tǒng)是公知的并可利用已知技術(shù)制備或從商業(yè)上獲得。
[0101] 將基因引入細胞和將基因表達入細胞的方法在本領(lǐng)域中是已知的。載體可通過在 本領(lǐng)域中的任何方法容易地引入宿主細胞，例如，哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞。例如， 表達載體可通過物理、化學或生物學手段轉(zhuǎn)移入宿主細胞。
[0102] 將多核苷酸引入宿主細胞的物理方法包括磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、粒子轟擊、微 注射、電穿孔等等。將感興趣的多核苷酸引入宿主細胞的生物學方法包括使用DNA和RNA載 體。將多核苷酸引入宿主細胞的化學手段包括膠體分散系統(tǒng)，諸如大分子復(fù)合物、納米膠 囊、微球、珠;和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)，包括水包油乳劑、膠束、混合膠束和脂質(zhì)體。
[0103] 將多核苷酸引入宿主細胞的生物學方法包括使用病毒載體，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒載 體，這已經(jīng)成為最廣泛使用的將基因插入哺乳動物例如人細胞的方法。其他病毒載體可源 自慢病毒、痘病毒、單純皰疹病毒I、腺病毒和腺伴隨病毒等等。已經(jīng)開發(fā)了許多基于病毒的 系統(tǒng)，用于將基因轉(zhuǎn)移入哺乳動物細胞。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒提供了用于基因傳遞系統(tǒng)的方便 的平臺?？衫帽绢I(lǐng)域中已知的技術(shù)將選擇的基因插入載體并包裝入逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。該 重組病毒可隨后被分離和傳遞至體內(nèi)或離體的對象細胞。許多反轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)在本領(lǐng)域中 是已知的。在一些實施方案中，使用腺病毒載體。許多腺病毒載體在本領(lǐng)域中是已知的。在 一個實施方案中，使用慢病毒載體。
[0104] 因此，在某些實施方案中，本發(fā)明還提供用于活化Τ細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒，該病毒含 有本文所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及相應(yīng)的包裝基因，如gag、pol和vsvg。
[0105] 適用于本發(fā)明的T細胞可以是各種來源的各種類型的T細胞。例如，T細胞可來源于 B細胞惡性腫瘤患者的PBMC。
[0106] 在某些實施方案中，獲得T細胞后，可先用適量的（例如30~80ng/ml，如50ng/ml) 的⑶3抗體刺激活化，然后在含有適量的（例如30~80IU/ml，如50IU/ml)的IL2培養(yǎng)基進行 培養(yǎng)備用。
[0107] 因此，在某些實施方案中，本發(fā)明提供一種基因修飾的T細胞，該基因修飾的T細胞 含有本文所述的多核苷酸序列，或含有本文所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，或感染了本文所述的 逆轉(zhuǎn)錄病毒，或采用本文所述的方法制備得到，或穩(wěn)定表達本文所述的融合蛋白和任選的 tEGFR。
[0108] 本發(fā)明的CAR-Τ細胞可經(jīng)歷穩(wěn)固的體內(nèi)T細胞擴展并在血液和骨髓中以高水平持 續(xù)延長的時間量，并形成特異性記憶T細胞。不希望被任何具體的理論所束縛，在遇到并隨 后消除表達替代抗原的靶細胞后，本發(fā)明的CAR-Τ細胞可體內(nèi)分化成中心記憶樣狀態(tài)。
[0109] 本發(fā)明還包括一類細胞療法，其中T細胞被基因修飾以表達本文所述的CAR和任選 的tEGFR，和CAR-T細胞被注入需要其的接受者中。注入的細胞能夠殺死接受者的腫瘤細胞。 不像抗體療法，CAR-T細胞能夠體內(nèi)復(fù)制，產(chǎn)生可導(dǎo)致持續(xù)腫瘤控制的長期持久性。
[0110] 由CAR-T細胞引起的抗腫瘤免疫應(yīng)答可為主動或被動免疫應(yīng)答。另外，CAR介導(dǎo)的 免疫應(yīng)答可為過繼免疫療法步驟的一部分，其中CAR-T細胞誘導(dǎo)對CAR中的抗原結(jié)合部分特 異性的免疫應(yīng)答。
[0111] 因此，可采用本發(fā)明的CAR、其編碼序列、核酸構(gòu)建物、表達載體、病毒以及CAR-T細 胞治療的疾病優(yōu)選為GPC3介導(dǎo)的疾病。
