包含cd27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體、慢病毒載體及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體、慢病毒載體及其應用，包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體的免疫受體酪氨酸活化基序含有CD27分子胞內(nèi)信號域和與T細胞共刺激信號分子；通過將CD27分子胞內(nèi)信號域與T細胞活化相關的刺激信號連接，可顯著增加T細胞體外增殖和凋亡作用，提升CAR?T細胞中起體內(nèi)治療作用的幼稚樣Tscm細胞(CD45RA+CD62L+)和中心記憶細胞(CD45RO+CD62L+)細胞的比例；降低抑制免疫作用的IL?10因子的表達，對CAR?T(T細胞嵌合抗原受體)細胞治療效果的具有顯著提升作用，為CAR?T細胞治療領域提供一種新的思路和選擇。
【專利說明】
包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體、慢病毒載體及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領域，具體涉及包含⑶27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體，還涉 及包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體的慢病毒載體和應用。
【背景技術】
[0002] 過繼細胞治療(adoptive cell therapy，ACT)是生物治療技術的一種，對自體免 疫細胞(主要是T細胞)進行體外擴增，然后將其回輸給腫瘤患者以達到治療目的的方法，被 認為是繼手術、放、化療后的第4種治療方式，在臨床治療中受到廣泛應用。過繼細胞治療廣 泛應用的主要是:淋巴因子活化的殺傷細胞（lymphokine activated killer cell，LAK)與 IL-2聯(lián)合治療晚期惡性腫瘤取得了一定療效；腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymph〇CyteS，TIL)臨床試驗中治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤取得了較好的效果;細胞因子誘導的殺 傷細胞(cytokine induced killer cell，CIK)，目前國內(nèi)開展較多的臨床試驗，對肝癌、肺 癌等腫瘤取得了顯著的效果。但是目前上述三種治療方法均需活化T細胞，T細胞活化需要 兩種活化信號，即T細胞表面的TCR-CD3與MHC-I分子結(jié)合為活化的第一信號，決定T細胞對 腫瘤細胞的殺傷活性;T細胞表面的共刺激分子與相應配體結(jié)合為活化的第二信號，決定T 細胞增殖。但腫瘤細胞、腫瘤微環(huán)境可下調(diào)MHC、配體分子，從而抑制T細胞對腫瘤細胞的殺 傷活性。因此需要可進行基因改造，主要有兩種方式:基因轉(zhuǎn)導TCR(T cell receptor，TCR) 和嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR) 〇
[0003] CAR是模擬TCR功能的人工受體，由抗原識別域、鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)及胞內(nèi)信號域依 次連接組成，胞內(nèi)信號域通常為CD3G鏈或FcRy，或與一種或多種共刺激分子相連，如4-1BB (CD137)，CD28，IC0S(CD278)。腫瘤細胞表面的抗原(受體)與嵌合抗原受體的抗體(配體)結(jié) 合時，通過鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)將信號傳遞至胞內(nèi)，胞內(nèi)信號域?qū)⑿盘栟D(zhuǎn)化為活化信號，激活效 應細胞，效應細胞增殖、產(chǎn)生細胞因子從而殺傷腫瘤細胞。嵌合抗原受體較TCR改造更具優(yōu) 勢：（1)特異性:抗體(配體)特異性識別抗原(受體）；（2)效率高:不會出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因 TCR與患者 內(nèi)源性TCR發(fā)生錯配；（3)非MHC-I限制性:不需要與MHC-I分子結(jié)合，可克服腫瘤細胞、腫瘤 微環(huán)境下調(diào)MHC-I分子造成的免疫逃逸；（4)抗原選擇范圍廣:抗原可以是糖類、脂類、蛋白 質(zhì)。目前CAR修飾的免疫細胞治療的臨床試驗大量開展，其中，抗CD19、CD20 CAR修飾的T細 胞治療B系腫瘤效果顯著。實體腫瘤臨床試驗則有抗葉酸嵌合抗原受體治療卵巢癌，抗碳酸 酐酶K(CAK)嵌合抗原受體治療腎癌，抗二唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(GD2)嵌合抗原受體治療經(jīng) 母細胞瘤等。
[0004] 人記憶性干細胞樣T細胞(Tscm)是新發(fā)現(xiàn)的一個T細胞亞群。這一類群的細胞具有 干細胞的特征，具有較強的多向分化潛能，Tscm細胞能夠分化為中樞性記憶性T細胞(Tcm)， 效應性記憶性T細胞(Tem)和效應性T細胞(Tef)，在分化的同時又能夠維持自我更新。研究 顯示這群細胞是T細胞發(fā)揮體內(nèi)抗腫瘤活性的重群體，因此如何在獲得高比例的Tscm群體 的CAR-T細胞是目前學界追逐的熱點與難點。
[0005] 人⑶27基因定位于12號染色體短臂1區(qū)1帶（12pl 1 )，是由二硫鍵連接的相對分子 量為55000的單體組成的二聚體跨膜糖蛋白，相對分子量為12000,是一類I型跨膜，⑶27及 其配體⑶70是TNF.TNFR超家族的兩個重要成員，兩者之間的相互作用可以調(diào)節(jié)T、B及NK細 胞的增殖和分化。糖蛋白CD27所用的信號機制將不同于免疫球蛋白家族所用到的CD28和 TCR。它們通過鏈接TRAF家族成員。TRAF2和TRAF5,誘導NF-κΒ和c-Jun-N末端激酶信號通路， 從而促進T細胞的增殖及相應細胞因子的分泌。研究顯示CD27-CD70信號對T細胞在體內(nèi)長 期存活具有重要作用，因此聯(lián)想到CD27-CD70信號通路是否對T細胞形成或維持Tscm具有重 要作用。
