與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記、獲得方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記，同時還提供了獲得與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記的方法。本發(fā)明提供的分子標記具有很強的特異性，能夠快速完成番茄枯萎病生理小種3的抗性鑒定，提高番茄枯萎病生理小種3抗性育種的效率，且本發(fā)明提供的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記制備簡單、生產(chǎn)成本低。本發(fā)明提供的分子標記能夠用于鑒定番茄枯萎病生理小種3抗性、篩選抗番茄枯萎病生理小種3的單株番茄和/或鑒定抗枯萎病生理小種3番茄與感枯萎病生理小種3番茄配制產(chǎn)生的雜交種種子純度。本發(fā)明提供的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記能夠用于制備試劑盒，該試劑盒具有與本發(fā)明提供的分子標記相同的應(yīng)用。
【專利說明】
與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記、獲得方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子 標記、獲得方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 番前枯萎?。‵usarium oxysporumf. sp.Lycopersici Snyder et Hansen)又稱萎 蔫病，是一種能夠使番茄植株整株枯萎直至死亡的病種。番茄枯萎病生理小種3(Fusarium oxysporumf. sp .Physiological races 3)是番前枯萎病中一種對番前毒性極強的生理小 種，番茄枯萎病生理小種3能夠使番茄的葉部發(fā)生病理性萎蔫，情況嚴重的甚至會造成番茄 絕收，因此，抗番茄枯萎病生理小種3的番茄選育是控制番茄枯萎病最直接、有效的方法。
[0003] 番前枯萎病生理小種3的抗原來源于番前野生種品系潘那利番前(Lycopers icon pennellii)LA716,潘那利番茄LA716的抗性為單基因顯性遺傳，其抗性基因被命名為13。目 前，通常利用與抗性基因緊密連鎖的分子標記進行番茄抗性鑒定，進而間接篩選抗性基因 13。分子標記的實用性取決于分子標記與目的基因的連鎖強度以及分子標記的利用成本。 分子標記與目的基因的連鎖強度越高，遺傳距離越近，則選擇出番茄枯萎病生理小種3的抗 性基因13的準確率也就越高。但是，縮短遺傳距離會導致可用的分子標記數(shù)量減少，而剩余 可用的分子標記大多數(shù)是成本較高的分子標記，如SNP(Single Nucleotide Polymorphisms，即單核苷酸的多態(tài)性）、CAPs (Cleaved Amp 1 if ied Polymorphi sm Sequences，即酶切擴增多態(tài)性序列）等，這會降低分子標記的實用性，因此，在篩選分子標 記時，一般選取分子標記與目的基因的遺傳距離在5cM( centi-m〇rgan，即厘摩爾根)范圍內(nèi) 的分子標記。SCAR (Sequence-characterized Amplified Region，即序列特異性擴增區(qū)） 標記為分子標記中的一種特異引物PCR(Polymerase Chain Reaction，即聚合酶鏈式反應(yīng)） 標記，該標記方便、快捷、可靠，能夠快速檢測大量個體，結(jié)果穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高，因此， SCAR標記為分子標記在育種實踐中應(yīng)用的首選標記。
[0004] 目前，選擇抗性基因13常用的SCAR標記為P7-43DF3/R1，P7-43DF3/R1標記與13的 遺傳距離小于lcM，能夠用于13的分子輔助育種選擇。但是，相關(guān)文獻以及實際實驗結(jié)果顯 示，P7-43DF3/R1標記只能鑒定純合基因型13/13,不能區(qū)分雜合體I3/i3與純合體i3/i3,且 P7-43DF3/R1具有較差的特異性，進而影響番茄抗枯萎病生理小種3的抗性選擇，同時也降 低了 SCAR標記的利用效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記、獲得方法及應(yīng) 用，解決選擇抗性基因13的分子標記P7-43DF3/R1特異性差的問題。