[0112] 具體而言，本文中，"GPC3介導(dǎo)的疾病"尤其包括各種類型的肝癌。
[0113] 本發(fā)明的CAR-修飾的T細胞可被單獨施用或作為藥物組合物與稀釋劑和/或與其 他組分諸如相關(guān)的細胞因子或細胞群結(jié)合施用。簡單地說，本發(fā)明的藥物組合物可包括如 本文所述的CAR-T細胞，與一種或多種藥學或生理學上可接受載體、稀釋劑或賦形劑結(jié)合。 這樣的組合物可包括緩沖液諸如中性緩沖鹽水、硫酸鹽緩沖鹽水等等;碳水化合物諸如葡 萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇;蛋白質(zhì)；多肽或氨基酸諸如甘氨酸;抗氧化劑;螯合劑 諸如EDTA或谷胱甘肽;佐劑(例如，氫氧化鋁）；和防腐劑。
[0114] 本發(fā)明的藥物組合物可以以適于待治療(或預(yù)防）的疾病的方式施用。施用的數(shù)量 和頻率將由這樣的因素確定，如患者的病癥、和患者疾病的類型和嚴重度。
[0115] 當指出"免疫學上有效量"、"抗腫瘤有效量"、"腫瘤-抑制有效量"或"治療量"時， 待施用的本發(fā)明組合物的精確量可由醫(yī)師確定，其考慮患者（對象）的年齡、重量、腫瘤大 小、感染或轉(zhuǎn)移程度和病癥的個體差異?？赏ǔＶ赋觯喊ū疚拿枋龅腡細胞的藥物組合物 可以以1〇 4至1〇9個細胞/kg體重的劑量，優(yōu)選105至106個細胞/kg體重的劑量。T細胞組合物 也可以以這些劑量多次施用。細胞可通過使用免疫療法中公知的注入技術(shù)（見例如 Rosenberg等，New Eng · J · of Med· 319:1676，1988)施用。對于具體患者的最佳劑量和治療 方案可通過監(jiān)測患者的疾病跡象并因此調(diào)節(jié)治療由醫(yī)學領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。
[0116] 對象組合物的施用可以以任何方便的方式進行，包括通過噴霧法、注射、吞咽、輸 液、植入或移植。本文描述的組合物可被皮下、皮內(nèi)、瘤內(nèi)、結(jié)內(nèi)、脊髓內(nèi)、肌肉內(nèi)、通過靜脈 內(nèi)注射或腹膜內(nèi)施用給患者。在一個實施方案中，本發(fā)明的T細胞組合物通過皮內(nèi)或皮下注 射被施用給患者。在另一個實施方案中，本發(fā)明的T細胞組合物優(yōu)選通過靜脈注射施用。T細 胞的組合物可被直接注入腫瘤、淋巴結(jié)或感染位置。
[0117] 在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的CAR-T細胞或其組合物可與本領(lǐng)域已知的 其它療法結(jié)合。所述療法包括但不限于化療、放療和免疫抑制劑。例如，可結(jié)合本領(lǐng)域周知 的治療GPC3介導(dǎo)的疾病的放療或化療制劑進行治療。
[0118] 本文中，"抗腫瘤效應(yīng)"指一種生物學效應(yīng)，其可由腫瘤體積的減少、腫瘤細胞數(shù)的 減少、轉(zhuǎn)移數(shù)的減少、預(yù)期壽命的增加或與癌相關(guān)的各種生理癥狀的改善表示。
[0119] "患者"、"對象"、"個體"等等在本文中可交換使用，指可引起免疫應(yīng)答的活有機 體，如哺乳動物。例子包括但不限于人、狗、貓、小鼠、大鼠和其轉(zhuǎn)基因物種。
[0120]本發(fā)明采用抗GPC3抗體（具體是衍生自GC33的scFV)的基因序列，并從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索到人的⑶8α鉸鏈區(qū)、人的⑶8跨膜區(qū)、人的41BB胞內(nèi)區(qū)和人的⑶3ζ胞 內(nèi)區(qū)基因序列信息，全基因合成嵌合抗原受體GC33scFv-CD8鉸鏈區(qū)-CD8TM-41BB-CD3G與 GC33scFv-CD8鉸鏈區(qū)-CD8TM-41BB-CD3G-tEGFR的基因片段，插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中。重 組質(zhì)粒在293T細胞中包裝病毒，感染T細胞，使T細胞表達該嵌合抗原受體。本發(fā)明實現(xiàn)嵌合 抗原受體基因修飾的T淋巴細胞的轉(zhuǎn)化方法是基于逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化方法。該方法具有轉(zhuǎn)化 效率高，外源基因能夠穩(wěn)定表達，且可以縮短體外培養(yǎng)T淋巴細胞到達臨床級數(shù)量的時間等 優(yōu)點。在該轉(zhuǎn)基因 T淋巴細胞表面，轉(zhuǎn)化的核酸通過轉(zhuǎn)錄、翻譯表達在其上。本發(fā)明制備的 GPC3-GC33CAR-T細胞對特異性腫瘤細胞具強烈的殺傷功能，效靶比是20比1的情況下，殺傷 效率超過90 %。更進一步地，通過攜帶tEGFR組件，本發(fā)明的CAR還具有體內(nèi)示蹤和安全開關(guān) 的作用。
