一種高效表達(dá)Fe³⁺依賴型食品級(jí)酸性脲酶的枯草芽孢桿菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高效表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的枯草芽孢桿菌，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。Ni依賴性脲酶因Ni而存在安全隱患，為非食品酶，而Fe是人體含量的必需微量元素,對(duì)人體有益。本發(fā)明利用食品級(jí)枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功Bacillus substilis 168(pTTB)實(shí)現(xiàn)了Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的食品級(jí)高效表達(dá)，F(xiàn)e3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶酶活達(dá)到5.8U/mL、以EC為底物時(shí)酶活達(dá)到了1.3U/mL，相對(duì)于原始菌株地衣芽孢桿菌，大大的提高了食品級(jí)脲酶的表達(dá)產(chǎn)量，為食品級(jí)酸性脲酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【專利說(shuō)明】
一種高效表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的枯草芽孢桿菌
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種高效表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的枯草芽孢桿菌，屬于生物 工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 脲酶(Urease，EC3.5.1.5 )，廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌等中，其能專一性的 催化尿素水解產(chǎn)生兩分子氨和一分子碳酸。脲酶是世界上首次成功獲得的結(jié)晶態(tài)的酶，它 于1926年由Summer首次從刀豆中提取出。根據(jù)脲酶作用的最適pH值，可將脲酶分為酸性脲 酶、中性脲酶和堿性脲酶。
[0003] 氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate或Urethane，簡(jiǎn)稱EC)，具有遺傳毒性及致癌性， 廣泛存在于多種發(fā)酵食品（如醬油、食醋、泡菜)和酒精飲料(如黃酒、白酒、葡萄酒等）中。研 究證實(shí)發(fā)酵食品（如黃酒、醬油等）中尿素是EC形成的主要前體物質(zhì)，它和乙醇自發(fā)的反應(yīng) 生成EC，從而嚴(yán)重影響人類的健康。酸性脲酶可以高效消除發(fā)酵食品（如酒精類飲料）中的 尿素，從而可以有效的減少了 EC的形成。
[0004] 但是，已報(bào)道的脲酶均為Ni2+依賴性脲酶，Ni2+作為重金屬，對(duì)人類的健康影響也 存在隱患。因此，嚴(yán)格來(lái)講，Ni 2+依賴性脲酶均為非食品酶，應(yīng)用于食品中時(shí)存在安全隱患。 而鐵是人體含量的必需微量元素，是血紅蛋白的重要部分，人全身都需要它，這種礦物質(zhì)可 以存在于向肌肉供給氧氣的紅細(xì)胞中，還是許多酶和免疫系統(tǒng)化合物的成分。鐵對(duì)人體的 功能表現(xiàn)在許多方面，鐵參與氧的運(yùn)輸和儲(chǔ)存;促進(jìn)發(fā)育;增加對(duì)疾病的抵抗力；調(diào)節(jié)組織 呼吸，防止疲勞;構(gòu)成血紅素，預(yù)防和治療因缺鐵而引起的貧血;使皮膚恢復(fù)良好的血色。鑒 于鐵對(duì)人體有益的功能，可以添加到食品中，因此可以認(rèn)定Fe 3+依賴性脲酶為真正的食品 酶。
[0005] 因此，有必要尋找能夠真正用于食品的食品級(jí)Fe3+依賴性脲酶，并實(shí)現(xiàn)其在食品級(jí) 宿主中的高效表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明利用枯草芽孢桿菌成功實(shí)現(xiàn)了 Fe3+依賴型食品級(jí)酸性 脲酶的食品級(jí)高效表達(dá)，酸性脲酶酶活達(dá)到5.8U/mL，以EC為底物時(shí)酶活達(dá)到了 1.3U/mL，相 對(duì)于原始菌株地衣芽孢桿菌，大大的提高了 Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的表達(dá)產(chǎn)量，為酸性 脲酶的食品級(jí)工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供一種構(gòu)建枯草芽孢桿菌食品級(jí)高效表達(dá) Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的方法，是從地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis 9945a) 基因組上克隆獲得Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶基因 ureBL，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入枯草芽孢桿菌， 構(gòu)建高效表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的食品級(jí)表達(dá)體系，高效生產(chǎn)Fe 3+依賴型食品級(jí) 酸性脲酶。
[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的枯草芽孢桿 菌，所述枯草芽孢桿菌表達(dá)的Fe 3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶含有以下特征之一：
[0008] (4)結(jié)構(gòu)亞基UreA、UreB、UreC的氨基酸序列分別如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、 SEQIDNO.^/f*;
