產(chǎn)3-羥基丙酸的重組谷氨酸棒桿菌、其構(gòu)建方法及應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及產(chǎn)3?羥基丙酸的重組谷氨酸棒桿菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，所述重組谷氨酸棒桿菌是通過(guò)在谷氨酸棒狀桿菌中過(guò)表達(dá)內(nèi)源的磷酸二羥基丙酮磷酸酯酶基因hdpA，并過(guò)表達(dá)甘油脫氫酶基因gldA、甘油脫水酶及其激活因子基因pduCDEGH及3?羥基丙醛脫氫酶基因aldH構(gòu)建得到的。利用該重組菌發(fā)酵生產(chǎn)3?羥基丙酸，由于谷氨酸棒桿菌能夠利用不同的廉價(jià)原料進(jìn)行發(fā)酵，因此可進(jìn)一步降低原料的成本。本發(fā)明解決了生物安全性以及菌株對(duì)酸的耐受性問(wèn)題。同時(shí)發(fā)酵過(guò)程中的菌體可作為產(chǎn)品，用于飼料添加劑中。本方法副產(chǎn)物少，使終產(chǎn)物3?羥基丙酸的分離過(guò)程得到簡(jiǎn)化。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
產(chǎn)3-羥基丙酸的重組谷氨酸棒桿菌、其構(gòu)建方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程及微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種產(chǎn)3-羥基丙酸的重 組谷氨酸棒桿菌、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 3-羥基丙酸是一種重要的潛在平臺(tái)化合物。2004年，美國(guó)能源部列出了當(dāng)前世界 12種最具潛力開(kāi)發(fā)的生物基化工產(chǎn)品，3-羥基丙酸位列第三。3-羥基丙酸是一種重要的功 能性有機(jī)酸，可以直接作為食品或飼料的添加劑和防腐劑。其更重要的潛在用途是作為一 種C3平臺(tái)化合物，通過(guò)耦合現(xiàn)有的成熟催化技術(shù)如脫水、氧化、還原、酯化、聚合等反應(yīng)將其 轉(zhuǎn)化為多種重要的化工產(chǎn)品，如丙烯酸、丙二酸、1，3_丙二醇、丙烯酰胺、丙烯氰、聚3-羥基 丙酸等。3-羥基丙酸作為平臺(tái)化合物具有非常廣闊的市場(chǎng)前景。
[0003] 目前，3-羥基丙酸的工業(yè)化生產(chǎn)幾乎全部基于化學(xué)合成法，主要包括丙烯酸水合 法和3-羥基丙氰水解法等。由于這些方法都是基于昂貴的石油化工原料，且產(chǎn)品分離過(guò)程 復(fù)雜、污染嚴(yán)重等，利用化學(xué)法生產(chǎn)3-羥基丙酸的經(jīng)濟(jì)效益差，實(shí)際工業(yè)產(chǎn)量很低，未能使 其成為一種廣泛應(yīng)用的平臺(tái)化合物。因此，開(kāi)發(fā)可利用廉價(jià)豐富的原料直接生產(chǎn)3-羥基丙 酸的綠色生物工藝，大幅度降低3-羥基丙酸的生產(chǎn)成本，是3-羥基丙酸大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn) 的前提。
[0004] 目前，生物法生產(chǎn)3-羥基丙酸的研究主要集中在以下三個(gè)方面：1)可直接產(chǎn)3-羥 基丙酸的野生菌的篩選和誘變;2)利用葡萄糖產(chǎn)3-羥基丙酸的基因工程菌的構(gòu)建;3)利用 甘油產(chǎn)3-羥基丙酸的基因工程菌的構(gòu)建。
[0005] 產(chǎn)3-羥基丙酸野生菌的篩選和誘變主要是集中在對(duì)假絲酵母的選育與誘變。利用 假絲酵母野生菌或者誘變菌產(chǎn)3-羥基丙酸需要以?xún)r(jià)格昂貴的丙酸為碳源，經(jīng)濟(jì)可行性較 差，且假絲酵母的基因工程改造比較困難。
[0006] 以葡萄糖為底物生產(chǎn)3-羥基丙酸存在不同的可能途徑。Cargill公司以乳酸為中 間產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)丙酰CoA轉(zhuǎn)移酶、乳酰CoA脫水酶和3-羥基丙酰水解酶的催化等三步反應(yīng)生成 3-羥基丙酸。通過(guò)在大腸桿菌內(nèi)引入這三個(gè)外源酶，并進(jìn)一步進(jìn)行系統(tǒng)代謝工程改造，3-羥 基丙酸的產(chǎn)量達(dá)到20g/L APXbio公司以乙酰CoA為代謝前體，經(jīng)過(guò)乙酰CoA羧化酶和丙酰 CoA還原酶的催化生產(chǎn)3-羥基丙酸，經(jīng)過(guò)基因工程改造，3-羥基丙酸的產(chǎn)量達(dá)到20g/L以上。 這一技術(shù)路線(xiàn)的主要缺點(diǎn)是大多數(shù)基因工程菌種對(duì)3-羥基丙酸的耐受性差，3-羥基丙酸產(chǎn) 量較低。