[0121] 本發(fā)明通過參考以下實驗實施例進一步詳細地進行描述。這些實施例僅出于說明 性的目的提供，并不意欲為限制性的，除非另有規(guī)定。因此，本發(fā)明決不應(yīng)被解釋為限于以 下實施例，而是應(yīng)被解釋為包括由于本文提供的教導(dǎo)變得顯而易見的任何和全部的變化。
[0122] 實施例 1 :mGPC3scFv-CD8a-41BB-CD3C 基因序列的確定
[0123] 從NCBI網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫搜索到人的CD8a鉸鏈區(qū)、人的CD8a跨膜區(qū)、人的41BB胞內(nèi)區(qū)和 人的⑶3ζ胞內(nèi)區(qū)基因序列信息，抗GPC3單鏈抗體克隆號為GC33,這些序列在網(wǎng)站http:// sg. idtdna.com/site上進行密碼子優(yōu)化，保證在編碼氨基酸序列不變的情況下更適合人類 細胞表達。
[0124] 采用重疊 PCR將上述序列依次按抗GPC3scFv、人⑶8α鉸鏈區(qū)基因、人⑶8α跨膜區(qū)基 因、人41ΒΒ胞內(nèi)區(qū)基因、人CD3G胞內(nèi)區(qū)基因序列進行連接，在各序列連接處引入不同酶切位 點，形成完整的mGPC3-CAR基因序列信息，獲得CAR分子(下文稱為"mGPC3CAR"），其基因序列 如SEQ ID NO: 1第1-1476位所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:2第1-492位氨基酸所 不。
[0125] 用Notl(NEB)和EcoRI(NEB)雙酶切該CAR分子的核苷酸序列，經(jīng)T4連接酶(NEB)連 接插入逆轉(zhuǎn)錄病毒MSCV(Addgene)的Notl-EcoRI位點，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌(DH5a)。
[0126] 將所獲得的重組質(zhì)粒送上海生工生物技術(shù)有限公司進行測序，將測序結(jié)果與擬合 成的mGPC3_CAR序列比對來驗證序列是否正確。測序引物為：
[0127] 有義：AGCATCGTTCTGTGTTGTCTC(SEQ ID N0:3);
[0128] 反義：TGTTTGTCTTGTGGCAATACAC(SEQ ID N0:4)。
[0129] 經(jīng)測序正確后，使用Qiagen公司的質(zhì)粒純化試劑盒提取并純化質(zhì)粒，純化質(zhì)粒的 質(zhì)粒磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293T細胞進行逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝實驗。
[0130]本實施例所構(gòu)建得到的質(zhì)粒圖譜如圖1所示。圖2顯示該MSCV-CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒表達 質(zhì)粒的部分測序結(jié)果峰值圖。
[0131] 實施例2:mGPC3CAR-tEGFR基因序列的確定
[0132] 從NCBI網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫搜索到人的EGFR胞外區(qū)基因序列信息，序列在網(wǎng)站http:// sg. idtdna.com/site上進行密碼子優(yōu)化，保證在編碼氨基酸序列不變的情況下更適合人類 細胞表達。
[0133] 采用重疊 PCR將上述序列依次按實施例1的GPC3CAR、GMCSFR前導(dǎo)序列、tEGFR進行 連接，在各序列連接處引入不同酶切位點，形成完整的mGPC3CAR-tEGFR基因序列信息，獲得 CAR分子，其序列如SEQ ID N0:1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0134] 用Notl(NEB)和EcoRI(NEB)雙酶切該CAR分子的核苷酸序列，經(jīng)T4連接酶(NEB)連 接插入逆轉(zhuǎn)錄病毒MSCV(Addgene)的Notl-EcoRI位點，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌(DH5a)。
