一種具有抗血小板聚集活性的寡糖類(lèi)組分及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種具有抗血小板聚集活性的寡糖類(lèi)組分及其制備方法，其以疏血通注射液為原料，經(jīng)進(jìn)一步分離、精制而得到，所述的寡糖類(lèi)組分主要是由大約2～10個(gè)左右單糖單元聚合而成的一系列寡糖組分，其分子量范圍為200Da～3000Da，對(duì)體外ADP誘導(dǎo)和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集有明顯的抑制作用。通過(guò)本發(fā)明提供的技術(shù)方案，獲得的具有潛在抗血小板聚集活性的寡糖類(lèi)組分，其分子量大小適中，也可以作為一種潛在的前體物質(zhì)，進(jìn)一步通過(guò)化學(xué)修飾或改造而增強(qiáng)活性，從而開(kāi)發(fā)制成應(yīng)用于心腦血管疾病領(lǐng)域的抗血小板治療藥物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種具有抗血小板聚集活性的寡糖類(lèi)組分及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種活性寡糖類(lèi)化合物組分及其制備，具體指一種具有抗血小板聚集 活性的寡糖類(lèi)組分及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 血栓疾病嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康，血栓形成或栓塞是導(dǎo)致心、腦和外周血管事件 的最后關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是致死和致殘的直接原因。在血栓以及動(dòng)脈粥樣硬化的形成等過(guò)程中，血 小板起著重要的作用。因此，在血栓性疾病中抗血小板治療占有十分重要地位。
[0003] 隨著近年來(lái)中藥大品種二次開(kāi)發(fā)及對(duì)中藥物質(zhì)基礎(chǔ)認(rèn)識(shí)的不斷深入，多糖或低聚 糖類(lèi)成分作為生物體內(nèi)重要生理活性物質(zhì)日益受到重視，其不僅具有構(gòu)成組織、儲(chǔ)存能量 的功能，而且對(duì)腫瘤、肝炎、心血管、抗衰老、免疫促進(jìn)和抗感染等多方面具有獨(dú)特的生物活 性，且細(xì)胞毒性低。丁冠華等對(duì)市售地龍藥材中的多糖類(lèi)成分進(jìn)行了測(cè)定(丁冠華.水蛭、地 龍藥材商品中總多糖含量測(cè)定.中華中醫(yī)藥學(xué)報(bào)[J]，2010，28(5): 986-987)，以此來(lái)評(píng)價(jià)兩 種市售藥材的品質(zhì)，也從側(cè)面反應(yīng)了多糖(寡糖)類(lèi)成分的重要性。
[0004] 疏血通注射液是由水蛭、地龍?zhí)崛〔⒕贫傻闹兴幾⑸鋭?。具有活血化瘀、通?jīng) 活絡(luò)之功效，主要用于瘀血阻絡(luò)所致的腦梗塞急性期，能有效的改善因腦缺血所引發(fā)的口 眼歪斜、半身不遂、語(yǔ)言謇澀等癥狀。以往的研究也已經(jīng)證實(shí)疏血通注射液主要含有次黃嘌 呤、氨基酸、多肽、多糖(主要是寡糖或糖肽)等成分。鑒于寡糖成分在生命體及治療疾病中 的重要作用，進(jìn)一步揭示其中的活性組分及其作用機(jī)制尤為重要，為更好的為臨床治療提 供服務(wù)和治療依據(jù)，特將疏血通中的寡糖進(jìn)行分離、純化，經(jīng)進(jìn)一步深入研究后，明確其具 體組成，并進(jìn)行活性確證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的主要是提供一種具有抗血小板聚集活性的寡糖類(lèi)組分及其制備方 法。這種具有抗血小板聚集活性的寡糖類(lèi)組分是以疏血通注射液為原料，經(jīng)進(jìn)一步分離、精 制而得到。疏血通屬于純動(dòng)物類(lèi)中藥注射劑，經(jīng)多年研究，大類(lèi)成分物質(zhì)基礎(chǔ)基本明確，但 獲得具有活性的寡糖類(lèi)組分并進(jìn)一步的分離、純化、鑒定屬于行業(yè)內(nèi)的重大突破。本發(fā)明對(duì) 于所獲得的寡糖類(lèi)成分的經(jīng)PMP衍生化法測(cè)定活性寡糖組分中的單糖組成，確認(rèn)所述的寡 糖類(lèi)組分中單糖單元為葡萄糖、半乳糖、甘露糖，其中主要為葡萄糖。經(jīng)LC-MS分析，確認(rèn)所 述的寡糖組分主要是由大約2~10個(gè)左右單糖單元聚合而成，其分子量范圍為200Da~ 3000Da，其中主要集中在200Da~2000Da。通過(guò)血小板聚集試驗(yàn)，確認(rèn)所述的寡糖組分抗血 小板聚集活性主要是對(duì)體外ADP誘導(dǎo)和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集有明顯的抑制作用。