[0007] 利用甘油產(chǎn)3-羥基丙酸的基因工程菌的構(gòu)建，主要通過(guò)在克雷伯氏肺炎桿菌或者 大腸桿菌中引入醛氧化酶將3-羥基丙醛氧化成3-羥基丙酸。這一技術(shù)路線(xiàn)的缺點(diǎn)是甘油的 價(jià)格相對(duì)較高，并且這一過(guò)程產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物如1，3_丙二醇等。
[0008] 針對(duì)目前3-羥基丙酸生產(chǎn)工藝中存在的技術(shù)問(wèn)題，特別是副產(chǎn)物多，原料成本高， 菌株對(duì)酸的耐受力差等問(wèn)題，亟待開(kāi)發(fā)一種生產(chǎn)3-羥基丙酸的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)3-羥基丙酸的重組谷氨酸棒桿菌及其構(gòu)建方法。
[0010] 本發(fā)明的另一目的是提供利用上述重組谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸的方 法。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種產(chǎn)3-羥基丙酸的重組谷氨酸棒桿菌，所述 重組谷氨酸棒桿菌是通過(guò)在谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)中過(guò)表達(dá)內(nèi) 源的磷酸二羥基丙酮磷酸酯酶基因 hdpA，并過(guò)表達(dá)甘油脫氫酶基因 gldA、甘油脫水酶及其 激活因子基因 pdu⑶EGH及3-羥基丙醛脫氫酶基因 aldH構(gòu)建得到的。
[0012] 本發(fā)明所述甘油脫氫酶基因 gldA、3-羥基丙醛脫氫酶基因 aldH來(lái)源于大腸桿菌， 基因 gldA和aldH的核苷酸序列分別如SEQ ID N0:2和4所示;所述甘油脫水酶及其激活因子 基因 pdu⑶EGH來(lái)源于克雷伯氏肺炎桿菌，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示;所述磷酸二羥 基丙酮磷酸酯酶基因 hdpA的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
[0013] 除了表達(dá)來(lái)自克雷伯氏肺炎桿菌的甘油脫水酶外，表達(dá)其他來(lái)源的甘油脫水酶同 樣可以實(shí)現(xiàn)相同的功能。
[0014] 優(yōu)選地，本發(fā)明使用的宿主菌為谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032。
[0015]所述重組谷氨酸棒桿菌是將基因 hdpA、gldA、aldH以及甘油脫水酶及其激活因子 基因 pduCDEGH構(gòu)建到原核表達(dá)載體上，然后導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌中，構(gòu)建得到的，或者將上 述基因整合到谷氨酸棒狀桿菌基因組中構(gòu)建得到的。
[0016] 在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，將基因 hdpA和gldA構(gòu)建到大腸桿菌-谷氨酸棒 桿菌穿梭質(zhì)粒pEC-K18mob2上，得到的重組載體命名為pEC-hdpA-gldA，然后用pEC-hdpA-gldA轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌，得到的重組菌命名為C · glutamicum/pEC-hdpA-gldA;再將甘油 脫水酶及其激活因子基因 PduCDEGH以及基因 aldH構(gòu)建到大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭質(zhì)粒 口父]\^19上，得到的重組載體命名為？乂]\^-31(1!11(111，用？乂]\^-3 1(1!11(111轉(zhuǎn)化重組菌 C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA，篩選陽(yáng)性克隆即得重組谷氨酸棒桿菌，命名為 C·glutamicum/pEC-hdpA-gldA/pXMJ-aldH-pdu 〇
[0017] 本發(fā)明還提供所述重組谷氨酸棒桿菌的構(gòu)建方法，通過(guò)將基因 hdpA、gldA、aldH以 及甘油脫水酶及其激活因子基因 PduCDEGH構(gòu)建到原核表達(dá)載體上，然后導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿 菌中，構(gòu)建得到重組谷氨酸棒桿菌，或者將上述基因整合到谷氨酸棒狀桿菌基因組中構(gòu)建 得到重組谷氨酸棒桿菌。