[0135] 將重組質(zhì)粒送上海生工生物技術(shù)有限公司進行測序，將測序結(jié)果與擬合成的 mGPC3CAR-tEGFR序列比對來驗證序列是否正確。測序引物為：
[0136] 有義：AGCATCGTTCTGTGTTGTCTC(SEQ ID N0:5);
[0137] 反義：TGTTTGTCTTGTGGCAATACAC(SEQ ID N0:6)。
[0138] 經(jīng)測序正確后，使用Qiagen公司的質(zhì)粒純化試劑盒提取并純化質(zhì)粒，純化質(zhì)粒的 質(zhì)粒磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293T細胞進行逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝實驗。
[0139] 本實施例所構(gòu)建得到的質(zhì)粒圖譜如圖3所示。圖4顯示該MSCV-CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒表達 質(zhì)粒的部分測序結(jié)果峰值圖。
[0140] 實施例3:逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝
[0141] 1.第1天:293T細胞應(yīng)是小于20代，不過分長滿的。以0.6*10~6細胞/ml鋪板，10cm 皿添加10ml的DMEM培養(yǎng)基，充分混勻細胞，37度培養(yǎng)過夜。
[0142] 2.第2天:293T細胞融合度達到90%左右進行轉(zhuǎn)染(通常是鋪板14-18h左右）；準備 質(zhì)粒復(fù)合物，各種質(zhì)粒的量為實施例1或2的MSCV骨架載體12.5ug，Gag-pol 10ug，VSVg 6.25ug，CaCl2 250ul，H20 lml，總體積為1.25ml;在另一個管里添加跟質(zhì)粒復(fù)合物等體積的 HBS，邊加質(zhì)粒復(fù)合物邊渦旋震蕩20s。溫柔地將混合物沿著邊加入到293T皿中，37°C培養(yǎng) 4h，去除培養(yǎng)基，PBS洗一遍，重新加入預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基。
[0143] 3.第4天:轉(zhuǎn)染48h后收集上清并用0.45um濾器過濾后分裝保存于-80°C，繼續(xù)添加 預(yù)熱的新鮮DMEM培養(yǎng)基。
[0144] 實施例4:逆轉(zhuǎn)錄病毒感染人的T細胞
[0145] 1.用Ficcol分離液(天津灝洋)分離獲得較純的⑶3+T細胞，用含5%AB血清X-VIV0 (L0NZA)培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1 X 106/mL。將細胞以lml/孔接種到預(yù)先用抗人50ng/ml CD3抗體(北京同立海元)和50ng/ml CD28抗體（北京同立海元），再加入100IU/ml的白細胞 介素2(北京雙鷺），刺激培養(yǎng)48小時后用實施例3制備得到的病毒感染；
[0146] 2.T細胞活化培養(yǎng)后隔天，PBS稀釋至終濃度為15μg/ml的Retronectin(Takara)包 被非組織處理培養(yǎng)板，24孔板每孔250μ1。避光，4°C過夜備用。
[0147] 3. T細胞活化培養(yǎng)兩天后，取出2塊包被好的24孔板，吸棄包被液，加入含2 % BSA的 HBSS室溫封閉30min。封閉液體積為每孔500μ1，吸棄封閉液，用含2.5%HEPES的HBSS洗板兩 次。
[0148] 4.將實施例3制備得到的病毒液加入孔內(nèi)，每孔加2ml病毒液，32°C，2000g，離心 2h〇
[0149] 5.棄去上清液，24孔板每孔加入活化后的T細胞1 X 106個，體積lml，培養(yǎng)基為T細 胞培養(yǎng)基中添加 IL-2 20011]/1111。30°(：，100(^，離心1011^11。
[0150] 6.離心完畢后，將培養(yǎng)板置于37°C，5%C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0151] 7.感染后24h，將細胞懸液吸出，1200rpm，4°C，離心7min。
[0152] 8.細胞感染后，每天觀察細胞的密度，適時補加含IL-2 100IU/ml的T細胞培養(yǎng)液， 使T細胞的密度維持在5 X 105/ml左右，使細胞擴增。
[0153]由此獲得分別感染了實施例3所示逆轉(zhuǎn)錄病毒的CART細胞，分別命名為GPC3-GC33-CART細胞(表達實施例1的GPC3CAR)和GPC3-GC33-tEGFR-CART細胞(表達實施例2的 mGPC3CAR和tEGFR)。
