一種神經(jīng)母細胞瘤在手性金納米粒子薄膜上分化的方法
【專利摘要】一種神經(jīng)母細胞瘤在手性金納米粒子薄膜上分化的方法，屬于生物科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括如下步驟：20nm粒徑的金納米粒子合成、單層金納米粒子薄膜的制備和神經(jīng)細胞的培養(yǎng)與分化誘導(dǎo)。本發(fā)明提供了一種細胞選擇性分化的手性培養(yǎng)平臺，為神經(jīng)受損導(dǎo)致的相關(guān)疾病的治療提供了新的途徑。
【專利說明】
一種神經(jīng)母細胞瘤在手性金納米粒子薄膜上分化的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種神經(jīng)母細胞瘤在手性金納米粒子薄膜上分化的方法，屬于生物科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]近20年來，神經(jīng)母細胞瘤發(fā)病的分子機制的研究取得很大進展，治療方法亦有許多改進，但臨床療效并無多大提高。然而，神經(jīng)母細胞瘤的自然退化這一奇特現(xiàn)象卻吸引著人們關(guān)注。神經(jīng)母細胞瘤被認為是最有希望用以揭示腫瘤逆轉(zhuǎn)自然過程的腫瘤，有助于最終采取措施抑制其惡性進程。
[0003]神經(jīng)母細胞瘤可以自行退化，少數(shù)表達N-myc基因的病例在極少或無系統(tǒng)治療的情況下也可完全消退或分化。因此人們設(shè)想誘導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤分化，逆轉(zhuǎn)其惡性進程可能比直接殺傷腫瘤細胞更合乎自然。體外研究發(fā)現(xiàn)，能誘導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤分化的物質(zhì)有維甲酸，γ-干擾素，二丁基環(huán)磷酸腺苷，苯乙酸鈉等，其中研究最多的是維甲酸。維甲酸在預(yù)防和治療癌癥方面潛力巨大，在臨床使用中耐受良好，個別病例即使對放療、化療均無反應(yīng)，用維甲酸治療后可長期緩解。
[0004]基于神經(jīng)母細胞瘤的誘導(dǎo)分化的研究，人們做了很多出色的工作。然而，手性界面對神經(jīng)母細胞瘤的分化影響仍有很大的探索空間。本發(fā)明利用單層金納米粒子薄膜構(gòu)建左右旋手性界面，揭示了手性界面在誘導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤分化中所起的重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種神經(jīng)母細胞瘤在手性金納米粒子薄膜上分化的方法。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案，一種神經(jīng)母細胞瘤在手性金納米粒子薄膜上分化的方法，步驟為:
(1)神經(jīng)母細胞瘤在手性金納米粒子薄膜上的培養(yǎng):將左旋或右旋手性的金納米粒子薄膜置于6孔的細胞培養(yǎng)板孔中；用5mL胰酶消化25mL細胞培養(yǎng)瓶中的神經(jīng)母細胞瘤細胞NG108-15 5min，將胰酶倒掉后，用含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基將細胞吹起;在放有左旋或右旋手性的金納米粒子薄膜的細胞培養(yǎng)板孔中加含2 X 14個細胞/mL的培養(yǎng)基，置于37°C 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng);24h后觀察細胞形態(tài)及密度，左旋手性的金納米粒子薄膜上細胞呈長條舒展狀態(tài)，右旋手性的金納米粒子薄膜上細胞呈圓形，且左旋手性的金納米粒子薄膜上細胞密度大于右旋手性的金納米粒子薄膜上細胞密度；
(2)神經(jīng)母細胞瘤在手性金納米粒子薄膜上的分化:細胞在左旋及右旋手性的金納米粒子薄膜上分別培養(yǎng)24h后，更換新的培養(yǎng)基，加維甲酸至終濃度為IyM，繼續(xù)培養(yǎng)2天后，觀察細胞形態(tài);左旋及右旋手性的金納米粒子薄膜上細胞均長出突觸;其中，左旋手性的金納米粒子薄膜上細胞呈細長型，只兩端長出突觸，右旋手性的金納米粒子薄膜上四周均有突觸長出。
[0007]所述手性單層金納米粒子薄膜的制備步驟如下: (1)20nm粒徑的金納米粒子合成及L/D型半胱氨酸修飾:
a、3-4nm金納米種子的合成:采用硼氫化鈉還原法合成;取120mL超純水，依次加入147μL質(zhì)量濃度1%檸檬酸三鈉和0.5mL 1mM氯金酸，充分混合后，在劇烈攪拌的狀態(tài)下加入
0.6mL新配制的0.1M的硼氫化鈉，即得到3_4nm金納米種子溶液；
b、20nm粒徑的金納米粒子合成:采用種子生長法合成;在195mL超純水中加入5mL1mM氯金酸，加熱至沸騰，同時加入步驟a制備得到的1.5mL金納米種子溶液和SOOyL 1%的檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸至顏色不變，即得到20nm粒徑的金納米粒子溶液；
將合成好的金納米粒子溶液9000rpm離心1min，25 °C濃縮重懸在原溶液1/10體積的超純水中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至10，待用；取兩份溶液，分別加入L型半胱氨酸及D型半胱氨酸至終濃度為100yg/mL，攪拌過夜，9000rpm離心，去除溶液中多余的半胱氨酸，重懸，得到左旋及右旋手性的金納米粒子溶液；
(2)金納米粒子薄膜的制備及轉(zhuǎn)移:將步驟(I)所得修飾好L/D型半胱氨酸的左旋或右旋手性的金納米粒子溶液倒入小燒杯中，加入5mL正己烷，然后緩慢滴加無水乙醇；滴加過程中，金膜會逐漸浮出在界面上，將金膜轉(zhuǎn)移到聚二甲基硅氧烷PDMS膜上，得到具有左旋或右旋手性的金納米粒子薄膜，晾干待用。
[0008]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明利用單層金納米粒子薄膜構(gòu)建左右旋手性界面，揭示了手性界面在誘導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤分化中所起的重要作用。
【附圖說明】
[0009]圖1是本發(fā)明中轉(zhuǎn)移到聚二甲基硅氧烷PDMS膜上的金納米粒子薄膜。
[0010]圖2-a是左旋金納米粒子薄膜的紫外可見光吸收光譜。
[0011]圖2-b是右旋金納米粒子薄膜的紫外可見光吸收光譜。
[0012]圖3是本發(fā)明中手性金納米粒子薄膜的圓二色圖譜。
[0013]圖4是NG108-15細胞在金膜上培養(yǎng)24h后的顯微鏡照片。
[0014]圖5是加維甲酸誘導(dǎo)2天后手性金納米粒子薄膜上分化細胞的激光共聚焦照片。
【具體實施方式】
[0015]實施例1
1、手性單層金納米粒子薄膜的制備
(1)20 nm粒徑的金納米粒子合成及L/D型半胱氨酸修飾;20 nm粒徑的金納米粒子采用種子生長法合成。
[00? 6] a、3_4nm金納米種子的合成:采用硼氫化鈉還原法合成;取1201111^超純水，依次加入147yL質(zhì)量濃度1%梓檬酸三鈉和0.5mL 1mM氯金酸，充分混合后，在劇烈攪拌的狀態(tài)下加入
0.6mL新配制的0.1M的硼氫化鈉，即得到3_4nm金納米種子溶液；
b、20nm粒徑的金納米粒子合成:采用種子生長法合成;在195mL超純水中加入5mL 1mM氯金酸，加熱至沸騰，同時加入步驟a制備得到的1.5mL金納米種子溶液和SOOyL 1%的檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸至顏色不變，即得到20nm粒徑的金納米粒子溶液；
將合成好的金納米粒子溶液9000rpm離心1min，25 °C濃縮重懸在原溶液1/10體積的超純水中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至10，待用；取兩份溶液，分別加入L型半胱氨酸及D型半胱氨酸至終濃度為100yg/mL，攪拌過夜，9000rpm離心，去除溶液中多余的半胱氨酸，重懸，得到左旋及右旋手性的金納米粒子溶液；
(2)金納米粒子薄膜的制備及轉(zhuǎn)移:將修飾好L/D型半胱氨酸的金納米粒子溶液倒入小燒杯中，加入5mL正己烷，然后緩慢滴加無水乙醇。滴加過程中，金膜會逐漸浮出在界面上。金膜可以轉(zhuǎn)移到PDMS膜上，得到具有左旋(L-film)或右旋(D-film)手性的金納米粒子薄膜晾干待用。
[0017]2、神經(jīng)母細胞瘤在手性金納米粒子薄膜上的培養(yǎng):將左旋或右旋手性的金納米粒子薄膜置于6孔的細胞培養(yǎng)板孔中；用5mL胰酶消化25mL細胞培養(yǎng)瓶中的神經(jīng)母細胞瘤細胞NG108-15 5min，將胰酶倒掉后，用含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基將細胞吹起;在放有左旋或右旋手性的金納米粒子薄膜的細胞培養(yǎng)板孔中加含2 X 14個細胞/mL的培養(yǎng)基，置于37°C 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng);24h后觀察細胞形態(tài)及密度，左旋手性的金納米粒子薄膜上細胞呈長條舒展狀態(tài)，右旋手性的金納米粒子薄膜上細胞呈圓形，且左旋手性的金納米粒子薄膜上細胞密度大于右旋手性的金納米粒子薄膜上細胞密度；