[0006] 以上所述的寡糖類(lèi)組分通過(guò)如下步驟制備而得：
[0007] a.前處理：取疏血通注射液減壓濃縮至一定體積，其中減壓濃縮溫度為40°C~70 °C，其中優(yōu)選50°C，減壓濃縮的最終體積為濃縮前體積的1/2~1/4，其中優(yōu)選最終體積為濃 縮前體積的1/3。
[0008] b.醇沉:取濃縮液，加入一定量乙醇醇沉，其中優(yōu)選加入乙醇后最終含醇量為70 % ~80%，低溫靜置，棄去上層含乙醇液體，取沉淀層。
[0009] c.柱層析:取沉淀層加適量水溶解后，離心，取上清液通過(guò)分子篩排阻的凝膠過(guò)濾 柱，主要是指葡聚糖凝膠柱，其中，所述的凝膠柱為Sephadex G15、Sephadex G25、Sephadex G50或類(lèi)似填料的類(lèi)似型號(hào);所述凝膠柱的洗脫溶劑為水，洗脫液收集體積為1/3~1的柱體 積，其中優(yōu)選1 /2柱體積。減壓濃縮后，再通過(guò)預(yù)先活化的陰離子交換柱，收集洗脫液，其中， 所述陰離子交換柱為DEAE-52或類(lèi)似填料，所述陰離子交換柱，主要是指弱陰離子交換柱， 所述陰離子交換柱的洗脫溶劑為水，洗脫液收集體積為1~3柱體積，其中優(yōu)選2柱體積，最 后經(jīng)濃縮，凍干即得。
[0010]通過(guò)本發(fā)明提供的技術(shù)方案，獲得的具有潛在抗血小板聚集活性的寡糖類(lèi)組分， 其分子量大小適中，也可以作為一種潛在的前體物質(zhì)，進(jìn)一步通過(guò)化學(xué)修飾或改造而增強(qiáng) 活性，從而開(kāi)發(fā)制成應(yīng)用于心腦血管疾病領(lǐng)域的抗血小板治療藥物。其也解決了目前中藥 領(lǐng)域尤其是動(dòng)物類(lèi)中藥注射劑普遍存在的一些問(wèn)題，比如中成藥臨床定位寬泛、藥效物質(zhì) 不清、作用機(jī)制不明的共性問(wèn)題。此外，本發(fā)明所提供的活性寡糖類(lèi)組分，不僅可能為本領(lǐng) 域臨床治療用藥提供一種更多的選擇，同時(shí)對(duì)于其他同類(lèi)產(chǎn)品進(jìn)一步掌握糖類(lèi)物質(zhì)基礎(chǔ)提 供了方法和途徑。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1甘露糖、葡萄糖、半乳糖對(duì)照品高效液相色譜圖
[0012] 圖2活性寡糖組分未水解樣品的高效液相色譜圖
[0013] 圖3活性寡糖組分水解樣品的高效液相色譜圖
[0014] 圖4活性寡糖組分LC-MS鑒定圖譜
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，所述實(shí)施例僅用于對(duì)本發(fā)明闡述示 例，所述方法并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求的限制。
[0016] -、寡糖類(lèi)組分的制備
[0017] (1)前處理:取疏血通注射液1L，減壓濃縮，溫度60°C，濃縮至約300ml。
[0018] (2)醇沉:取濃縮液緩慢加入1.2L乙醇（約4倍量），不斷攪拌，靜置過(guò)夜，棄去上層 含乙醇液體，取沉淀層約15g (濕重）。
[00?9] ⑶柱層析:取沉淀層，加入約250ml水充分?jǐn)嚢?、溶解?500rpm離心10min，取上清 液通過(guò)Sephadex G15葡聚糖凝膠柱（8cm* 100cm)，用水洗脫，收集1/2柱體積洗脫液約 2500ml，減壓濃縮后，再通過(guò)預(yù)先活化的DEAE-52陰離子交換柱(5cm*80cm)，用水洗脫，收集 2柱體積洗脫液約3000ml，濃縮，凍干即得白色疏松干燥物約2g(寡糖組分提取物）。
[0020]二、PMP衍生化法測(cè)定活性寡糖組分中的單糖組成 [0021] 1儀器和實(shí)驗(yàn)材料
[0022] 1.1儀器
[0023] Agilent 1260高效液相色譜儀，配備四元梯度栗、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外檢測(cè) 器；高速離心機(jī)，Sigma公司產(chǎn)品；METTLER T0LED0XP205電子天平；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀SB-2000型 (上海愛(ài)朗儀器有限公司）;KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司）。
[0024] 1.2實(shí)驗(yàn)材料