[0006] 目前還沒有使用CD27分子與其他共刺激分子共同組合用于嵌合抗原受體的構(gòu)建， 也沒有報道顯示⑶27分子對Tscm的形成具有促進作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體;本 發(fā)明的目的之二在于提供表達包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體的慢病毒載體;本發(fā)明 的目的之三在于提供所述包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體或所述的慢病毒載體在制 備包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體的免疫細胞中的應用;本發(fā)明的目的之四在于提供 利用所述包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體或所述的慢病毒載體制備的表達包含CD27 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體的免疫細胞;本發(fā)明的目的之五在于提供所述包含CD27胞內(nèi)結(jié) 構(gòu)域的嵌合抗原受體或所述的慢病毒載體在制備包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體靶 向腫瘤細胞的藥物中的應用。
[0008] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術方案：
[0009] 1、包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體的免疫受體酪氨酸活 化基序含有CD27分子胞內(nèi)信號域和與T細胞共刺激信號分子，所述CD27分子胞內(nèi)信號域的 氨基序列如SEQ ID N0.20所示，所述T細胞共刺激信號分子為⑶137、⑶28和⑶278中的一種 或多種組合。
[0010] 本發(fā)明中，所述免疫受體酪氨酸活化基序包含⑶28與⑶27,⑶137與⑶27，CD134與 CD27，CD278 與 CD27 和 CD28、CD137 與 CD27 的組合。
[0011]本發(fā)明中，所述免疫受體酪氨酸活化基序還包括信號傳導結(jié)構(gòu)域，所述信號傳導 結(jié)構(gòu)域可以為⑶3ζ或FceRI γ信號鏈，優(yōu)選為⑶3ζ信號鏈。
[0012]本發(fā)明中，所述嵌合抗原受體依次由前導肽、單鏈抗體ScFv、CD8a鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū) 和包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的免疫受體酪氨酸活化基序，所述包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的免疫受體 酪氨酸活化基序的氨基酸序列如SEQ ID N0.18所示。
[0013 ] 本發(fā)明中單鏈抗體ScFv可以是革El向任意抗原的單鏈抗體ScFv，如革El向CEA抗原CEA 基因家族成員5，CEACAM5(CD66e)，靶向⑶19分子、靶向⑶20分子、靶向EGFR分子等任意單鏈 抗體，實施列中為靶向CEA抗原CEA基因家族成員5來源的單鏈抗體;氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示
[0014] 本發(fā)明中，所述前導肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示;所述CD8a鉸鏈區(qū)的氨基 酸序列如SEQ ID N0.6所示；所述跨膜區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示或如SEQ ID NO. 10所示。
[0015] 2、表達包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體的慢病毒載體，所述慢病毒載體的啟 動子與終止子之間依次連有前導肽、單鏈抗體ScFv、CD8a鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和含有CD27胞內(nèi)結(jié) 構(gòu)域的免疫受體酪氨酸活化基序，所述前導肽位于所述啟動子下游，所述含有CD27胞內(nèi)結(jié) 構(gòu)域的免疫受體酪氨酸活化基序的氨基酸序列如SEQ ID NO. 18所示。
[0016] 優(yōu)選的，所述前導肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示;所述單鏈抗體ScFv為抗人 CEA抗原的單鏈抗體ScFv，所述抗人CEA抗原的單鏈抗體ScFv的氨基酸序列如SEQ ID N0.4 所示;所述CD8a鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示;所述跨膜區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或如SEQ ID NO. 10所示。
[0017] 3、所述包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體或所述的慢病毒載體在制備包含 CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體的免疫細胞中的應用。
[0018] 本發(fā)明中免疫細胞可以為τ細胞、B淋巴細胞，NK淋巴細胞，CIK細胞、單核細胞或中 性粒細胞，優(yōu)選的所述免疫細胞為外周血來源的T細胞
[0019] 4、利用所述包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體或所述的慢病毒載體制備的表 達包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體的免疫細胞。
[0020] 5、所述包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體或所述的慢病毒載體在制備包含 CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體靶向腫瘤細胞的藥物中的應用。
[0021] 本發(fā)明中，所述腫瘤包括急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、髓系白血 病、淋巴瘤、肺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜 癌、前列腺癌、小腸腺癌、口腔癌或鼻咽癌等。
[0022] 其原理是免疫細胞(如T細胞)感染表達嵌合抗原受體的病毒后能夠促進免疫細胞 增殖克隆，能夠促進幼稚T細胞(CD45RA+CD62L+)和中心記憶細胞(CD45R0+CD62L+細胞）形 成;提高免疫細胞的抗凋亡作用;促進免疫細胞(如T細胞)在IL-2和靶向抗原刺激下的增殖 能力;并在靶向抗原刺激下提高IFN- γ和IL-2的分泌水平。