[0018] 例如，可將基因 hdpA、gldA、aldH以及甘油脫水酶及其激活因子基因 pduCDEGH分別 構(gòu)建到不同原核表達(dá)載體上，然后共同導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌中，構(gòu)建得到重組谷氨酸棒桿 菌，或者將基因 hdpA、gldA、aldH以及甘油脫水酶及其激活因子基因 pduCDEGH分別構(gòu)建到同 一原核表達(dá)載體上，然后導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌中，構(gòu)建得到重組谷氨酸棒桿菌。
[0019] 本發(fā)明進(jìn)一步提供所述重組谷氨酸棒桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸中的應(yīng)用，所述 應(yīng)用是以葡萄糖等可發(fā)酵糖為原料進(jìn)行好氧發(fā)酵。
[0020] 在本發(fā)明的一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，利用重組谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸的 方法，包括以下步驟：
[0021] S1、種子液的制備
[0022] 將重組谷氨酸棒桿菌 C. glutamicum/pEC-hdpA-gldA/pXMJ-aldH-pdu 在 LB 平板上 過(guò)夜培養(yǎng)。從該新鮮平板上單菌落接種到含有30ml種子培養(yǎng)基的250ml帶檔板搖瓶中，28-35 °C (優(yōu)選32 °C)、200rpm培養(yǎng)12小時(shí)，所得種子液的0D6QQ值為10-20。
[0023] 種子培養(yǎng)基的配方包括(g/L):葡萄糖 10-30,（NH4)2S〇4 2.0-10，K2HP〇4 0.5-3·0， MgS〇4 0.1-1.0，MnS〇4 0.005-0 .l，F(xiàn)eS〇4 0.005-0.1，玉米漿10-30,卡那霉素0.025,以水配 制。優(yōu)選地，種子培養(yǎng)基的配方包括（g/L):葡萄糖25，（NH4) 2S〇4 5.0，K2HP〇4 1.5，MgS〇4 1.0，MnS〇4 0.005，F(xiàn)eS〇4 0.005,玉米漿30,卡那霉素0.025。
[0024] S2、發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸
[0025]以10% (v/v)的接種量將種子液接種到2L發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵采用5L的發(fā)酵罐，控 制溫度為28-35°C (優(yōu)選32°C)，通氣量為0.1-2vvm，調(diào)整轉(zhuǎn)速使得溶氧水平保持在10%以 上，通過(guò)流加氨水控制pH值穩(wěn)定在5-8，優(yōu)選pH值6-7。發(fā)酵周期為32-72小時(shí)。
[0026]發(fā)酵培養(yǎng)基配方包括(g/L):葡萄糖10-10(^/1，（順4)230410-30.(^/1，1(2冊(cè)04 1-2.5g/L，MgS〇4 0.1-1 .Og/L，MnS〇4 0.010-0. lg/L，F(xiàn)eS〇4 0.010-0. lg/L，玉米漿l-15g/L，生 物素0·0005-0. lg/L，鹽酸硫胺素0·005-0· lg/L，維生素 B12 0·005-0· lg/L。優(yōu)選地，發(fā)酵培 養(yǎng)基配方包括（g/L):葡萄糖 100,（NH4)2S〇4 30 ·0，Κ2ΗΡ〇4 2.5，MgS〇4 1.0，MnS〇4 0.010， FeS〇4 0.010，玉米漿15,生物素0.0005，鹽酸硫胺素0.005，維生素 B12 0.005。
[0027] 前述的方法，發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)向發(fā)酵培養(yǎng)基中流加補(bǔ)充碳源，可進(jìn)一步提高3-羥 基丙酸的產(chǎn)量。
[0028] 本發(fā)明利用谷氨酸棒桿菌作為宿主菌，可以有效地解決高濃度3-羥基丙酸對(duì)菌體 的抑制問(wèn)題。目前文獻(xiàn)中所采用克雷伯氏肺炎桿菌、大腸桿菌等菌株對(duì)酸的耐受力差，當(dāng)3-羥基丙酸濃度大于200mM-300mM時(shí)，3-羥基丙酸會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生明顯的抑制作 用。谷氨酸棒桿菌是一種食品安全級(jí)的微生物，廣泛應(yīng)用于氨基酸的生產(chǎn)，比如谷氨酸和賴(lài) 氨酸的生產(chǎn)，谷氨酸棒桿菌能夠耐受極高的酸濃度，例如利用谷氨酸棒桿菌能夠高產(chǎn)達(dá)到 200-250g/L的谷氨酸或者賴(lài)氨酸。