[0025] 三氟醋酸（TFA)購(gòu)于TED IA公司，色譜級(jí)；1 -苯基-3 -甲基5-吡唑啉酮(PMP)，分析 純，購(gòu)于天津市大茂化學(xué)試劑廠;氯仿，購(gòu)于美國(guó)MREDA TECHNOLOGY公司，色譜級(jí);NaOH，HCI 均為分析純，購(gòu)于北京化工廠;磷酸二氫鉀，分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇 及乙腈購(gòu)于美國(guó)Honeywell Burdick&Jackson公司，色譜級(jí);水，去離子水;糖對(duì)照品D-甘露 糖(Man)、D-無(wú)水葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)均購(gòu)于中檢院，Man批號(hào)：140651-200602，Glc批 號(hào)：110833-200904，Gal批號(hào)：100226-200404;寡糖提取物，自制。
[0026] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0027] 2.1分析條件和系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)
[0028] Phenomenex C18(4 · 6 X 250mm，5μηι);流速：1 · 2ml/min;流動(dòng)相：20mmol/L醋酸銨 (A)-乙腈(B);采用梯度洗脫，洗脫程序如下:0-2511^11上85%-72.5%，8:15%-27.5% ;25-30min，A: 72 · 5 %-60%，B: 27 · 5%-40 % ;柱溫為25°C ;進(jìn)樣量:5yL;檢測(cè)波長(zhǎng):245nm。理論塔 板數(shù)以葡萄糖峰計(jì)算，不低于3000,各單糖色譜峰與最近的色譜峰的分離度和拖尾因子均 符合2010版中國(guó)藥典相關(guān)規(guī)定。
[0029] 2.2溶液及對(duì)照品配制
[0030] 12.5%的磷酸鹽緩沖液配制:精密稱(chēng)取12.5g磷酸二氫鉀，置于100mL容量瓶中，加 水溶解，并稀釋定容至刻度，即得。
[0031] 0.5mol/L PMP甲醇溶液的配制：精密稱(chēng)取PMP 0.5g，置于5ml容量瓶中，加甲醇使 溶解并定容至刻度，搖勻即得。
[0032] 0.3mol/L NaOH溶液的配制：精密稱(chēng)取固體NaOH 0.12g，加適量水溶解后，轉(zhuǎn)移至 l〇ml容量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，搖勻即得，轉(zhuǎn)入塑料離心管中待用。
[0033] 0.3mol/L HC1溶液的配制：精密吸取12N HC1 0.25ml，置于10ml容量瓶中，加水稀 釋并定容至刻度，搖勻即得。
[0034]混合對(duì)照品的配置:精密稱(chēng)取4mg甘露糖對(duì)照品，2.5mg半乳糖對(duì)照品，分別置于 l〇mL容量瓶中，加水溶解，稀釋并定容至刻度。精密稱(chēng)取5mg葡萄糖對(duì)照品，置于10mL容量瓶 中，加入lmL半乳糖對(duì)照品溶液和lmL甘露糖對(duì)照品溶液，再加入適量水溶解，加水稀釋并定 容至刻度，即得到混合對(duì)照品溶液，溶液中各對(duì)照品的濃度為：葡萄糖2mg/mL，半乳糖 0 · lmg/mL，甘露糖0 · 2mg/mL。
[0035] 0.4mg/mL寡糖待測(cè)樣品的配置:精密稱(chēng)取10mg寡糖樣品置于25mL容量瓶中，加水 溶解，稀釋并定容至刻度，即得寡糖供試品溶液。
[0036] 2.3寡糖的水解及衍生化反應(yīng)
[0037]寡糖水解：精密吸取lmL濃度為0.4mg/mL的寡糖待測(cè)樣品，置于5mL安瓿中，加入 6%的TFA溶液2mL，充氬氣后封口（充氣15s)，110°C水解3h，將反應(yīng)后的溶液轉(zhuǎn)入雞心瓶中， 在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，60°C減壓蒸至無(wú) TFA味，加入lmL水溶解殘?jiān)?，即得多糖水解液?br>[0038] PMP衍生化反應(yīng)：精密量取100yL多糖水解液，置于10mL塑料離心管中，加入 0.3mol/LNa0H溶液 100yL和0.5mol/L PMP甲醇溶液200yL，用0.3mol/L NaOH溶液將pH調(diào)至 7.2至8.5之間；渦旋混勻，于70°C水浴反應(yīng)45min，冷卻至室溫后，加入與上述0.3mol/L NaOH溶液使用量相當(dāng)?shù)?.3mol/L HCI溶液，渦旋混勻；加入12.5%的磷酸鹽緩沖液，稀釋反 應(yīng)溶液至1. OmL，禍旋混勾后，加入5mL氯仿，禍旋30s，4500rpm離心5min，取上層水層， lOOOOrpm高速離心5min，取上清液，即得糖水解衍生化后供試品溶液，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，同時(shí) 進(jìn)樣未水解衍生化樣品。