[0023] 本發(fā)明中術語"嵌合抗原受體"是人工改造受體，能夠?qū)⒆R別腫瘤抗原的特異性分 子(如抗體)錨定在免疫細胞(如Τ細胞)上，使免疫細胞識別腫瘤抗原或病毒抗原和殺死腫 瘤細胞或病毒感染的細胞。
[0024]本發(fā)明中術語"Τ細胞活化相關信號"是指與Τ細胞活化所需要兩個信號，即Τ細胞 表面TCR-CD3復合體與抗原肽-MHC分子結(jié)合，提供T細胞活化的第一信號，決定T細胞的殺傷 特異性。
[0025] 本發(fā)明中術語"共刺激信號分子"（Co-Stimulating molecule)是指免疫細胞表面 的一些粘附分子，如〇)27工028、0)134/(?40丄0137/4-188丄040等，通過與其配體結(jié)合，激 活免疫細胞的第二信號，增強免疫細胞的增殖能力及細胞因子的分泌功能，延長活化免疫 細胞的存活時間。
[0026] 本發(fā)明中術語"免疫受體酪氨酸活化基序"（immunoreceptor tyrosine-base activation motifs，ITAM)是指免疫細胞活化相關受體（如BCR/Iga/Ig0，TCR/CD3、FcaR和 FcRy等)胞漿區(qū)所共有的以酪氨酸殘基(tyr〇Sine，Y)為基礎的氨基酸序列基序，具體為： 兩個酪氨酸殘基被大約13外其它氨酸殘基隔開(···ΥΧΧαΛΠΧ 7_11YXX[L/V]···)，其中酪氨 酸是蛋白激酶磷酸化位點，被磷酸化后能夠與信號轉(zhuǎn)導途徑下游的信號分子結(jié)合，導致細 胞的活化。
[0027] 發(fā)明中術語"腫瘤特異性抗原"（tumor specific antigen，TSA)是腫瘤細胞特有 的或只存在于某種腫瘤細胞而不存在于正常細胞的新抗原。
[0028] 發(fā)明中術語"腫瘤相關抗原"（tumor-associated antigen，TAA)是指非腫瘤細胞 所特有的、正常細胞和其他組織上也存在的抗原，只是其含量在細胞癌變時明顯增高的抗 原。
[0029] 發(fā)明中術語"單鏈抗體"（single-chain antibody variable region fragment， scFv)是指由抗體VL區(qū)氨基酸序列和VH區(qū)氨基酸序列經(jīng)Linker連接而成，具有結(jié)合抗原能 力的抗體片段。
[0030] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明公開了包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原 (chimeric antigen receptor，CAR)，其包括前導肽、單鏈抗體（single-chain antibody variable region fragment，scFv)、連接ScFv所用的鉸鏈區(qū)、跨膜結(jié)構(gòu)域和免疫受體酪氨 酸活化基序;將該嵌合抗原受體在免疫細胞中表達后，可有效殺傷抗原陽性的腫瘤細胞，而 對抗原陰性的細胞無毒副作用，因此能夠用于腫瘤的靶向治療。
【附圖說明】
[0031] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0032] 圖1為含有不同刺激信號組合的病毒載體。
[0033] 圖2為CAR-T細胞感染病毒14天后通過流式細胞儀檢測T細胞表面識別CEACAM5抗 原的CAR結(jié)構(gòu)的表達陽性率，結(jié)果顯示Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD3(CEAl)病毒感染組陽性 率80 · 1 %、Lv-CEA( scf v)-CD8a-TM-CD28-CD3(CEA2)病毒感染組陽性率為52 · 6 %、Lv-CEA (scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD3(CEA3)病毒感染組陽性率為61·7%、Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CDl 37-CD27-CD3 (CEA4)病毒感染組陽性率為37 · 2 %。
[0034]圖3為CAR-T細胞感染病毒后細胞增殖情況;A表示不同CAR-T細胞在感染病毒后的 11天內(nèi)的細胞增殖曲線;B表示不同CAR-T細胞在感染病毒后的11天內(nèi)的細胞增殖倍數(shù);結(jié) 果顯示感染 Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD27-CD3(CEA4)病毒的 T 細胞較感染!^-CEA( scfv) -CD8a-TM-CD3 (CEA1)病毒、Lv-CEA( scfv) -CD8a-TM-CD28-CD3 (CEA2)病毒、Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD3(CEA3)病毒的T細胞具有更強的增殖能力。
[0035] 圖4為不同組的CAR-T細胞表型檢測；A表示流式細胞技術檢測各組CAR-T細胞 CD45RA，CD45R0 及 CD62L 的表達，CD45RA+CD62L+為幼稚的 T 細胞，CD45R0+CD62L+為中心記憶 細胞，CD45R0+CD62L-為效應記憶細胞，CD45RA+CD62L-為效應T細胞;B表示不同組的CAR-T 細胞 CD45RA+CD62L+，CD45R0+CD62L+，CD45R0+CD62L-，CD45RA+CD62L-的比例；結(jié)果顯示 CD28TM-CD28-CD137-CD27-CD3信號組較其他組的CAR-T細胞含有更高比例的CD45RA+CD62L +，CD45R0+CD62L+細胞。
[0036] 圖5為不同組的CAR-T細胞刺激前后凋亡比例的檢測;A表示流式細胞技術檢測各 組CAR-T細胞刺激前凋亡的比例，統(tǒng)計各組CAR-T細胞在刺激前各個凋亡時期的比例情況;B 表示流式細胞技術檢測CAR-T細胞在CEA-Fc蛋白刺激24h后各組的凋亡情況，統(tǒng)計總凋亡比 例。
[0037] 圖6為不同組的CAR-T細胞在IL-2和抗原刺激下的增殖情況;A表示培養(yǎng)至14天的 CAR-T細胞在含500IU/ml IL-2的培養(yǎng)基中的增殖情況;B表示培養(yǎng)至14天的各組CAR-T細胞 在不含IL-2的情況下，在CEA-Fc抗原刺激的情況下細胞的增殖情況，箭頭表示CEA-Fc刺激 的時間。
[0038] 圖7為不同組的CAR-T細胞在抗原刺激下IL-2，IFN-y，IL-10的分泌情況;A表示不 同組CAR-T在CEA-Fc抗原刺激下IFN- γ的分泌情況;B表示不同組CAR-T在CEA-Fc抗原刺激 下IL-2的分泌情況;C表示不同組CAR-T在CEA-Fc抗原刺激下IL-10的分泌情況。