[0029]本發(fā)明提出一條全新的3-羥基丙酸生物合成途徑（圖1)。首先，利用谷氨酸棒桿菌 內(nèi)源的糖酵解途徑將葡萄糖等可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化成磷酸二羥基丙酮，后者在谷氨酸棒桿菌內(nèi)源 的磷酸二羥基丙酮磷酸酯酶催化下生成二羥基丙酮。進(jìn)一步通過(guò)在在谷氨酸棒桿菌內(nèi)引入 外源的甘油脫氫酶將二羥基丙酮轉(zhuǎn)化成甘油。甘油在甘油脫水酶及3-羥基丙醛脫氫酶的作 用下最終生成3-羥基丙酸。由于谷氨酸棒桿菌能夠利用不同的廉價(jià)原料進(jìn)行發(fā)酵，例如利 用廢棄糖蜜、蔗糖、淀粉水解液等，同時(shí)還可以使用廉價(jià)的玉米漿作為營(yíng)養(yǎng)成分替代昂貴的 酵母粉，因此可以進(jìn)一步降低原料的成本。
[0030] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0031] ( -）以重組谷氨酸棒桿菌作為3-羥基丙酸生產(chǎn)菌株，解決了生物安全性以及菌株 對(duì)酸的耐受性問(wèn)題。同時(shí)發(fā)酵過(guò)程中的菌體可作為產(chǎn)品，用于飼料添加劑中。
[0032] (2)本方法副產(chǎn)物少，使終產(chǎn)物3-羥基丙酸的分離過(guò)程得到簡(jiǎn)化。
【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1為本發(fā)明利用重組谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)3-羥基丙酸的代謝途徑。
【具體實(shí)施方式】
[0034]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001)，或按照制造廠(chǎng)商說(shuō)明書(shū)建議的條件。 [0035]以下實(shí)施例中使用的大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭質(zhì)粒pEC-K18mob2、pXMJ19購(gòu)自 Addgene。
[0036] 實(shí)施例1在Corynebacterium glutamicum中過(guò)表達(dá)磷酸二羥基丙酮磷酸酯酶基 因 hdpA和來(lái)源于大腸桿菌的甘油脫氫酶基因 gldA
[0037] 以谷氨酸棒桿菌ATCC 1 30 3 2的基因組為模板，以引物11(1?六-?(5/-cagctatgaccatgattacgATAAGGCTGATTAGCGGGAAAATTTCG-3 7 )和hclpA-RG7 -CCAGTCGTGTCTAGTCAGTGAACTGCTGCTCATCT-3')為引物進(jìn)行PCR，獲得hdpA基因（hdpA基因序 列如SEQ ID N0:1所示）約0.9kb并進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。以大腸桿菌MG1655的基因組為模板， 以引 物gldA-FG7 -CACTGACTAGACACGACTGGAATGCCGC-37 )和gldA-RG7 -atccccgggtaccgagctcgttaTTCCCACTCTTGCAGGAAACGC-3')為引物進(jìn)行PCR，獲得gldA基因 (gldA基因序列如SEQ ID N0:2所示)約1.2kb并進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。將大腸桿菌-谷氨酸棒桿 菌穿梭質(zhì)粒pEC-K18mob2(Journal of Biotechnology 104(2003)287-299)用EcoRI進(jìn)行酶 切，利用Gibson Assembly試劑盒(NEB)將hpdA片段和gldA片段一步連接到pEC_K18mob2上， 獲得的重組質(zhì)粒命名為pEC-hdpA-g 1 dA。利用電穿孔儀(伯樂(lè))將pEC-hdpA-g 1 dA通過(guò)電轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)入到谷氨酸棒桿菌ATCC 13032中，電擊條件為電壓2.5KV，電阻600 Ω，電容25yF(電擊杯 寬度為2mm)。在含25mg/L的卡那霉素 LB平板上篩選獲得重組菌，命名為(^11^11^11111/^(：-hdpA-gldA。
[0038] 實(shí)施例2過(guò)表達(dá)來(lái)源于克雷伯氏肺炎桿菌的甘油脫水酶及其激活因子基因 pdu⑶EGH和來(lái)自大腸桿菌的3-羥基丙醛脫氫酶基因 aldH
[0039] 以克雷伯氏肺炎桿菌H R 5 2 6的基因組為模板，以引物p d u - F ( 5 '-GGAGGCCtgaAAGGAGATATACCATGAGATCGAAAAGATTTG-37 )和pdu-lUS7-gctcggtacccggggatcctTTAAGCATGGCGATCCCGAAAT-3')為引物進(jìn)行PCR，獲得包括甘油脫水 酶及其激活因子的pduCDEGH操縱子片段(序列如SEQ ID N0:3所示)并進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。