[0009] (5)結(jié)構(gòu)亞基的氨基酸序列是在（1)中氨基酸序列的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添 加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸得到的，且編碼具有氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶活性的由（1)衍生的 蛋白質(zhì)；
[0010] (6)具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶來(lái)源于Bacillus licheniformis 9945A、Bacillus licheniformis 12759、Bacillus licheniformis G_l、 Bacillus licheniformis S16或Bacillus licheniformis BL-09中的任意一種。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述枯草芽孢桿菌是將Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶 的基因連接到表達(dá)質(zhì)粒上得到重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌中得到的。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)質(zhì)?？梢允且韵氯我庖环N:pTTB、P43NMK、 pST0P1622、pHT43 或者 pMA5。
[0014] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述宿主菌可以是以下任意一種：BacillUS subtilis 168、Bacillus subtilis 168、WB600或者WB800〇
[0015] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的枯草芽孢桿 菌中，脲酶的表達(dá)受P43組成型啟動(dòng)子調(diào)控。
[0016] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的枯草芽孢桿 菌，具體構(gòu)建方法如下：
[0017] 1)從地衣芽孢桿菌基因組上克隆獲得Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶基因簇ureBL (基 因信息已于專利CN201510218597.1中所陳述），目的基因通過(guò)ΚρηΙ及Xhol克隆到質(zhì)粒pTTB (序列如SEQ ID從).7所示），得到重組質(zhì)粒?11^-11代81^
[0018] 2)將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTTB-ureBL轉(zhuǎn)化于Bacillus subtilis 168構(gòu)建產(chǎn)Fe3+依賴 型食品級(jí)酸性脲酶的重組Bacillus subtil is 168 (pTTB-ureBL)，F(xiàn)e3+依賴型食品級(jí)酸性脲 酶在重組Bacillus subtilisl68(pTTB-ureBL)中表達(dá)受P43組成型啟動(dòng)子調(diào)控。
[0019]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的方法，是以所 述枯草芽孢桿菌作為生產(chǎn)菌株。
[0020] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法是在利用生產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)酸性脲酶的過(guò) 程中添加 Fe3+。
[0021] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述Fe3+的添加量為2mM。
[0022] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶 方面的應(yīng)用。
[0023] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用，是利用其生產(chǎn)的Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲 酶來(lái)降低或消除發(fā)酵食品中的尿素和/或氨基甲酸乙酯。
[0024] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵食品包括酒精類飲料、醬油。
[0025] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵食品為黃酒、白酒、葡萄酒等。
[0026] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶 在發(fā)酵食品領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0027]本發(fā)明的有益效果：
[0028]本發(fā)明利用食品級(jí)枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)了 Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶 的食品級(jí)高效表達(dá)，酸性脲酶酶活達(dá)到5.8U/mL，以EC為底物時(shí)酶活達(dá)到了 1.3U/mL，相對(duì)于 原始菌株地衣芽孢桿菌（即基因來(lái)源菌株Bacillus licheniformis 9945A)，大大的提高了 Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的表達(dá)產(chǎn)量，為食品級(jí)酸性脲酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。由于 目前的脲酶幾乎均為Ni依賴性脲酶，因 Ni而存在安全隱患，為非食品酶，而Fe是人體含量的 必需微量元素，對(duì)人體有益，所以本發(fā)明的Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶能夠真正用于食品。
【附圖說(shuō)明】
[0029]圖1:食品級(jí)重組表達(dá)質(zhì)粒pTTB-ureBL構(gòu)建流程圖。