【具體實施方式】
[0039]下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著） 中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0040] 實施例1、含有⑶28-⑶137-⑶27-⑶3這4個刺激信號的CAR病毒的構(gòu)建
[0041 ] 為證明同時含有CD28-CD137-CD27-CD3這4個刺激信號的CAR-T細胞較以往已報道 的含有⑶28-⑶137-⑶3這3個刺激信號、CD28-⑶3這兩個刺激信號和單⑶3刺激信號的CAR-T細胞更具有優(yōu)勢，因此需要分別構(gòu)建含有不同刺激信號組合的病毒載體。本實施例中以靶 向癌胚抗原(CEA)的單鏈抗體為統(tǒng)一的胞外識別抗原的結(jié)構(gòu)，分別需要構(gòu)建如下4個嵌合抗 原受體(圖1):
[0042] LP-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD3(CEAl);
[0043] LP-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD3(CEA2);
[0044] LP-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD3(CEA3);
[0045] LP-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD27-CD3(CEA4)。
[0046] 1)合成含有不同胞內(nèi)刺激信號的靶向癌胚抗原的嵌合抗原受體的基因序列
[0047] 合成依次含前導肽（又稱信號肽）（簡稱LP)、抗人CEA抗原的單鏈抗體ScFv(簡稱 CEA(scf v))，CD8a鉸鏈區(qū)（簡稱CD8a)、CD28跨膜區(qū)或CD8跨膜區(qū)（簡稱為TM)，其結(jié)構(gòu)如圖1所 示。其中前導肽的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示;抗人 CEA抗原的單鏈抗體SCFV的核苷酸序列如SEQIDN0.3所示，氨基酸序列如SEQIDN0.4所 示;CD8a鉸鏈區(qū)的核苷酸序列如SEQIDN0.5所示，氨基酸序列如SEQIDN0.6;CD28跨膜區(qū) 的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示，氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示;CD8跨膜區(qū)的核苷酸序 列如SEQ ID N0.9所示，氨基酸序列如SEQ ID N0.10所示;免疫受體酪氨酸活化基⑶3的核 苷酸序列如SEQ ID N0.11所示，氨基酸序列如SEQ ID N0.12所示;免疫受體酪氨酸活化基 CD28-CD3組合的核苷酸序列如SEQIDN0.13所示，氨基酸序列如SEQIDN0.14所示;免疫 受體酪氨酸活化基⑶28-⑶137-⑶3組合的核苷酸序列如SEQ ID N0.15所示，氨基酸序列如 SEQ ID N0.16所示;免疫受體酪氨酸活化基⑶28-CD137-⑶27-⑶3組合的核苷酸序列如SEQ ID N0.17所示，氨基酸序列如SEQ ID N0.18所示;免疫受體酪氨酸活化基⑶27的核苷酸序 列SEQ ID N0.19;免疫受體酪氨酸活化基CD27的氨基酸序列如SEQ ID N0.20所示。
[0048] 2)構(gòu)建表達嵌合抗原受體的慢病毒載體
[0049] 1)設計如下引物，并將其由南京金斯瑞生物科技公司合成，具體引物如下：
[0050] 5l*l:5'-aggctagcatgggatggagctgtatcat-3'（SEQ ID N0.21)，下劃線為Nhel限 制性內(nèi)切酶位點；
[0051 ]弓丨物2:5' -gattgtcgacttagcgagggggcagggcctgcatgtga-3'（SEQ ID NO.22)，下劃 線為Sal I限制性內(nèi)切酶位點。
[0052] 然后以SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示序列為引物，上述合成的各嵌合抗原受 體序列為模板進行PCR擴增，反應體系按KOD FX NEO DNA聚合酶(購自Τ0Υ0Β0公司）說明書 加樣，PCR反應條件為95°C預變性5min;95°C變性1〇8,55°(：退火158,68°(：延伸3〇8,30個循 環(huán)。將擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行鑒定。結(jié)果顯示，擴增獲得約2000bp的DNA片段，然后 用回收試劑盒(Promega公司）進行DNA片段回收，具體方法見說明書，回收獲得嵌合抗原受 體，將DNA回收片段送南京金斯瑞生物科技公司測序。
[0053]將克隆獲得的編碼嵌合抗原受體的基因序列用限制性內(nèi)切酶Nhel和Sail (購自 Thermo公司）雙酶切，同時用限制性內(nèi)切酶Nhe I和Sal I酶切慢病毒表達載體p⑶H-EF1 (購至 addgene Plasmid#72266)，酶切反應按說明書進行。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后用 瓊脂糖凝膠DNA片段回收試劑盒進行DNA片段回收，然后將的目的片段和載體片段通過T4連 接酶(購自Promega公司）進行連接，獲得表達嵌合抗原受體的慢病毒載體，命名為Lv-scFv (CEA)。將慢病毒載體取5μ1轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10,30°C培養(yǎng)16h后挑取單克隆，挑取的單克隆 在30°C條件下培養(yǎng)12h后用質(zhì)粒抽提試劑盒（Invitrogen公司）抽提質(zhì)粒，具體方法見說明 書。
[0054] 按照如上方法分別構(gòu)建pCDH-EFla-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD3(CEAl);pCDH-EFla-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD3(CEA2) ;pCDH-EFla-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD3 (CEA3)和 pCDH-EFla-CEA( scfv) -CD8a-TM-CD28-CDl 37-CD27-CD3 (CEA4)慢病毒載體。