以 大腸桿菌H R 5 2 6的基因組為模板，以引物a 1 d Η - F ( 5 '-tgcatgcctgcaggtcgactCTGACGTTCACAAACTGCATATATCTGATAGAC-3')和aldH-RG'-TATATCTCCTTtcaGGCCTCCAGGCTTATCCA-3〇為引物進(jìn)行PCR，獲得3-羥基丙酸脫氫酶基因 aldH片段（序列如SEQ ID N0:4所示）并進(jìn)行純化。將大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭質(zhì)粒 PXMJ19用Xbal進(jìn)行酶切，利用Gibson Assembly試劑盒(NEB)將pduCDEGH操縱子片段和aldH 片段一步連接到PXMJ19上，獲得的重組質(zhì)粒命名為pXMJ-aldH-pdu。利用電穿孔儀(伯樂(lè))將 pXMJ-aldH-pdu通過(guò)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入到谷氨酸棒桿菌C. glutamicum/pEC-hdpA-gldA中，電擊條 件如實(shí)施例1所述。在含5mg//L的氯霉素和25mg/L的卡那霉素 LB平板上篩選獲得重組菌，命 名為 C.glutami cum/pEC-hdpA-g 1 dA/pXMJ-a 1 dH-pdu 〇
[0040] 實(shí)施例3利用重組谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸
[0041 ] 將谷氨酸棒桿菌野生菌株ATCC 13032以及重組菌C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA， C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA/pXMJ-aldH-pdu分別在LB平板上過(guò)夜培養(yǎng)。從該新鮮平板上 單菌落接種到含有30ml種子培養(yǎng)基的250ml帶檔板搖瓶中，32°C200rpm培養(yǎng)12小時(shí)，所得種 子液的OD6QQ值為10。
[0042] 種子培養(yǎng)基的配方包括（g/L):葡萄糖25，（NH4)2S〇4 5.0，K2HP〇4 1.5，MgS〇4 1.0， MnS〇4 0.005，F(xiàn)eS〇4 0.005,玉米漿30,卡那霉素0.025。
[0043] 以10% (v/v)的接種量將種子液接種到2L發(fā)酵培養(yǎng)基當(dāng)中，發(fā)酵采用5L的發(fā)酵罐， 控制溫度為32°C，通氣量為lvvm，調(diào)整轉(zhuǎn)速使得溶氧水平保持在10%以上，通過(guò)流加氨水控 制pH值穩(wěn)定在7.0左右。
[0044] 發(fā)酵培養(yǎng)基配方包括(g/L):葡萄糖100，（NH4)2S〇4 30.0，K2HP〇4 2.5，MgS〇4 1.0， MnS〇4 0.010，F(xiàn)eS〇4 0.010，玉米漿 15,生物素0.0005，鹽酸硫胺素0.005，維生素 B12 0.005。
[0045] 發(fā)酵48小時(shí)，野生菌株ATCC 13032不產(chǎn)甘油以及3-羥基丙酸，C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA 產(chǎn) 48g/L 的甘油但不產(chǎn) 3-羥基丙酸。C · glutamicum/pEC-hdpA-gldA/pXMJ-aldH-pdu產(chǎn)42g/L的3-羥基丙酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.42g/g。
[0046] 上述發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)向發(fā)酵培養(yǎng)基中流加補(bǔ)充碳源，可進(jìn)一步提高3-羥基丙酸 的產(chǎn)量。
[0047]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 產(chǎn)3-羥基丙酸的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，所述重組谷氨酸棒桿菌是通過(guò)在 谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)中過(guò)表達(dá)內(nèi)源的磷酸二羥基丙酮磷酸酯 酶基因 hdpA，并過(guò)表達(dá)甘油脫氫酶基因 gldA、甘油脫水酶及其激活因子基因 pduCDEGH及3-羥基丙醛脫氫酶基因 aldH構(gòu)建得到的。