[0154] 實施例5:流式細胞儀檢測感染后T淋巴細胞的比例及表面CAR蛋白的表達
[0155] 分別離心收集感染后72小時的CAR-T細胞和NT細胞(對照組），roS洗滌1次后棄上 清，加入相應(yīng)的抗體避光30min后PBS洗滌，重懸，最后流式細胞儀檢測。CAR+由抗鼠 IgG F (ab，）抗體(Jackson Immunoresearch)檢測。
[0156] 結(jié)果如圖5和6所示。其中，圖5顯示，使用實施例3制備得到的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染T細 胞72小時后，GPC3-GC33-CAR+的表達效率達36%;圖6顯示，使用實施例3制備得到的逆轉(zhuǎn)錄 病毒感染Τ細胞72小時后，GPC3-GC33-tEGFR-CAR+的表達效率達23%。
[0157] 實施例6: CAR-T細胞與靶細胞共培養(yǎng)后INF- γ分泌檢測
[0158] 1.取實施例4制備好的CAR-T細胞，重懸與Lonza培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞濃度為IX 106/mL〇
[0159] 2.陽性對照組的培養(yǎng)板預(yù)先使用CD3單抗500ng/mL加 CD28單抗500ng/ml包被，培 養(yǎng)基中不添加 IL-2。充分混勻后加入24孔板中，每孔lmL細胞懸液。同時加入BD GolgiPlug (含BFA，每lml細胞培養(yǎng)基中加入ΙμL BD GolgiPlug)，充分混勻后，37°C孵育5-6小時。收集 細胞，作為CAR-T細胞陽性對照。
[0160] 3.實驗組每孔含靶細胞(HepG2和Huh-7)或陰性對照細胞（SK-HEP-1)2X105個，實 施例4的CAR-T細胞2X105個，200μ1不含IL-2的Lonza培養(yǎng)基。充分混勻后加入96孔板中。同 時加入BD GolgiPlug(含BFA，每lml細胞培養(yǎng)基中加入ΙμL BD GolgiPlug)，充分混勻后，37 °C孵育5-6小時。收集細胞，作為實驗組。
[0161] 4.每管用lmL的PBS清洗細胞1次，300g離心5分鐘。仔細吸去或倒掉上清。
[0162] 5 . PBS洗細胞后，加入250μ1/ΕΡ管固定/滲透液，4°C孵育20分鐘以固定細胞及破 膜。用1 X BD Perm/Wash?緩沖液清洗細胞2次，lmL/次。
[0163] 6.進行胞內(nèi)因子染色，取適量IFN-γ、IL-2細胞因子熒光抗體或陰性對照，用BD Perm/Wash?緩沖液稀釋至50μ1。用此抗體稀釋液充分重懸已固定破膜的細胞，4°C避光孵育 30min，l XBD Perm/Wash?緩沖液lmL/次清洗細胞2次，然后用roS重懸。
[0164] 7.流式細胞儀檢測。
[0165] 結(jié)果如圖7和8所示。其中，圖7顯示制備3天的GPC3-GC33-CART細胞與靶細胞(31(-HEP-l、HepG2、Huh-7)共培養(yǎng)5小時INF-γ的分泌情況。圖8顯示制備3天的GPC3-GC33-tEGFR-CART細胞與靶細胞(SK-HEP-1、!fepG2)共培養(yǎng)5小時INF- γ的分泌情況。
[0166] 實施例7 :CAR_T細胞與靶細胞共培養(yǎng)后檢測腫瘤特異性細胞殺傷作用
[0167] 1. GPC3陽性的腫瘤細胞(HepG2和Huh-7)(含GPC3靶蛋白，為靶細胞）懸浮在含有 0 · 1 %BSA的PBS中，調(diào)整濃度為1 X 106/ml。
[0168] 2.加入熒光染料CFSE(羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯)至終濃度為ΙμΜ。
[0169] 3.混勻，37Γ 孵育 10min。
[0170] 4.孵育結(jié)束后，加入與細胞懸液等體積的FBS，室溫孵育2min以終止標記反應(yīng)。 [0171] 5.清洗細胞并重懸在新鮮細胞毒性培養(yǎng)基中，密度IX 106/ml。
[0172] 6.清洗實施例4的效應(yīng)T細胞并懸浮在細胞毒性培養(yǎng)基中，調(diào)整濃度為5X 10%1。
[0173] 7.在所有的實驗中，比較感染了實施例4的效應(yīng)T細胞(CART)的細胞毒性和/或未 感染的陰性對照效應(yīng)T細胞(NT細胞)的細胞毒性，并且這些效應(yīng)T細胞來自同一個病人。
[0174] 8.對于感染實施例4獲得的效應(yīng)T細胞和陰性對照效應(yīng)T細胞，按照T細胞:靶細胞 = 20:1或4:1(圖9)，或2:1或1:2(圖10)的比例，于5ml無菌試驗管(BD Biosciences)進行培 養(yǎng)，每組設(shè)置兩復(fù)孔。每一個共培養(yǎng)組中，靶細胞為50，000個（50μ1)，陰性對照細胞為50， 000個(50μ1)〇