[0055] 3)慢病毒的包裝
[0056] 本實施例包裝慢病毒采用磷酸鈣法，具體步驟如下：用含10 % (wt)FBS的DMEM培養(yǎng) 基培養(yǎng)293T細胞，至較佳狀態(tài);然后將293T細胞以1 X 105/cm2的密度傳至1個75cm2的培養(yǎng)瓶 中培養(yǎng)22h，保證轉(zhuǎn)染時細胞匯合度為70-80 % ;再用預熱的含2 % (wt )FBS的DMEM培養(yǎng)基換 液，培養(yǎng)2h，備用；將680μ1 ddH20、20yg慢病毒載體、20yg pMDLg/pRRE質(zhì)粒、20yg pRSV-Rev 和10yg pMD2.G質(zhì)粒、100μ1 2.5mM CaCh加入15ml離心管中，混合均勾，混勾后用移液器向 混合液中逐滴加入2 X HBS，同時用10ml移液器吹打混勻，混勻后室溫靜置15min，然后將混 合液逐滴加入上述制備的細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)12-16h后，用含10%FBS(wt)的DMEM培養(yǎng)基更換 培液，繼續(xù)培養(yǎng)48h、72h后分別收集細胞上清并用于病毒純化。
[0057] (2)慢病毒的純化
[0058] 將病毒上清收集在50ml離心管中，3000r/min離心10min;然后用0.45μπι過濾膜過 濾，濾液在3000r/min離心10min至新的50ml離心管;然后根據(jù)病毒上清量，分別加入質(zhì)量分 數(shù)為50%的PEG6000和4M NaCl，再用醫(yī)用鹽水定容至35mL，使PEG6000終濃度為8.5%，NaCl 終濃度為〇. 3M，定溶后于4°C冰箱靜置90min，30min/次顛倒混勻;然后于4°C、5000r/min條 件下離心30min，棄盡上清，用200μ1含10 %FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸病毒，1.5mlEP管分裝，每 管 40yl，-80°C 保存?zhèn)溆?。制得病毒分別命名為 Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD3(CEAl)、Lv-CEA (scfv)-CD8a-TM-CD28-CD3(CEA2)、Lv-CEA(scfV)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD3(CEA3)、Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CDl37-CD27-CD3(CEA4)。
[0059] (3)慢病毒滴度測定
[0060] 1)病毒感染293T細胞
[0061] 感染前將293T細胞以鋪24孔板中，取已純化的病毒ΙμL，用醫(yī)用生理鹽水稀釋10 倍，再向每孔細胞中加入ΙμL聚凝胺(Polybrene)溶液，然后將ΙμL和9μ1稀釋后的病毒液分 別加到293T細胞中，24h后用含10%FBS(wt)的DMEM培養(yǎng)基換液，感染72h后于lOOOr/min條 件下離心5min以收集細胞，抽提基因組。
[0062] 2)抽提基因組
[0063] 基因組抽提試劑盒為QIAamp DNA Blood Mini Kit購于Qiagen公司（貨號 511004)，按試劑盒說明書操作，具體如下：將收集的細胞用roS重懸，1000r/min離心5min， 棄盡上清，重復1次;再用200yL PBS重懸細胞，并加入20μ1蛋白酶Κ，200μ1 AL裂解液，吹打 混勻，56 °C孵育10min;然后加入200μ1預冷的乙醇，上下顛倒混勻，將溶液轉(zhuǎn)移至過濾柱中， 室溫靜置lmin，8000r/min離心lmin，棄盡上清;接著加入700μ1 AW1溶液，8000r/min離心 lmin，棄盡上清;再加入500ylAW2溶液，8000r/min離心lmin，棄盡上清，將過濾柱轉(zhuǎn)移至新 的1.5mlEP管中，開蓋靜置lmin以揮發(fā)乙醇；加入50μ1滅菌ddH 20(60°C預熱），靜置2min， 12000g/min 離心 lmin。
[0064] 3)qRT_PCR測定病毒滴度
[0065] 反應體系如下：SYBRl<PremixExTaq TMII(2X)10μl，上游引物(GAGup)lμl，下 游引物(GAG dn)lyl，抽提的基因組lyl，RNase-Free dH20 7μ1，每個樣品、標準品至少3個 重復孔。然后按如下程序進行擴增：95°C預變性30s，95°C變性5s，60°C退火30s，72°C延伸 30s，反應結(jié)束后，用分析軟件分析數(shù)據(jù)，根據(jù)標準曲線計算病毒滴度。計算結(jié)果顯示，病毒 滴度為lXl〇 8TU/ml。
[0066] 實施例2、病毒感染T細胞
[0067] 1)T細胞的分離活化及病毒感染
[0068] (1)人外周血單核細胞的分離
[0069]用加有抗凝劑的采血管采集外周血約60ml，分裝于50ml離心管各30ml，加入7.5ml 羥乙基淀粉稀釋;室溫（18~25°C)自然沉降約30min，收集上層血漿，將收集的上層血漿于 1400rpm/min條件下離心15min;然后用生理鹽水重懸沉淀，按體積比為1:1加到淋巴細胞分 離液上，梯度離心，400g/min，離心機降速設置為1，離心20min;離心后，離心管由上至下分 為:第一層:血漿層;第二層:環(huán)狀乳白色淋巴細胞層;第三層:透明分離液層;第四層:紅細 胞層;取第二層白色淋巴細胞層，并用生理鹽水洗滌2次，第一次400g/min，離心10min，第二 次1100rpm/min，離心5min，生理鹽水重懸細胞，加入含有10 %FBS的RPMI 1640完全培養(yǎng)基 培養(yǎng)，得人外周血單核細胞。
[0070] (2)慢病毒載體感染T淋巴細胞
[0071] 用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)新制備的單個核細胞PBMC，第1天 加入抗CD3單克隆抗體活化;前3天進行慢病毒感染;加入5M0I對應的慢病毒載體，未感染的 T淋巴細胞作為空白對照；24h后將培養(yǎng)基更換為含有500IU/ml重組人IL-2的RPMI 1640完 全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)10-20天。
[0072] 2)CAR分子的檢測