[0030] 圖2:重組Bacillus subtilisl68(pTTB-ureBL)搖瓶發(fā)酵時(shí)脲酶活力隨時(shí)間變化 曲線。
[0031] 圖3:重組Bacillus subtilisl68(pTTB-ureBL)搖瓶發(fā)酵30h時(shí)脲酶及氨基甲酸乙 酯水解酶活力。
【具體實(shí)施方式】 [0032] 材料與方法
[0033]種子培養(yǎng)基:木糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化鈉10g/L。
[0034] 發(fā)酵培養(yǎng)基:木糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化鈉10g/L及2mM FeCl3。
[0035] 氯化銨標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用超純水配制0 · lmmol/L、0 · 2mmol/L、0 · 3mmol/L、 0.4mm〇VL、0.5mmol/L的NH4+標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液管準(zhǔn)確移取lmL NH4+標(biāo)準(zhǔn)梯度液分別置于順 序編號(hào)的10mL比色管中。37°C下恒溫保溫30min，立即用吸lmL終止劑于比色管中，振蕩混 勻。再依次加入lmL顯色劑I和顯色劑II，強(qiáng)烈振蕩，使之充分混勻，反應(yīng)20min。超純水定容 至10mL，在625nm下比色測(cè)定0D值，以0D值為縱坐標(biāo)，NH 4+梯度為橫坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。 [0036] 脲酶及氨基甲酸乙酯水解酶酶活測(cè)定方法:取兩支10mL比色管，分別加入lmL酶液 和lmL滅活的酶液。然后在兩管中分別加入lmL 3%尿素（用20mM pH 4.5的梓檬酸緩沖液配 制），在37°C恒溫水浴箱中反應(yīng)30min后，在兩管各加入lmL終止劑（10%三氯乙酸），混勻后 加入lmL的顯色劑I (15g苯酚和0.625g亞硝基鐵氰化鈉用超純水定容至250mL)和lmL顯色劑 II(13.125g NaOH和7.5mLNaC10用超純水定容至250mL)，強(qiáng)烈震蕩，繼續(xù)在37°C恒溫水浴箱 中保溫20min后取出，用超純水稀釋到10mL，625nm處比色，測(cè)定0D值，計(jì)算酶活(采用氯化銨 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線）。
[0037]脲酶及氨基甲酸乙酯水解酶酶活單位定義:在常壓，20mM pH4.5檸檬酸-檸檬酸鈉 緩沖液及37°C條件下，每分鐘降解尿素生成2μπι〇1 NH4+所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。 [0038]氨基甲酸乙酯水解酶酶活單位定義:在常壓，20mM ρΗ4.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液 及37°C條件下，每分鐘降解尿素生成lymol ΝΗ4+所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。
[0039]實(shí)施例1 :Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶基因 ureBL克隆
[0040] 按照細(xì)菌基因組提取試劑盒（OMEGA)使用說(shuō)明提取地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis 9945a)基因組DNA。根據(jù)專利CN201510218597.1相關(guān)信息，設(shè)計(jì)正向引物 BL-F及反向引物BL-R(序列分別如表1所示），正向引物加上Κρη頂每切位點(diǎn)，反向引物加上 Xho I酶切位點(diǎn)。以地衣芽孢桿菌基因組DNA為模板，上述特異性引物為引物，對(duì)ureBL基因進(jìn) 行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：按照PrimerSTAR HS DNA Polymerase(TAKARA)試劑盒說(shuō)明書配制50μ1 反應(yīng)體系。擴(kuò)增條件為:98°C 30s 1個(gè)循環(huán)，98°C 10s，54°C5s，72°C 5min 48s，30個(gè)循環(huán)， 72°(：1〇11^11-個(gè)循環(huán)。？0?產(chǎn)物采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行切膠回收，回收約5.81^的0嫩 片段，回收方法參照膠回收試劑盒(TAKARA)說(shuō)明書進(jìn)行?；厥债a(chǎn)物送上海生工生物公司測(cè) 定核苷酸序列。
[0041 ] 表1 ureBL擴(kuò)增所用引物
[0042]
[0043] 實(shí)施例2:食品級(jí)重組工程菌Bacillus subtilisl68(pTTB-ureBL)構(gòu)建
[0044] 1)實(shí)施例1中所回收的ureBL片段(含有核苷酸序列為SEQ ID NO: 1所示的脲酶基 因）及質(zhì)粒PTTB分別用Κρη I及Xho I雙酶切，切膠回收后用T4DNA連接酶于16 °C過(guò)夜連接，連 接產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化Bacillus subtil is 168 〇
[0045] 2)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后涂布于含有10g/L木糖的LB固體培養(yǎng)基，37°C靜置培養(yǎng)，經(jīng)菌落 PCR鑒定，得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。成功獲得Fe3 +依賴型食品級(jí)酸性脲酶重組菌株Bacillus subtilisl68(pTTB-ureBL)〇
[0046] 實(shí)施例3 :Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的食品級(jí)高效表達(dá)