[0006] 本發(fā)明提供了一種與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記，所述分子標記的特異 性引物對為：
[0007] 上游引物：5 ' -TTGTCAACCTTACCTTGCGTAC-3 ' ；
[0008] 下游引物：5 ' -AGGAACTTTATCACCATTGACA-3 '。
[0009] 本發(fā)明提供了一種與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記的獲得方法，所述獲得 方法包括：
[0010] 獲得P7-43DF3/R1標記的引物序列；
[0011] 通過blast工具分別獲得所述P7-43DF3/R1標記在加工番茄M82和潘那利番茄中的 擴增序列；
[0012] 對比所述加工番茄M82和所述潘那利番茄擴增序列中的同源序列，在多態(tài)序列兩 側(cè)設(shè)計引物；
[0013] 篩選有效引物，得到與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記。
[0014] 優(yōu)選地，所述P7-43DF3/R1標記的引物序列為：
[0015] 上游序列：5，-CACGGGATATGTTATTGATAAGCATGT-3，；
[0016] 下游序列：5，-GTCTTTACCACAGGAACTTTATCACC-3，。
[0017]優(yōu)選地，所述P7-43DF3/R1標記在加工番茄M82和潘那利番茄中的擴增序列分別為 序列表中的序列1和序列2。
[0018] 本發(fā)明提供了一種與番前枯萎病抗性基因連鎖的分子標記的應(yīng)用，所述分子標記 應(yīng)用于鑒定番茄枯萎病生理小種3抗性、篩選抗番茄枯萎病生理小種3的單株番茄和/或鑒 定抗枯萎病生理小種3番茄與感枯萎病生理小種3番茄配制產(chǎn)生的雜交種種子純度。
[0019] 本發(fā)明提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標 記，所述試劑盒應(yīng)用于鑒定番茄枯萎病生理小種3抗性、篩選抗番茄枯萎病生理小種3的單 株番茄和/或鑒定抗枯萎病生理小種3番茄與感枯萎病生理小種3番茄配制產(chǎn)生的雜交種種 子純度。
[0020] 本發(fā)明提供了一種鑒定番茄枯萎病生理小種3抗性的方法，所述方法包括：
[0021]提取待測番茄的DNA;
[0022]以與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記為引物PCR擴增所述番茄DNA得到擴增 產(chǎn)物；
[0023]將所述擴增產(chǎn)物進行電泳測試，觀察PCR擴增產(chǎn)物的條帶大?。?br>[0024]若得到896bp條帶的PCR擴增產(chǎn)物，則所述待測番茄具有枯萎病生理小種3抗性； [0025]若得到687bp條帶的PCR擴增產(chǎn)物，則所述待測番茄不具有枯萎病生理小種3抗性。
[0026] 本發(fā)明提供了一種篩選抗番茄枯萎病生理小種3的單株番茄的方法，所述方法包 括：
[0027] 將感病番茄與抗病番茄進行雜交，得到F1代，所述F1代自交后得到F2代單株番茄； [0028]提取所述F2代單株番茄的DNA;
[0029] 以與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記為引物PCR擴增所述F2代單株番茄DNA 得到擴增產(chǎn)物；
[0030] 將所述擴增產(chǎn)物進行電泳測試，觀察PCR擴增產(chǎn)物的條帶大?。?br>[0031]若得到896bp條帶的PCR擴增產(chǎn)物，則所述F2代單株番茄為純合抗枯萎病生理小種 3單株；
[0032]若得到896bp+687bp條帶的PCR擴增產(chǎn)物，則所述F2代單株番茄為雜合抗枯萎病生 理小種3單株；
[0033] 若得到687bp條帶的PCR擴增產(chǎn)物，則所述F2代單株番茄為純合感枯萎病生理小種 3單株。
[0034] 本發(fā)明提供了 一種鑒定抗枯萎病生理小種3番茄與感枯萎病生理小種3番茄配制 產(chǎn)生的雜交種種子純度的方法，所述方法包括：
[0035] 將感病番茄母本與抗病番茄父本進行雜交，得到F1代番茄種子；
[0036]提取所述F1代番茄種子的DNA;
[0037]以與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記為引物PCR擴增所述F2代番茄種子DNA 得到擴增產(chǎn)物；