[0073]將培養(yǎng)至14天的已感染病毒的T細胞，300g/min，離心5min，棄盡上清以收集細胞； 用含有體積分數(shù)1%胎牛血清的PBS溶液重懸細胞，并將細胞調(diào)整密度為1 X 106個/ml;將收 集的細胞分裝為6管，每管100μ1，向每管細胞中加入5μ1濃度為0.3μg/ml的His標記的重組 人CEACAM5蛋白（北京義翹神州公司），4°C孵育30min，roS溶液洗滌2次，再加入AF647標記的 小鼠抗His抗體(南京金斯瑞公司），4°C孵育30min，PBS溶液洗滌2次，上流式細胞儀進行檢 測，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示經(jīng)過14天的培養(yǎng)，CAR-T細胞CAR的陽性率:Lv-CEA( scfv)-CD8a-TM-CD3 (CEA1)病毒感染組陽性率80.1 %、Lv-CEA( scf v) -CD8a-TM-CD28-CD3 (CEA2)病 毒感染組陽性率為 52.6%、Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD3(CEA3)病毒感染組陽 性率為61 · 7 %、Lv-CEA( scf v) -CD8a-TM-CD28-CDl 37-CD27-CD3 (CEA4)病毒感染組陽性率為 37.2%。
[0074]實施例3、病毒感染CAR-T細胞對細胞增殖的影響
[0075]各組病毒感染完T細胞后，將T細胞用含體積分數(shù)10%胎牛血清的含有500IU/ml重 組人IL-2的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)10天，每2-3天計數(shù)一次。然后觀察T淋巴細胞 生長情況，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示:細胞在感染表達CAR的病毒后，依然能夠形成典型的 增殖克隆團，通過對細胞進行計數(shù)，繪制細胞增殖曲線可見，感染Lv_CEA( scf v) -CD8a-TM-CD28-CD137-CD27-CD3(CEA4)病毒的 T 細胞增殖較感染 Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD3(CEAl) 病毒、Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD3(CEA2)病毒、Lv-CEA(scfv)-CD8a-TM-CD28-CD137-CD3 (CEA3)病毒及未感染病毒的T細胞要更好。
[0076] 實施例4、檢測感染病毒的CAR-T細胞中CD45RA，CD45R0和CD62L
[0077]將培養(yǎng)至14天的已感染病毒的T細胞，300g/min，離心5min，棄盡上清以收集細胞； 用含有1 %胎牛血清的PBS溶液重懸細胞，并將細胞調(diào)整密度為IX 106個/ml;將收集的細胞 分裝為6管，每管100μΙ，向每管細胞中同時加入10μ1 Brilliant Violet 421熒光標記的小 鼠抗人⑶45RA抗體（BD Pharmingen?公司），10μ1 percep_cy5 · 5焚光標記的小鼠抗人 CD45R0抗體（BD Pharmingen?公司），10μ1 PE熒光標記的小鼠抗人CD62L抗體（BD Pharmingen?公司）。4 °C孵育30min，PBS溶液洗滌2次，上流式細胞儀進行檢測。結(jié)果如圖4所 示。結(jié)果顯示CD28TM-CD28-CD137-CD27-CD3信號組較其他組的CAR-T細胞含有更高比例的 CD45RA+CD62L+，CD45R0+CD62L+細胞。
[0078]實施例5、檢測感染病毒的CAR-T細胞的抗凋亡能力
[0079] 1)檢測培養(yǎng)14天的不同組CAR-T細胞的凋亡情況
[0080] 樣品染色，具體步驟如下：
[0081 ] (1)收集CAR-T細胞，于300g，4°C離心5min收集細胞；
[0082] (2)配制 1 XBinding Buffer:用去離子水4倍稀釋4 XBinding Buffer(4ml結(jié)合緩 沖液+12ml去離子水）；
[0083] (3)用4 °C預冷的PBS洗滌細胞2次，每次均需300g，4 °C離心5min;
[0084] (4)加入250μ1 1 XBinding Buffer重懸細胞，調(diào)節(jié)其濃度為IX 106細胞/ml;
[0085] (5)取100μ1細胞懸液于5ml流式管中，加入5μ1 Annexin V/PE和10μ1 7-AAD，輕輕 混勻；
[0086] (6)避光、室溫反應15min;
[0087] (7)加入400μ1 1 XBinding Buffer，混勾，樣品在1小時內(nèi)檢測；
[0088]觀察檢測
[0089] (l)用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長Ex = 488nm;發(fā)射波長Em = 578nm，AnnexinV-PE 的橙紅色熒光建議使用FL2通道檢測;激發(fā)波長Ex = 546nm;發(fā)射波長Em = 647nm，7-AAD紅色 熒光建議使用FL3通道檢測。用Flowjo軟件進行分析，繪制雙色散點圖（two-color dot plot)，PE為橫坐標，7-AAD為縱坐標。每個樣采集10,000events。典型的實驗中，細胞可以分 成三個亞群，活細胞僅呈很低強度的背景熒光，早期凋亡細胞僅呈較強的橙紅色熒光，晚期 凋亡細胞呈橙紅和紅色焚光雙重染色。
[0090] (2)熒光補償調(diào)節(jié):使用未經(jīng)凋亡誘導處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償調(diào) 節(jié)去除光譜重疊和設定十字門的位置。
[0091] 檢測結(jié)果如圖5中A所示，結(jié)果顯示培養(yǎng)14天的不同組別的CAR-T細胞中，含有 ⑶28-⑶137-⑶27-⑶3信號組合的CAR-T細胞具有最少的細胞凋亡率。
[0092] 2)通過CEA-Fc蛋白刺激不同組別的CAR-T細胞，24h后檢測各組的凋亡水平
[0093] CEA-Fc蛋白刺激，具體步驟如下：
[0094] (1 )CEA-Fc蛋白包被，用生理鹽水稀釋重組人CEACAM5-Fc蛋白（義翹神州公司）至 lug/ml，取200ul稀釋蛋白至24孔板中，于4°C下放置過夜；
[0095] (2)CAR-T細胞刺激，將CAR-T細胞稀釋至4 X 105/ml，于CEACAM5-Fc蛋白包被的24 孔板中每孔加入500μ1稀釋后的細胞，于37°C下培養(yǎng)24h。
[0096]樣品染色，具體步驟如下：
[0097] (1)收集CAR-T細胞，于300g，4°C離心5min收集細胞；
[0098] (2)配制 1 XBinding Buffer:用去離子水4倍稀釋4 XBinding Buffer(4ml結(jié)合緩 沖液+12ml去離子水）。
