一種產(chǎn)角蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種產(chǎn)角蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌，其保藏號為CGMCC No.12184。本發(fā)明還提供該產(chǎn)角蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌在降解角蛋白上的應(yīng)用，當發(fā)酵培養(yǎng)24h后，其角蛋白酶酶活可達到64.55U/mL，該產(chǎn)角蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌在降解和再利用含有角蛋白的畜禽業(yè)廢棄物領(lǐng)域具有較可觀的應(yīng)用前景。CGMCC No.1218420160307
【專利說明】
一種產(chǎn)角蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種微生物技術(shù)，具體涉及一種產(chǎn)角蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 羽毛是重要的蛋白質(zhì)資源，其蛋白含量高達85-90%。但由于其主要成分角蛋白是 一種具有極強抗性、難生物降解的硬蛋白，難以直接利用，而傳統(tǒng)的物理和化學(xué)加工方法 (高溫高壓、酸堿處理等）不僅消耗大量能源還引發(fā)嚴重的環(huán)境污染問題。目前我國養(yǎng)殖業(yè) 中每年產(chǎn)生的羽毛廢棄物百萬余噸，隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展其數(shù)量還在持續(xù)增長，實 現(xiàn)廢棄資源的高值轉(zhuǎn)化和循環(huán)利用已是必然選擇。研究角蛋白資源的轉(zhuǎn)化及應(yīng)用，對含有 羽毛、毛發(fā)等角蛋白成分的養(yǎng)殖業(yè)廢棄物的無害轉(zhuǎn)化以及對和角蛋白有相似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)的 轉(zhuǎn)化均具有重要理論價值和創(chuàng)新意義。
[0003] 角蛋白酶(keratinase)是一種主要由真菌、放線菌、細菌等微生物產(chǎn)生，可特異降 解角蛋白的蛋白酶。利用自然界中微生物分泌的角蛋白酶特異性地消化羽毛等角蛋白，將 角蛋白直接轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)或復(fù)合氨基酸，以作為一種飼科蛋白質(zhì)應(yīng)用于畜禽的飼養(yǎng)，從而 變廢為寶，既能保護環(huán)境又利用資源，這也將具有十分顯著的經(jīng)濟效益和深遠的社會效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)角蛋白酶的蠟樣芽孢桿 菌。
[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0006] -種產(chǎn)角蛋白酶的錯樣芽孢桿菌，該菌種于2016年03月07日保藏于中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，其保藏號為 CGMCC No. 12184,其分類命名為蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus。
[0007] 該產(chǎn)角蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌的序列號為SEQ ID No. 1。
[0008] 本發(fā)明的目的之二在于提供上述產(chǎn)角蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌在降解角蛋白上的 應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的目的之三在于提供利用上述產(chǎn)角蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌降解角蛋白的 方法，包括以下步驟：
[0010] 1)取含有角蛋白的待降解物，加入無機液體培養(yǎng)基中；
[0011] 2)向步驟1)所述的無機液體培養(yǎng)基中加入蠟樣芽孢桿菌菌株；
[0012] 3)將步驟2)后的無機液體培養(yǎng)基于27-47Γ震蕩至待降解物大部分降解。
[0013] 作為優(yōu)選，步驟1)中，戶斤述無機液體培養(yǎng)基的pH值= 4-11。
[0014] 作為優(yōu)選，步驟1)中，所述無機液體培養(yǎng)基的pH值=7。
[0015] 作為優(yōu)選，步驟2)中，蠟樣芽孢桿菌菌株的添加量為無機液體培養(yǎng)基體積的1 %。