[0175] 9.將共培養(yǎng)細胞置于37 °C孵育4h。
[0176] 10.孵育完成后，PBS清洗細胞，然后立即按照說明書推薦的濃度快速加入7-AAD (7-氨基放線菌素 D)，冰上孵育30min。
[0177] 不需清洗，直接進行流式上機檢測，數(shù)據(jù)用Flow Jo進行分析。
[0178] 結(jié)果顯示在圖9和10中。圖9顯示制備3天的GPC3-GC33-CART細胞（"CART"）和陰性 對照效應(yīng)T細胞（"NT"）與靶細胞(HepG2或Huh-7)共培養(yǎng)5小時后對腫瘤細胞的殺傷作用。圖 10顯示制備3天的GPC3-GC33-tEGFR-CART細胞（"GPC3-tEGFR CART"）、GPC3-GC33-CART細胞 ("GPC3CART"）和陰性對照效應(yīng)T細胞（"NT"）與靶細胞(HepG2)共培養(yǎng)5小時后對腫瘤細胞的 殺傷作用。
【主權(quán)項】
1. 一種多核苷酸序列，所述多核苷酸序列選自： (1) 含有依次連接的CD8抗原的前導(dǎo)肽的編碼序列、抗GPC3單鏈抗體的編碼序列、人CD8 α鉸鏈區(qū)的編碼序列、人CD8跨膜區(qū)的編碼序列、人41BB胞內(nèi)區(qū)的編碼序列、人CD3G胞內(nèi)區(qū)的 編碼序列和任選的EGFR的含胞外結(jié)構(gòu)域III和胞外結(jié)構(gòu)域IV的片段的編碼序列的多核苷酸 序列;和 (2) (1)所述多核苷酸序列的互補序列。2. 如權(quán)利要求1所述的多核苷酸序列，其特征在于， 所述CD8抗原前導(dǎo)肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第1-21位氨基酸所示;和/或 所述抗GPC3單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第22-134位氨基酸所 示;和/或 所述抗GPC3單鏈抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列可如SEQ ID NO: 1第150-264位氨基 酸所示;和/或 所述人⑶8α鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第265-311位氨基酸所示;和/或 所述人⑶8跨膜區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第312-333位氨基酸所示;和/或 所述人41BB胞內(nèi)區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第334-381位氨基酸所示;和/或 所述人⑶3ζ胞內(nèi)區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第382-492位氨基酸所示;和/或 所述EGFR的片段含有EGFR的胞外結(jié)構(gòu)域III、胞外結(jié)構(gòu)域IV以及跨膜區(qū)，或由EGFR的胞 外結(jié)構(gòu)域III、胞外結(jié)構(gòu)域IV以及跨膜區(qū)組成;優(yōu)選地，所述片段含有人EGFR的第310-646位 氨基酸序列，或由人EGFR的第310-646位氨基酸序列組成；更優(yōu)選地，所述片段的氨基酸序 列如SEQ ID NO:2第541-875位氨基酸所示。3. 如權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸序列，其特征在于， 所述多核苷酸序列編碼如SEQ ID NO:2第1-492位所述的氨基酸序列，或編碼如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列;或 所述多核苷酸序列含有SEQ ID NO: 1或其第1-1476位所示的核苷酸序列，或由SEQ ID NO: 1或其第1-1476位所示的核苷酸序列組成。4. 一種融合蛋白，所述融合蛋白選自： (1) 含有依次連接的CD8抗原的前導(dǎo)肽、抗GPC3單鏈抗體、人CD8a鉸鏈區(qū)、人CD8跨膜區(qū)、 人41BB胞內(nèi)區(qū)和人CD3G胞內(nèi)區(qū)的融合蛋白；和 (2) 在（1)限定的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且保留活化T 細胞活性的由（1)衍生的融合蛋白； 優(yōu)選地，所述抗GPC3單鏈抗體為抗GPC3單克隆抗體GC33。5. 