[0038] 將所述擴增產(chǎn)物進行電泳測試，觀察PCR擴增產(chǎn)物的條帶大小；
[0039] 若得到雙帶PCR擴增產(chǎn)物，則所述F1代番茄種子為雜交種；
[0040] 若得到單帶PCR擴增產(chǎn)物，則所述F1代番茄種子為自交種；
[0041] 分別統(tǒng)計所述雜交種和所述自交種的數(shù)量，計算所述雜交種和所述自交種的比 例，得到抗枯萎病生理小種3番茄與感枯萎病生理小種3番茄配制產(chǎn)生的雜交種種子純度。
[0042] 優(yōu)選地，所述PCR擴增的反應(yīng)條件為：94°C，5min; 94°C，30s，55°C，30s，72°C，45s， 33個循環(huán);72°C延伸10min，4°C保存。
[0043] 本發(fā)明的實施例提供的技術(shù)方案可以包括以下有益效果：
[0044] 本發(fā)明提供了一種與番前枯萎病抗性基因連鎖的分子標記，所述分子標記的特異 性引物對為：上游引物：5 ' - TTGTCAACCTTACCTTGCGTAC-3 ' ；下游引物：5 ' -AGGAACTTTATCACCATTGACA-3'。本發(fā)明提供的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記是在 原有選擇抗性基因13的分子標記P7-43DF3/R1的基礎(chǔ)上設(shè)計的引物對，以本發(fā)明提供的與 番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記為引物擴增從待測番茄中提取的DNA，所提取的DNA經(jīng) 過PCR擴增后進行電泳測試，番茄枯萎病生理小種3抗性鑒定、抗番茄枯萎病生理小種3單株 番茄的篩選和番茄抗枯萎病生理小種3與番茄感枯萎病生理小種3配制產(chǎn)生的雜交種種子 純度鑒定均通過判斷擴增產(chǎn)物的帶條數(shù)進行。本發(fā)明提供的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的 分子標記具有很強的特異性，能夠快速完成番茄枯萎病生理小種3的抗性鑒定，提高番茄枯 萎病生理小種3育種的效率，且本發(fā)明提供的與番前枯萎病抗性基因連鎖的分子標記制備 簡單、生產(chǎn)成本低。本發(fā)明提供的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記同時還能夠用于 制備試劑盒，該試劑盒能夠用于鑒定番茄枯萎病生理小種3抗性、篩選抗番茄枯萎病生理小 種3的單株番茄和/或鑒定番茄抗枯萎病生理小種3與番茄感枯萎病生理小種3配制產(chǎn)生的 雜交種種子純度。
[0045] 應(yīng)當理解的是，以上的一般描述和后文的細節(jié)描述僅是示例性和解釋性的，并不 能限制本發(fā)明。
【附圖說明】
[0046] 此處的附圖被并入說明書中并構(gòu)成本說明書的一部分，示出了符合本發(fā)明的實施 例，并與說明書一起用于解釋本發(fā)明的原理。
[0047] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而 言，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0048]圖1為本發(fā)明實施例提供的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記獲得方法流程 圖；
[0049]圖2為本發(fā)明實施例提供的P7-43DF3/R1標記在加工番茄M82和潘那利番茄中的擴 增序列的對比圖；
[0050] 圖3為本發(fā)明實施例提供的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記為引物擴增番 茄親本材料的電泳結(jié)果圖；
[0051] 圖4為本發(fā)明實施例提供的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記為引物擴增由 抗/感枯萎病生理小種3番茄親本配制的F2單株的電泳結(jié)果圖；