[0016] 作為優(yōu)選，步驟1)中，所述無機液體培養(yǎng)基包括按重量份計的以下組分：1份 Κ2ΗΡ〇4,0·5份Mg2S〇4 · 7Η20,0·5份NaCl，0.1份lOOg/L的FeS〇4 · 7H20,調(diào)節(jié)pH量的H2S〇4或 NaOH溶液，補足至1000份的雙蒸水。
[0017]相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0018] 本發(fā)明針對養(yǎng)殖業(yè)中出現(xiàn)的環(huán)境污染和資源浪費的問題，提供一株蠟樣芽孢桿 菌，該蠟樣芽孢桿菌在以完整羽毛為唯一碳氮源的pH值為7的無機液體培養(yǎng)基中37 °C培養(yǎng) 24h后，羽毛降解率達65%以上，角蛋白酶酶活達到64.55U/mL，該產(chǎn)角蛋白的蠟樣芽孢桿 菌可應(yīng)用于角蛋白的降解利用。
[0019] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細說明。
【附圖說明】
[0020] 圖1為蠟樣芽孢桿菌F-T1 -2的透射電子顯微鏡照片；
[0021] 圖2為蠟樣芽孢桿菌F-T1-2及部分相關(guān)菌株依據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育 樹；
[0022] 圖3為不同起始pH值下蠟樣芽孢桿菌F-T1-2降解羽毛的速率圖；
[0023] 圖4為不同發(fā)酵溫度下蠟樣芽孢桿菌F-T1-2降解羽毛的速率圖；
[0024] 圖5為蠟樣芽孢桿菌F-T1-2對羽毛的降解效果圖，B為添加蠟樣芽孢桿菌F-T1-2發(fā) 酵24h后的發(fā)酵液，A為不加菌種的對照例；
[0025]圖6為蠟樣芽孢桿菌F-T1-2對仔雞尸體的降解效果，A為處理前，B為添加蠟樣芽孢 桿菌F-T1-2發(fā)酵72h后的發(fā)酵液，C為發(fā)酵72h后殘渣；
[0026]圖7為蠟樣芽孢桿菌F-T1-2對血凝塊的作用效果，其中A為處理前，B為添加蠟樣芽 孢桿菌F-T1-2發(fā)酵72h后的發(fā)酵液；
[0027]圖8為蠟樣芽孢桿菌F-T1-2對豬蹄的降解效果。其中，A為處理前，B為添加蠟樣芽 孢桿菌F-T1-2發(fā)酵72h后的發(fā)酵液，C為發(fā)酵72h后殘渣；
[0028]圖9為蠟樣芽孢桿菌F-T1-2對大鼠皮毛的降解效果。其中，A為處理前，B為添加蠟 樣芽孢桿菌F-T1-2發(fā)酵72h后的發(fā)酵液，C為發(fā)酵72h后殘渣。
【具體實施方式】
[0029] 本實施例中，如未特殊說明，所采用試劑或儀器均為市售。以下實施例中，土壤樣 品采自于廣東溫氏食品集團股份有限公司某雞場。
[0030] 實施例1:角蛋白酶產(chǎn)生菌的分離培養(yǎng)
[0031] 將采集的土壤樣品置于無菌蒸餾水中混勻，靜置取上清液，進行梯度稀釋(稀釋至 10'10'10'，分別涂布于牛奶瓊脂平板培養(yǎng)基上，37°(：恒溫箱中倒置培養(yǎng)2411。挑選能產(chǎn) 生透明降解圈的單個菌落，接種于含有一根約〇.5g的羽毛的無機液體培養(yǎng)基中，37°C， 180rpm震蕩培養(yǎng)72h。挑選羽毛降解明顯的菌株培養(yǎng)液，接種至新的無機液體培養(yǎng)基上進行 復(fù)篩培養(yǎng)。
[0032]將復(fù)篩得到的菌株接種于含有一根完整羽毛和50mL無機液體培養(yǎng)基的250mL錐形 瓶中，37°C，200rpm震蕩培養(yǎng)48h，觀察羽毛的降解情況，篩選出羽毛降解能力較強的菌株， 記為目的菌株F-T1-2，保種備用。
[0033]本實施例中，牛奶瓊脂平板培養(yǎng)基成分：氯化鈉 10.0g，瓊脂粉20.0g，脫脂奶粉 5. Og，雙蒸水補足至lOOOmL。
[0034] 本實施例中，無機液體培養(yǎng)基成分：lg K2HP〇4,0.5g Mg2S〇4 · 7H20,0.5g NaCl， O.lmL lOOg/L的FeS〇4 · 7H20,調(diào)節(jié)pH量的H2S〇4或NaOH溶液，補足至1000份的雙蒸水。
[0035] 實施例2:角蛋白酶產(chǎn)生菌的鑒定 [0036] 實施例2A)形態(tài)特征
[0037]將分離純化的目的菌株F-T1-2劃線接種牛奶瓊脂平板培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h。肉眼 觀察菌落的形狀、顏色、表面質(zhì)地以及菌落邊緣。光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察菌體形 態(tài)。參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對菌株的生理生化特性進行鑒定，初步分類。