[0099] (3)用4 °C預冷的PBS洗滌細胞2次，每次均需300g，4 °C離心5min。
[0100] (4)加入250μ1 1 XBinding Buffer重懸細胞，調(diào)節(jié)其濃度為1 X106細胞/ml。
[0101] (5)取100μΙ細胞懸液于5ml流式管中，加入5μ1 Annexin V/PE和10μ1 7-AAD，輕輕 混勻。
[0102] (6)避光、室溫反應15min。
[0103] (7)加入400μ1 1 XBinding Buffer，混勾，樣品在1小時內(nèi)檢測。
[0104] 觀察檢測
[0105] (l)用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長Ex = 488nm;發(fā)射波長Em = 578nm，AnnexinV-PE 的橙紅色熒光建議使用FL2通道檢測;激發(fā)波長Ex = 546nm;發(fā)射波長Em = 647nm，7-AAD紅色 熒光建議使用FL3通道檢測。用Flowjo軟件進行分析，繪制雙色散點圖（two-color dot plot)，PE為橫坐標，7-AAD為縱坐標。每個樣采集10,000events。典型的實驗中，細胞可以分 成三個亞群，活細胞僅呈很低強度的背景熒光，早期凋亡細胞僅呈較強的橙紅色熒光，晚期 凋亡細胞呈橙紅和紅色焚光雙重染色。
[0106] (2)熒光補償調(diào)節(jié):使用未經(jīng)凋亡誘導處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償調(diào) 節(jié)去除光譜重疊和設定十字門的位置。
[0107] 結(jié)果如圖5中B所示。結(jié)果顯示，CEACAM5-FC蛋白刺激24h后不同組別的CAR-T細胞 中，含有⑶28-⑶137-⑶27-⑶3信號組合的CAR-T細胞具有最少的細胞凋亡率。
[0108]實施例6、檢測CAR-T細胞在IL-2和抗原刺激下的增殖能力
[0109] 1)檢測培養(yǎng)14天的不同組CAR-T細胞在IL-2刺激下的增殖能力
[0110] 培養(yǎng)至14天的各組CAR-T細胞稀釋濃度至lX106/ml，將稀釋后的T細胞用含體積 分數(shù)10%胎牛血清的含有50011]/1111重組人11^-2的1?^1 1640完全培養(yǎng)基重懸并置于24孔板 中，每孔500μ1細胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)25天，每2-3天計數(shù)一次。然后觀察T淋巴細胞生長情況， 結(jié)果如圖6中Α所示。結(jié)果顯示⑶28-CD137-CD27-⑶3信號組合組CART細胞增殖較其他組的 細胞增殖具有顯著差異，增殖倍數(shù)和增殖時間均較其他各組更好。
[0111] 2)檢測培養(yǎng)14天的不同組CAR-T細胞在CEA抗原刺激下的增殖能力
[0112] CEA-Fc蛋白刺激，具體步驟如下：
[0113] (1 )CEA-Fc蛋白包被，用生理鹽水稀釋重組人CEACAM5-Fc蛋白（義翹神州公司）至 lug/ml，取200μ1稀釋蛋白至24孔板中，于4°C下放置過夜；
[0114] (2)CAR-T細胞刺激，將CAR-T細胞稀釋至4 X 105/ml，于CEACAM5-Fc蛋白包被的24 孔板中每孔加入500μ1稀釋后的細胞，于37°C下繼續(xù)培養(yǎng)，細胞每3天計數(shù)一次，每7天重新 進行一次新的刺激。每2-3天計數(shù)一次，然后觀察T淋巴細胞生長情況，結(jié)果如圖6中B所示。 結(jié)果顯示，⑶28-CD137-CD27-⑶3信號組合組CART細胞增殖較其他組的細胞增殖具有顯著 差異，細胞在3次刺激下仍顯示出增殖能力。
[0115] 實施例7、檢測病毒感染CAR-T細胞細胞因子
[0116] 抗原刺激，具體步驟如下：
[0117] (1)CEA-Fc蛋白包被，用生理鹽水稀釋重組人CEACAM5-Fc蛋白（義翹神州公司）至1 μg/ml，取200μ1稀釋蛋白至24孔板中，于4°C下放置過夜；
[0118] (2)CAR-T細胞刺激，將CAR-T細胞稀釋至4 X 105/ml，于CEACAM5-Fc蛋白包被的24 孔板中每孔加入500μ1稀釋后的細胞，于37°C下繼續(xù)培養(yǎng)。24h后于300g，4°C離心5min收集 上清。
[0119] 細胞因子檢測
[0120] (1)細胞因子檢測采用Elisa的方法，使用BD公司試劑盒進行。
[0121] (2)標準品的稀釋:準備小試管6只，依次編好號碼，先在各小試管中加入標準品稀 釋液100μΙ，然后取原濃度標準品100μΙ加入一只已編好號的試管中，充分混勻;再在該試管 中取1〇〇μ1加入第二支試管中，充分混勻;再在該試管中取1〇〇μ1加入第三只試管中，充分混 勻;再在該試管中取100μΙ加入第四只試管中，充分混勻;再在該試管中取100μΙ加入第五只 試管中，充分混勻;然后在該試管中取?〇〇μ1，棄掉;第六只試管作為〇號標準品。
[0122] (3)在酶標包被板上設標準品孔，依次加入不同濃度的標準品50μ1，每個濃度做2 個平行孔。
[0123] (4)加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品、酶標試劑及生物素標記的抗體，其 余各步操作相同）、待測樣品孔;在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品40μ1，然后再加生 物素標記的抗體1〇μ1。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻；
[0124] (5)溫育：用封板膜封板后置37°C溫育30分鐘；
[0125] (6)配液:將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用；
[0126] (7)洗滌:小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如 此重復5次，拍干；
[0127] (8)加酶:每孔加入酶標試劑50μ1，空白孔除外；
[0128] (9)溫育:操作同3;
[0129] (10)洗滌:操作同5;
[0130] (10)顯色:每孔先加入顯色劑Α50μ1，再加入顯色劑Β50μ1，輕輕震蕩混勻，37°C避 光顯色15分鐘；
[0131 ] (11)終止:每孔加終止液50μ1，終止反應；
[0132] (12)測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(0D值），測定應在加 終止液后15分鐘以內(nèi)進行。