[0052] 圖5為本發(fā)明實施例提供的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記為引物擴增由 感枯萎病生理小種3番茄母本與抗枯萎病生理小種3番茄父本配制的F1單株的電泳結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0053]下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步的說明。以下的實施例便于更好地理解 本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述 實施例中所用的藥品材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到。以下實施例 中的定量實驗，均設(shè)置三次重復試驗，結(jié)果取平均值。
[0054]實施例1:與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記的獲得
[0055] 本發(fā)明實施例提供的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記是在原有選擇抗性 基因13常用的SCAR標記P7-43DF3/R1的基礎(chǔ)上設(shè)計的具有多態(tài)性的、特異性強的引物對，且 本發(fā)明實施例提供的分子標記被命名為TJ-1。
[0056] 請參考附圖1，附圖1示出了本發(fā)明實施例提供的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分 子標記獲得方法流程圖。
[0057] 本發(fā)明實施例提供的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記的獲得具體包括以 下內(nèi)容：
[0058] S01:獲得P7-43DF3/R1標記的引物序列，P7-43DF3/R1標記為目前常用標記，因此 P7-43DF3/R1標記的引物序列是共知的，即P7-43DF3/R1標記的引物序列為：
[0059] 上游引物：5 '-CACGGGATATGTTATTGATAAGCATGT-3 ' ；
[0060] 下游序列：5，-GTCTTTACCACAGGAACTTTATCACC-3，。
[0061] S02:在NCBI(National Center of Biotechnology Information，即美國國家生 物技術(shù)信息中心）網(wǎng)站上，通過blast(Bell Labs Layered Space-Time)工具分別獲得P7-43DF3/R1標記在加工番茄M82和潘那利番茄中的擴增序列，具體的，P7-43DF3/R1標記在加 工番茄M82和潘那利番茄中的擴增序列分別為序列表中的序列1和序列2;
[0062] S03:通過序列分析軟件DNAMAN6.0對比加工番茄M82中的CT0F-21-J12序列以及與 其對應(yīng)的潘那利番前擴增序列中的同源序列Solanum pennellii chromosome ch07,在多 態(tài)序列兩側(cè)設(shè)計引物；
[0063] S04:對設(shè)計得到的引物進行篩選，選取能夠進行PCR擴增的有效引物，進而得到本 發(fā)明實施例提供的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記TJ-1，TJ-1的引物序列為：
[0064] 上游引物：5，-TTGTCAACCTTACCTTGCGTAC-3，；
[0065] 下游引物：5，-AGGAACTTTATCACCATTGACA-3，。
[0066] 請參考附圖2，附圖2示出了本發(fā)明實施例提供的P7-43DF3/R1標記在加工番茄M82 和潘那利番茄中的擴增序列的對比圖，其中，A為P7-43DF3/R1標記在加工番茄M82中的擴增 序列;B為P7-43DF3/R1標記在潘那利番茄中的擴增序列。
[0067] 實施例2
[0068]為驗證本發(fā)明實施例提供的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記TJ-1具有較 強的特異性，即發(fā)明實施例提供的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記TJ-1能夠用于鑒 定番茄枯萎病生理小種3抗性，本發(fā)明實施例還提供了三種不同種質(zhì)資源的感番茄抗枯萎 病生理小種3的番茄植株以及三種不同種質(zhì)資源的抗番茄抗枯萎病生理小種3的番茄植株， 其中，1、3、5為感番茄抗枯萎病生理小種3的番茄植株;2、4、6為抗番茄抗枯萎病生理小種3 的番前植株。
[0069]本發(fā)明實施例提供的鑒定番茄枯萎病生理小種3抗性的方法具體包括：
[0070]分別提取上述六種番茄植株的DNA;
[0071 ]以分子標記TJ-1為引物PCR擴增上述六種DNA，得到六種PCR擴增產(chǎn)物；