3、神經(jīng)母細胞瘤在手性金納米粒子薄膜上的分化:細胞在左旋及右旋手性的金納米粒子薄膜上分別培養(yǎng)24h后，更換新的培養(yǎng)基，加維甲酸至終濃度為ΙμΜ，繼續(xù)培養(yǎng)2天后，觀察細胞形態(tài);左旋及右旋手性的金納米粒子薄膜上細胞均長出突觸;其中，左旋手性的金納米粒子薄膜上細胞呈細長型，只兩端長出突觸，右旋手性的金納米粒子薄膜上四周均有突觸長出。
【主權(quán)項】
1.一種神經(jīng)母細胞瘤在手性金納米粒子薄膜上分化的方法，其特征在于步驟為: (1)神經(jīng)母細胞瘤在手性金納米粒子薄膜上的培養(yǎng):將左旋或右旋手性的金納米粒子薄膜置于6孔的細胞培養(yǎng)板孔中；用5mL胰酶消化25mL細胞培養(yǎng)瓶中的神經(jīng)母細胞瘤細胞NG108-15 5min，將胰酶倒掉后，用含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基將細胞吹起;在放有左旋或右旋手性的金納米粒子薄膜的細胞培養(yǎng)板孔中加含2 X 14個細胞/mL的培養(yǎng)基，置于37°C 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng);24h后觀察細胞形態(tài)及密度，左旋手性的金納米粒子薄膜上細胞呈長條舒展狀態(tài)，右旋手性的金納米粒子薄膜上細胞呈圓形，且左旋手性的金納米粒子薄膜上細胞密度大于右旋手性的金納米粒子薄膜上細胞密度； (2)神經(jīng)母細胞瘤在手性金納米粒子薄膜上的分化:細胞在左旋及右旋手性的金納米粒子薄膜上分別培養(yǎng)24h后，更換新的培養(yǎng)基，加維甲酸至終濃度為IyM，繼續(xù)培養(yǎng)2天后，觀察細胞形態(tài);左旋及右旋手性的金納米粒子薄膜上細胞均長出突觸;其中，左旋手性的金納米粒子薄膜上細胞呈細長型，只兩端長出突觸，右旋手性的金納米粒子薄膜上四周均有突觸長出。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述神經(jīng)母細胞瘤在手性金納米粒子薄膜上分化的方法，其特征在于:所述手性金納米粒子薄膜的制備步驟如下: (I )20nm粒徑的金納米粒子合成及L/D型半胱氨酸修飾: a、3_4nm金納米種子的合成:采用硼氫化鈉還原法合成;取1201111^超純水，依次加入147μL質(zhì)量濃度1%檸檬酸三鈉和0.5mL 1mM氯金酸，充分混合后，在劇烈攪拌的狀態(tài)下加入.0.6mL新配制的0.1M的硼氫化鈉，即得到3_4nm金納米種子溶液； b、20nm粒徑的金納米粒子合成:采用種子生長法合成;在195mL超純水中加入5mL1mM氯金酸，加熱至沸騰，同時加入步驟a制備得到的1.5mL金納米種子溶液和SOOyL 1%的檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸至顏色不變，即得到20nm粒徑的金納米粒子溶液； 將合成好的金納米粒子溶液9000rpm離心1min，25 °C濃縮重懸在原溶液1/10體積的超純水中，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至10，待用；取兩份溶液，分別加入L型半胱氨酸及D型半胱氨酸至終濃度為100yg/mL，攪拌過夜，9000rpm離心，去除溶液中多余的半胱氨酸，重懸，得到左旋及右旋手性的金納米粒子溶液； (2)金納米粒子薄膜的制備及轉(zhuǎn)移:將步驟(I)所得修飾好L/D型半胱氨酸的左旋或右旋手性的金納米粒子溶液倒入小燒杯中，加入5mL正己烷，然后緩慢滴加無水乙醇；滴加過程中，金膜會逐漸浮出在界面上，將金膜轉(zhuǎn)移到聚二甲基硅氧烷PDMS膜上，得到具有左旋或右旋手性的金納米粒子薄膜，晾干待用。
【文檔編號】C12N5/09GK105950559SQ201610592436
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月26日
【發(fā)明人】匡華, 趙雪利, 胥傳來, 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強, 吳曉玲, 宋珊珊, 胡擁明
【申請人】江南大學(xué)