[0039] 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0040]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所制備寡糖的主要單糖種類(lèi)為葡萄糖、半乳糖、甘露糖，其中主要 為葡萄糖，結(jié)果見(jiàn)附圖1~附圖3。
[0041 ]三、寡糖類(lèi)組分的LC-MS分析 [0042] 1儀器與實(shí)驗(yàn)材料
[0043] 儀器：UHPLC:Agilent 1290:MS:Agilent 6540 Q-T0F;
[0044] 試藥:水為超純水；乙腈Honeywell Burdick&Jackson公司，色譜級(jí)；甲酸(LC-MS 用）；寡糖提取物，自制。
[0045] 2分析條件
[0046] 色譜條件:采用C18短柱(2 · l*50mm，1 · 8μπι)。
[0047] 流速采用 0.1ml/min。
[0048] 流動(dòng)相:A:水(含0.1%FA) B:乙腈(含0.1%FA)。
[0049] 梯度條件如表1:
[0050]表1:梯度條件
[0052]質(zhì)譜條件:正離子模式。
[0053] Gas temp：350〇C ；Drying Gas：lOL/min；Nebulizer：35psig；fragmentor：175V； Vcap:4000V;Collision Energy:25〇
[0054] 取少量寡糖用超純水溶解過(guò)濾后，進(jìn)樣分析。
[0055] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0056] LC-MS分析結(jié)果表明，所述寡糖類(lèi)組分為中性寡糖(M+Na峰），主要是二糖~十二 糖，分子量范圍為200Da~3000Da，其中主要集中在200Da~2000Da。分析鑒定結(jié)果見(jiàn)附圖4。 [0057]四、寡糖對(duì)血小板聚集試驗(yàn) [0058] 1試驗(yàn)材料
[0059] (1)藥物:寡糖，現(xiàn)用現(xiàn)配，臨用前用生理鹽水配制成20mg/mL母液。陽(yáng)性藥物，替格 瑞洛原料藥和阿司匹林原料藥，用無(wú)水乙醇配制成l〇〇ymol/L和5mmol/L母液，生理鹽水稀 釋至所需終濃度。
[0060] (2)動(dòng)物：SD大鼠，清潔級(jí)，雄性，體重220-250g，由北京華阜康生物科技股份有限 公司提供，生產(chǎn)質(zhì)量合格證號(hào):SCXK(京)2014-0004。
[0061 ] (3)試劑：二磷酸腺苷鈉鹽（adenosine-5-diphosphate，ADP)，美國(guó)Sigma公司生 產(chǎn)，國(guó)內(nèi)分裝，500mg/瓶;膠原(Collagen from rat tail)，美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，國(guó)內(nèi)分裝， 50mg/瓶;氯化鈉注射液，四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20151004;二水合梓檬酸鈉，分 析純，西隴化工股份有限公司，批號(hào)：150715。
[0062] (4)實(shí)驗(yàn)儀器
[0063] SC-2000血小板聚集測(cè)試儀，北京賽科希德科技發(fā)展有限公司；
[0064] YP3001N電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；
[0065] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0066]選用成年健康SD大鼠，雄性，適應(yīng)環(huán)境后，腹主動(dòng)脈采血，以3.8%枸櫞酸鈉與血液 1:9的比例抗凝，然后以110g/min離心10min，制備富血小板血衆(zhòng)(platelet rich plasma， PRP)，剩余部分以1100g/min離心10min制備貧血小板血楽_(platelet poor plasma，PPP)， 以PPP調(diào)零，用PPP調(diào)整PRP的血小板計(jì)數(shù)為400X 109/L，與藥物或生理鹽水37°C孵育30min， 然后加入ADP(終濃度為5μΜ/1)或膠原（終濃度為30yg/mL)誘導(dǎo)聚集。用血小板聚集儀檢測(cè) 血小板最大聚集率，按下列公式計(jì)算血小板聚集抑制率(AIR):
[0067] AIR=[(空白對(duì)照組最大聚集率一給藥組最大聚集率)/空白對(duì)照組最大聚集]* 100%
[0068] 3試驗(yàn)結(jié)果和評(píng)價(jià)
[0069] 結(jié)果見(jiàn)表2和表3。
[0070]表2寡糖對(duì)體外ADP誘導(dǎo)血小板聚集的影響（[士s)
[0072] 注:與生理鹽水比較，*表示P<0 · 05，**表示P<0 · 01，***表示P<0 · 001。