[0038]目的菌株F-T1-2的菌落在透射電子顯微鏡照片下的形狀如圖1所示。該目的菌株 F-T1-2的菌落在牛奶瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后產(chǎn)生透明降解圈，菌落呈圓形奶白色單 菌落，表面粗糙，邊緣波狀;革蘭氏染色陽性;菌體桿狀，末端鈍圓，成鏈狀排列，無莢膜，有 芽孢。
[0039] 實施例2B)生理生化特征
[0040]經(jīng)生理生化測定，目的菌株F-T1-2能夠水解牛奶、明膠，具有蛋白酶活性;能水解 淀粉和七葉苷，具有淀粉酶活性和葡萄糖苷酶活性;能利用檸檬酸鹽;硝酸還原測定為陽 性。具體的生理生化特征見表1。
[0041 ] 表1蠟樣芽孢桿菌的生理生化特征
[0043] 注:+表示陽性;-表示陰性
[0044] 實施例2C)16S rDNA鑒定
[0045] 測定菌株 16S rDNA序列，經(jīng)GenBank(http: //ncbi .nlm.nih. gov/BLAST)核酸數(shù)據(jù) 庫作比對分析(blasting)，與已知菌群的16S rDNA基因序列進行比較，調(diào)出與其序列同源 性較高的相關(guān)菌株的16S rDNA序列，計算測定菌株的核苷酸序列及其同源序列的遺傳距 離，用鄰接法(Neighbor-joining)推演系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0046]采用菌種鑒定通用引物，擴增目的菌落F-T1-2的16S rDNA序列，并送上海生工生 物工程股份有限公司測序。PCR擴增所用引物、體系、程序如表2-4所示：
[0047] 表2擴增引物
[0049] 表3反應(yīng)體系
[0053] 測序結(jié)果如SEQ ID No.l所示。經(jīng)GenBank核酸數(shù)據(jù)庫與已知菌群的16S rDNA基因 序列比對分析，調(diào)出與其序列同源性較高的相關(guān)菌株的16S rDNA序列，計算目的菌落F-T1 - 2的核苷酸序列及其同源序列的遺傳距離，用鄰接(Neighbor-joining)推演系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系， 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。綜合形態(tài)學(xué)分析、生理生化分析及16S rDNA鑒定，目的菌株F-T1-2 為蠟樣芽孢桿菌，記為蠟樣芽孢桿菌F-T1-2。
[0054]實施例3:培養(yǎng)條件的初步優(yōu)化
[0055] 實施例3A)不同起始pH值的選擇
[0056] 分別取lg K2HP〇4,0.5g Mg2S〇4 · 7H20,0.5g NaCl和O.lmL 100g/L的FeS〇4 · 7H20 配成8份液體培養(yǎng)基，該8份液體培養(yǎng)基分別使用1M硫酸或1M的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至4、5、6、7、 8、9、10、11，加雙蒸水補足至1000111匕
[0057]取蠟樣芽孢桿菌F-T1-2的菌種0.5mL，添加至上述不同pH值的無機液體培養(yǎng)基中， 以220r/min轉(zhuǎn)速于37°C培養(yǎng)24h，測定羽毛的降解率。不同起始pH值下的降解率如圖3所示， 由圖3可知，當無機液體培養(yǎng)基的起始pH為7時，降解率最高。
[0058]實施例3B)不同發(fā)酵溫度的選擇
[0059] 取蠟樣芽孢桿菌F-T1-2的菌種0.5mL，分別添加至5份pH為7的無機液體培養(yǎng)基中 以220r/min的轉(zhuǎn)速分別于不同溫度(27 °C，32 °C，37 °C，42 °C，47 °C )下培養(yǎng)24h，測定羽毛的 降解率。
[0060] 不同發(fā)酵溫度下蠟樣芽孢桿菌F-T1-2對羽毛的降解速率圖如圖4所示，培養(yǎng)溫度 為37 °C，起始pH值為7時，降解率最高，超過65 % ;而當培養(yǎng)溫度由37 °C上升時，降解速率呈 較大的下降趨勢。
[0061] 實施例3C)角蛋白酶酶活測定
[0062] 角蛋白酶酶活定義為:每毫升酶液在規(guī)定條件下反應(yīng)15min后0D值增加0.01為1個 酶活單位。
[0063] (1)取10g的偶氮蛋白加入至1600mL pH=7.4的磷酸緩沖液；
[0064] (2)用移液槍量取3.2mL上述磷酸緩沖液于試管中，37°C水浴中預(yù)熱2min;
[0065] (3)加入粗酶液0 · 8mL，在37 °C水浴中保溫反應(yīng)15min;
[0066] 該步驟(3)中，所述粗酶液為實施例3B)中的菌種在含有一根羽毛的pH為7的無機 液體培養(yǎng)中，37°C搖床震蕩培養(yǎng)24h后，經(jīng)離心分離后得到的上清液；
[0067] (4)加入質(zhì)量分數(shù)10 %三氯乙酸0 · 8mL，終止酶反應(yīng)；
[0068] (5)反應(yīng)液于10000r/min下離心6min，并在450nm下測定吸光值；