[0047] 對(duì)成功構(gòu)建的重組工程菌Bacillus subtilisl68(pTTB-ureBL)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí) 驗(yàn)。
[0048]種子液制備:將實(shí)驗(yàn)菌株接種至種子培養(yǎng)基中，250mL搖瓶中裝液25mL，溫度37°C， 200rpm 培養(yǎng) 12h。
[0049] 搖瓶發(fā)酵：按5%的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基(木糖10g/L，蛋白胨 10g/L，酵母膏5g/L，氯化鈉10g/L及2mM FeCl3)中，250mL搖瓶中裝液25mL，溫度37 °C、 200rpm培養(yǎng)30h。結(jié)果如圖2及圖3所示，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)30h時(shí)脲酶活力達(dá)到最高，此時(shí)以尿素 為底物時(shí)酶活為5.8U/ml，以EC為底物時(shí)酶活為1 . 3U/ml。而原始菌株Baci llus licheniformis 9945A脈酶最高酶活為0 · lU/ml 〇
[0050] 此外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加 FeCl3,發(fā)酵過(guò)程及發(fā)酵結(jié)束，均檢測(cè) 不到脲酶活力。
[0051] 雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的枯草芽孢桿菌，所述枯草芽孢桿菌表達(dá)的Fe 3+ 依賴型食品級(jí)酸性脲酶含有以下特征之一： (1) 結(jié)構(gòu)亞基UreA、UreB、UreC的氨基酸序列分別如SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID NO. 4所示； (2) 結(jié)構(gòu)亞基的氨基酸序列是在（1)中氨基酸序列的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添加一 個(gè)或幾個(gè)氨基酸得到的，且編碼具有氨基甲酸乙酯水解酶及脲酶活性的由（1)衍生的蛋白 質(zhì)； (3) 具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的枯草芽孢桿菌，其特征在 于，所述Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶來(lái)源于Bacillus licheniformis 9945A。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的枯草芽孢桿菌，其特征在 于，所述枯草芽孢桿菌是將Fe 3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的基因連接到表達(dá)質(zhì)粒上得到重組 質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌中得到的。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的枯草芽孢桿菌，其特征在 于，所述表達(dá)質(zhì)?？梢允且韵氯我庖环N:pTTB、pP43NMK、pST0P1622、pHT43或者pMA5。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的枯草芽孢桿菌，其特征在 于，所述宿主菌可以是以下任意一種:Bacillus subtilis 168、WB600或者WB800。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的枯草芽孢桿菌，其特征在 于，所述表達(dá)Fe 3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的枯草芽孢桿菌，具體構(gòu)建方法如下： 1) 從地衣芽孢桿菌基因組上克隆獲得Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶基因簇ureBL，目的基 因通過(guò)KpnI及XhoI克隆到序列如SEQ ID從).7所示的質(zhì)粒?11^，得到重組質(zhì)粒?11^-1^681^ 2) 將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTTB-ureBL轉(zhuǎn)化于Bacillus subtilis 168構(gòu)建產(chǎn)Fe3+依賴型食 品級(jí)酸性脲酶的重組BaciIlus subtil is 168(pTTB-ureBL)，F(xiàn)e3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶在 重組Bacillus subtilisl68(pTTB_ureBL)中表達(dá)受P43組成型啟動(dòng)子調(diào)控。7. -種生產(chǎn)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶的方法，其特征在于，所述方法是以權(quán)利要求1-6任一所述的枯草芽孢桿菌作為生產(chǎn)菌株。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法是在利用生產(chǎn)菌株發(fā)酵生產(chǎn)酸性 脲酶的過(guò)程中添加 Fe3+。9. 權(quán)利要求1-6任一所述枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)Fe3+依賴型食品級(jí)酸性脲酶方面的應(yīng)用。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是利用其生產(chǎn)的Fe3+依賴型食品 級(jí)酸性脲酶來(lái)降低或消除發(fā)酵食品中的尿素和/或氨基甲酸乙酯。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK105950527SQ201610398354
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月7日
【發(fā)明人】康振, 陳堅(jiān), 堵國(guó)成, 劉慶濤, 楊森
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)