[0073] 表3寡糖對(duì)體外膠原誘導(dǎo)血小板聚集的影響（i ±s)
[0075] 注:與生理鹽水比較，*表示P<0 · 05，**表示P<0 · 01，***表示P<0 · 001。
[0076] 通過(guò)研究發(fā)現(xiàn):寡糖終濃度為1.33~4mg/mL對(duì)體外ADP誘導(dǎo)的血小板聚集有明顯 的抑制作用（P < ο · ο5)，4mg/mL、2 · 3mg/mL和 1 · 33mg/mL抑制率分別為92 · 3 %、42 · 8 % 和 16.9% ;寡糖終濃度為2~5mg/mL對(duì)體外膠原誘導(dǎo)的血小板聚集有明顯的抑制作用（P< 0.05)，5mg/mL、3.5mg/mL和2mg/mL抑制率分別為79.5%、46·4%和31.7%，5mg/mL抑制率強(qiáng) 于陽(yáng)性對(duì)照組抑制率72%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有抗血小板聚集活性的寡糖類(lèi)組分，主要以疏血通注射液為原料，經(jīng)提取精 制而得到，其特征在于所述的寡糖類(lèi)組分是由大約2~10個(gè)左右單糖單元聚合而成的一系 列寡糖類(lèi)組分，所述寡糖類(lèi)組分通過(guò)如下步驟制備而成： a. 前處理:取疏血通注射液減壓濃縮至一定體積； b. 醇沉:取濃縮液，加入一定量乙醇醇沉，低溫靜置，棄去上層含乙醇液體，取沉淀層； c .柱層析:取沉淀層加適量水溶解后，離心，取上清液通過(guò)分子篩排阻的凝膠過(guò)濾柱， 收集洗脫液，減壓濃縮后，再通過(guò)預(yù)先活化的陰離子交換柱，收集洗脫液，濃縮，凍干即得。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗血小板聚集活性的寡糖類(lèi)組分，其特征在于:構(gòu)成其寡 糖組分的單糖單元為葡萄糖、半乳糖、甘露糖，其中主要為葡萄糖。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗血小板聚集活性的寡糖類(lèi)組分，所述的抗血小板聚集 活性主要是對(duì)體外ADP誘導(dǎo)和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集有明顯的抑制作用。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗血小板聚集活性的寡糖類(lèi)組分，其特征在于，分子量范 圍為 200Da ~3000Da。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有抗血小板聚集活性的寡糖類(lèi)組分，其特征在于，分子量范 圍為 200Da ~2000Da。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡糖類(lèi)組分，其特征在于，所述步驟a中的減壓濃縮溫度為40 °C~70 °C，減壓濃縮的最終體積為濃縮前體積的1 /2~1 /4。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的寡糖類(lèi)組分，其特征在于，所述步驟a中的減壓濃縮溫度為50 °C，減壓濃縮的最終體積為濃縮前體積的1/3。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡糖類(lèi)組分，其特征在于，所述步驟b中的醇沉步驟，加入乙醇 后最終含醇量為70 %~80 %。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡糖類(lèi)組分，其特征在于，所述步驟c中的分子篩排阻的凝膠 過(guò)濾柱，主要是指是葡聚糖凝膠柱，所述凝膠柱的洗脫溶劑為水，洗脫液收集體積為1/3~1 的柱體積;所述陰離子交換柱，主要是指弱陰離子交換柱，所述陰離子交換柱的洗脫溶劑為 水，洗脫液收集體積為1~3柱體積。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的寡糖類(lèi)組分，其特征在于所述的凝膠柱為Sephadex G15、 Sephadex G25、Sephadex G50;所述陰離子交換柱為DEAE-52。11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的寡糖類(lèi)組分，其特征在于所述的凝膠柱洗脫液收集體積為1/ 2柱體積，所述的陰離子交換柱洗脫液收集體積為2柱體積。
【文檔編號(hào)】C07H1/06GK105949335SQ201610272887
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年4月29日
【發(fā)明人】李振國(guó), 陳艷明, 周劍波, 夏珂
【申請(qǐng)人】牡丹江友搏藥業(yè)股份有限公司