[0069] (6)反應(yīng)時加空白對照，空白對照在反應(yīng)液中先添加10 %三氯乙酸0.8mL，再加酶 液0·8mL。
[0070] 試驗結(jié)果表明，當發(fā)酵液起始pH=7,發(fā)酵溫度為37°C時，羽毛的降解率最高。發(fā)酵 24h后，如圖5所示，完整羽毛已經(jīng)完全脫落，肉眼只見0.5-lmm長度的羽毛細肩，粗酶液角蛋 白酶活力達到64.55U/mL。
[0071] 實施例4)蠟樣芽孢桿菌F-T1-2對不同畜禽廢棄物的降解效果
[0072] 取2天齡仔雞尸體一只，加入無機液體培養(yǎng)基中（初始pH = 7)，再添加占無機液體 培養(yǎng)基體積1 %的蠟樣芽孢桿菌F-T1-2菌株，37°C，220r/min震蕩72h后，如圖6所示，發(fā)酵液 呈乳白色，殘渣只見少量骨骼。
[0073] 取豬血凝塊，加入無機液體培養(yǎng)基中（初始PH=7 )，再添加占無機液體培養(yǎng)基體積 1 %的蠟樣芽孢桿菌F-T1-2菌株，37°C，220r/min震蕩培養(yǎng)72h后，如圖7所示，發(fā)酵液呈棕 色，血凝塊消失。
[0074] 取豬蹄(重14.56g) -塊，加入無機液體培養(yǎng)基中（初始pH = 7 )，再添加占無機液體 培養(yǎng)基體積1 %的蠟樣芽孢桿菌F-T1-2菌株，37°C，220r/min震蕩培養(yǎng)72h后，如圖8所示，發(fā) 酵液呈土黃色，皮毛消失，剩余殘渣(重9.31g)為蹄甲和趾骨，豬蹄的降解率為36.1%。
[0075] 取大鼠皮毛一塊(重37.54g)，無機液體培養(yǎng)基中（初始pH = 7)，再添加占無機液體 培養(yǎng)基體積1 %的蠟樣芽孢桿菌F-T1-2菌株，37°C，220r/min震蕩培養(yǎng)72h后，如圖9所示，發(fā) 酵液呈灰黃色，皮膚消失，剩余殘渣(重16.26g)為部分降解和未降解的鼠毛，大鼠皮毛的降 解率為56.7%。
[0076] 上述實施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，不能以此來限定本發(fā)明保護的范圍， 本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所 要求保護的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種產(chǎn)角蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌，其特征在于，其保藏號為CGMCCNo. 12184。2. 如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)角蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌在降解角蛋白上的應(yīng)用。3. 利用如利要求1所述的利用上述產(chǎn)角蛋白酶的蠟樣芽孢桿菌降解角蛋白的方法，包 括以下步驟： 1) 取含有角蛋白的待降解物，加入無機液體培養(yǎng)基中； 2) 向步驟1)所述的無機液體培養(yǎng)基中加入蠟樣芽孢桿菌菌株； 3) 將步驟2)后的無機液體培養(yǎng)基于27-47Γ震蕩至待降解物大部分降解。4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟1)中，所述無機液體培養(yǎng)基的pH值=4- 11〇5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟1)中，所述無機液體培養(yǎng)基的pH值=7。6. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2)中，蠟樣芽孢桿菌菌株的添加量為無 機液體培養(yǎng)基體積的1 %。7. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟3)中，于37tC震蕩至待降解物大部分降 解。8. 如權(quán)利要求3-7任一項所述的方法，其特征在于，步驟1)中，所述無機液體培養(yǎng)基包 括按重量份計的以下組分：1份K2HPO4，0.5份Mg 2SO4 · 7H20，0.5份NaCl，0.1份100g/L的 FeS〇4 · 7H20,調(diào)節(jié)pH量的H2S〇4或NaOH溶液，補足至1000份的雙蒸水。
【文檔編號】C12R1/085GK105950497SQ201610272867
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月27日
【發(fā)明人】黃妙容, 劉傳高, 鐘楚紅, 任廣彩, 陳瑞愛, 葉俊賢
【申請人】廣東溫氏大華農(nóng)生物科技有限公司, 肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司