如權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有以下一個或多個特 征： 所述⑶8抗原前導(dǎo)肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第1-21位氨基酸所示； 所述抗GPC3單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第22-134位氨基酸所 示； 所述抗GPC3單鏈抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列可如SEQ ID NO: 1第150-264位氨基 酸所示； 所述人⑶8a鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第265-311位氨基酸所示； 所述人⑶8跨膜區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第312-333位氨基酸所示； 所述人41BB胞內(nèi)區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第334-381位氨基酸所示； 所述人⑶3ζ胞內(nèi)區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1第382-492位氨基酸所示;和 所述EGFR的片段含有EGFR的胞外結(jié)構(gòu)域III、胞外結(jié)構(gòu)域IV以及跨膜區(qū)，或由EGFR的胞 外結(jié)構(gòu)域III、胞外結(jié)構(gòu)域IV以及跨膜區(qū)組成;優(yōu)選地，所述片段含有人EGFR的第310-646位 氨基酸序列，或由人EGFR的第310-646位氨基酸序列組成；更優(yōu)選地，所述片段的氨基酸序 列如SEQ ID NO: 1第541-875位氨基酸所示;和 優(yōu)選地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:1第1-492位氨基酸所示。6. -種核酸構(gòu)建物，所述核酸構(gòu)建物含有權(quán)利要求1-3中任一項所述的多核苷酸序列； 優(yōu)選地，所述核酸構(gòu)建物為載體； 更優(yōu)選地，所述核酸構(gòu)建物為逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，含有復(fù)制起始位點，3 ' LTR，5 ' LTR，以及 權(quán)利要求1-3中任一項所述的多核苷酸序列。7. -種逆轉(zhuǎn)錄病毒，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒含有權(quán)利要求6所述的核酸構(gòu)建物，優(yōu)選含有所述 載體，更優(yōu)選含有所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。8. -種基因修飾的T細胞或含該基因修飾的T細胞的藥物組合物，其特征在于，所述細 胞含有權(quán)利要求1-3中任一項所述的多核苷酸序列，或含有權(quán)利要求6所述的核酸構(gòu)建物， 或感染了權(quán)利要求7所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒，或穩(wěn)定表達權(quán)利要求4-5中任一項所述的融合蛋白 和任選的EGFR的含胞外結(jié)構(gòu)域III、胞外結(jié)構(gòu)域IV和任選的跨膜區(qū)的片段。9. 權(quán)利要求1-3中任一項所述的多核苷酸序列、權(quán)利要求4-5中任一項所述的融合蛋 白、權(quán)利要求6所述的核酸構(gòu)建物或權(quán)利要求7所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒在制備活化的T細胞中的 應(yīng)用。10. 權(quán)利要求1-3中任一項所述的多核苷酸序列、權(quán)利要求4-5中任一項所述的融合蛋 白、權(quán)利要求6所述的核酸構(gòu)建物、權(quán)利要求7所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒、或權(quán)利要求8所述的基因 修飾的T細胞或其藥物組合物在制備治療GPC3介導(dǎo)的疾病的藥物中的用途； 優(yōu)選地，所述GPC3介導(dǎo)的疾病為肝癌。
【文檔編號】A61P35/00GK105949324SQ201610504698
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月30日
【發(fā)明人】黃飛, 王海鷹, 金濤, 何鳳, 史子嘯
【申請人】上海恒潤達生生物科技有限公司