[0133] 檢測結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示，CD28-CD137-CD27-CD3聯(lián)合信號的CAR-T在CEA-Fc 抗原刺激下IFN- γ，和IL-2的分泌水平較CD28-CD137-CD3聯(lián)合信號的CAR-T分泌的量有少 量增高，但未達到顯著水平。CD28-CD137-CD27-CD3，CD28-CD137-CD3,和CD28-CD3信號組的 分泌量較單CD3組的CAR-T分泌有顯著提升。IL-10在CD28-CD137-CD27-CD3和CD28-CD137-⑶3較⑶28-⑶3組顯著降低。
[0134] 最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管通 過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在 形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【主權(quán)項】
1. 包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體，其特征在于:所述嵌合抗原受體的免疫受體 酪氨酸活化基序含有CD27分子胞內(nèi)信號域和與T細胞共刺激信號分子，所述CD27分子胞內(nèi) 信號域的氨基序列如SEQ ID NO.20所示，所述T細胞共刺激信號分子為⑶137、⑶28和⑶278 中的一種或多種組合。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體，其特征在于:所述免疫受 體酪氨酸活化基序包含CD28與CD27，CD137與CD27，CD134與CD27，CD278與CD27或CD28、 CD137與CD27的組合。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體，其特征在于:所述免疫受 體酪氨酸活化基序還包括信號傳導結(jié)構(gòu)域，所述信號傳導結(jié)構(gòu)域為CD3S或FceRI γ信號鏈。4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項所述包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體，其特征在于： 所述嵌合抗原受體依次由前導肽、單鏈抗體ScFv、CD8a鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu) 域的免疫受體酪氨酸活化基序，所述包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的免疫受體酪氨酸活化基序的氨 基酸序列如SEQ ID NO. 18所示。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體，其特征在于:所述前導肽 的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示;所述單鏈抗體ScFv為抗人CEA抗原的單鏈抗體ScFv，所 述抗人CEA抗原的單鏈抗體ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示;所述CD8a鉸鏈區(qū)的氨基 酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述跨膜區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或如SEQ ID NO. 10所示。6. 表達包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體的慢病毒載體，其特征在于:所述慢病毒 載體的啟動子與終止子之間依次連有前導肽、單鏈抗體ScFv、CD8a鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)和含有 CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的免疫受體酪氨酸活化基序，所述前導肽位于所述啟動子下游，所述含有 CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的免疫受體酪氨酸活化基序的氨基酸序列如SEQ ID NO. 18所示。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的慢病毒載體，其特征在于:所述前導肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示;所述單鏈抗體ScFv為抗人CEA抗原的單鏈抗體ScFv，所述抗人CEA抗原的單鏈抗 體ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示;所述CD8a鉸鏈區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所 示;所述跨膜區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或如SEQ ID NO. 10所示。8. 權(quán)利要求1~5任一項所述包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體或權(quán)利要求6或7所 述的慢病毒載體在制備包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體的免疫細胞中的應用。9. 利用權(quán)利要求1~5任一項所述包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體或權(quán)利要求6或 7所述的慢病毒載體制備的表達包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體的免疫細胞。10. 權(quán)利要求1~5任一項所述包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體或權(quán)利要求6或7所 述的慢病毒載體在制備包含CD27胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的嵌合抗原受體靶向腫瘤細胞的藥物中的應 用。
【文檔編號】C12N5/10GK105949325SQ201610540868
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月8日
【發(fā)明人】錢程, 楊智, 沈俊杰, 單娟娟
【申請人】重慶精準生物技術有限公司