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，所述甘油脫氫酶基因 gldA、 3-羥基丙醛脫氫酶基因 aldH來(lái)源于大腸桿菌，基因 gldA和aldH的核苷酸序列分別如SEQ ID NO: 2和4所示;所述甘油脫水酶及其激活因子基因 pduCDEGH來(lái)源于克雷伯氏肺炎桿菌，其核 苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;所述磷酸二羥基丙酮磷酸酯酶基因 hdpA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，所述谷氨酸棒狀桿菌為 ATCC 13032〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，將基因 hdpA、gldA、 aldH以及甘油脫水酶及其激活因子基因 pduCDEGH構(gòu)建到原核表達(dá)載體上，然后導(dǎo)入谷氨酸 棒狀桿菌中，構(gòu)建得到重組谷氨酸棒桿菌，或者將上述基因整合到谷氨酸棒狀桿菌基因組 中構(gòu)建得到重組谷氨酸棒桿菌。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，將基因 hdpA和gldA構(gòu)建到大 腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭質(zhì)粒pEC-K18mob2上，得到的重組載體命名為pEC-hdpA-gldA，然 后用pEC-hdpA-gldA轉(zhuǎn)化谷氨酸棒狀桿菌，得到的重組菌命名為C.glutamicum/pEC-hdpA-gldA; 再將甘油脫水酶及其激活因子基因 pduCDEGH 以及基因 aldH 構(gòu)建到大腸桿菌-谷氨酸 棒桿菌穿梭質(zhì)粒PXMJ19上，得到的重組載體命名為pXMJ-aldH-pdu，用pXMJ-aldH-pdu轉(zhuǎn)化 重組菌C · glutamicum/pEC-hdpA-gldA，篩選陽(yáng)性克隆即為重組谷氨酸棒桿菌。6. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述重組谷氨酸棒桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，將基因 hdpA、 gldA、aldH以及甘油脫水酶及其激活因子基因 pduCDEGH構(gòu)建到原核表達(dá)載體上，然后導(dǎo)入 谷氨酸棒狀桿菌中，構(gòu)建得到重組谷氨酸棒桿菌，或者將上述基因整合到谷氨酸棒狀桿菌 基因組中構(gòu)建得到重組谷氨酸棒桿菌。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，將基因 hdpA、gldA、aldH以及甘油脫水酶及 其激活因子基因 PduCDEGH分別構(gòu)建到不同原核表達(dá)載體上，然后共同導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌 中，構(gòu)建得到重組谷氨酸棒桿菌，或者將基因 hdpA、gldA、aldH以及甘油脫水酶及其激活因 子基因 pduCDEGH分別構(gòu)建到同一原核表達(dá)載體上，然后導(dǎo)入谷氨酸棒狀桿菌中，構(gòu)建得到 重組谷氨酸棒桿菌。8. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述重組谷氨酸棒桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)3-羥基丙酸中的應(yīng)用，所述 應(yīng)用是以可發(fā)酵糖為原料進(jìn)行好氧發(fā)酵。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所用發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖IO-100g/ Lj(NH4)2SO4 10-30.Og/L,K2HPO4 1-2.5g/L,MgSO4 0.1-1.Og/L,MnSO4 0.010-0.lg/L,FeSO4 0.010-0. lg/L，玉米漿l-15g/L，生物素0.0005-0. lg/L，鹽酸硫胺素0.005-0. lg/L，維生素 B12 0.005-0.lg/L； 發(fā)酵條件為：以10%的接種量將種子液接種到2L發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵米用5L的發(fā)酵罐， 控制溫度為28-35°C，通氣量為0.1-2vvm，調(diào)整轉(zhuǎn)速使得溶氧水平保持在10%以上，通過(guò)流 加氨水控制pH值穩(wěn)定在5-8，發(fā)酵周期30-72小時(shí)。10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其特征在于，發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)向發(fā)酵培養(yǎng)基中流加 補(bǔ)充碳源，進(jìn)一步提高3-羥基丙酸的產(chǎn)量。
【文檔編號(hào)】C12P7/42GK105950529SQ201610474970
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月24日
【發(fā)明人】陳振, 劉德華
【申請(qǐng)人】清華大學(xué), 東莞深圳清華大學(xué)研究院創(chuàng)新中心