[0072]將PCR擴增產(chǎn)物置于1%瓊脂糖凝膠上，在120V的電壓條件下恒壓電泳20min，經(jīng)EB (Ethidium bromide，即溴化乙錠)染色后置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，觀察電泳結(jié)果圖上擴 增條帶的大小；
[0073]若得到896bp(Base Pair，即堿基對)條帶的PCR擴增產(chǎn)物，則所述待測番茄具有枯 萎病生理小種3抗性；
[0074]若得到687bp條帶的PCR擴增產(chǎn)物，則所述待測番茄不具有枯萎病生理小種3抗性。
[0075] 進一步，在進行番茄植株DNA提取時，取10mg番茄幼嫩葉片，將葉片剪碎后置于 1.5mL離心管中，向離心管中加入濃度為0.25mol/L、體積為100mL的NaOH溶液，將上述裝置 置于沸水中30s，然后加入濃度為0.25mol/L、體積為100mL的HC1溶液進行中和，中和反應(yīng)結(jié) 束后，加入濃度為〇.5mol/L、體積為100yL的Tris-HCl溶液，于沸水浴中加熱2min，將離心管 中的浸出液取出，該浸出液包含有番茄植株DNA。當然，番茄植株DNA提取也可以使用已公知 的提取手段進行提取，本發(fā)明實施例不對DNA的提取方法進行限定。
[0076] 在使用分子標記TJ-1為引物進行PCR擴增時，PCR擴增的反應(yīng)體系為：10yL的2X taq miX，各0.4yL的TJ-1上、下游引物，2yL的DNA浸出液，7.2yL的水。PCR擴增的反應(yīng)條件 為：94°C，5min;94°C，30s，55°C，30s，72°C，45s，共33個循環(huán)；72°C 延伸 10min，4°C保存。
[0077] 具體結(jié)果請參考附圖3,附圖3示出了本發(fā)明實施例提供的與番茄枯萎病抗性基因 連鎖的分子標記為引物擴增番茄親本材料的電泳結(jié)果圖。
[0078] 從附圖3中能夠看出，經(jīng)過與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記TJ-1為引物進 行PCR擴增番茄DNA后，番茄植株1、3、5的PCR擴增條帶大小為698bp，番茄植株2、4、6的PCR擴 增條帶大小為896bp，這與預期的條帶大小相符合，由此表明，本發(fā)明實施例提供的與番茄 枯萎病抗性基因連鎖的分子標記TJ-1與田間鑒定相吻合，進而能夠說明本發(fā)明實施例提供 分子標記TJ-1具有很好的特異性，能夠很好的鑒定番茄枯萎病生理小種3抗性。
[0079] 實施例3
[0080] 本發(fā)明實施例提供的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記不僅能夠用于鑒定 番茄枯萎病生理小種3抗性而且還能夠用于篩選抗番茄枯萎病生理小種3的單株番茄。
[0081] 本發(fā)明實施例還提供了一種篩選抗番茄枯萎病生理小種3的單株番茄的方法，該 方法具體包括：
[0082]將感病番茄A與抗病番茄B進行雜交，得到F1代，F(xiàn)1代進行自交后得到24個F2代單 株番前；
[0083]提取F2代單株番茄的DNA;
[0084]以分子標記TJ-1為引物PCR擴增F2代單株番茄DNA得到擴增產(chǎn)物；
[0085] 將PCR擴增產(chǎn)物置于1%瓊脂糖凝膠上，在120V的電壓條件下恒壓電泳20min，經(jīng)EB 染色后置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，觀察電泳結(jié)果圖上擴增條帶的大?。?br>[0086]若得到896bp條帶的PCR擴增產(chǎn)物，則所述F2代單株番茄為純合抗枯萎病生理小種 3單株；
[0087]若得到896bp+687bp條帶的PCR擴增產(chǎn)物，則所述F2代單株番茄為雜合抗枯萎病生 理小種3單株；
[0088]若得到687bp條帶的PCR擴增產(chǎn)物，則所述F2代單株番茄為純合感枯萎病生理小種 3單株。
[0089] 在本發(fā)明提供實施例中，番茄植株DNA提取方法、PCR擴增的反應(yīng)體系及PCR擴增的 反應(yīng)條件均與實施例2中的一致。
[0090] 請參考附圖4,附圖4示出了本發(fā)明實施例提供的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分 子標記為引物擴增由抗/感枯萎病生理小種3番茄親本配制的F2單株的電泳結(jié)果圖。從附圖 4中能夠看出，編號為3、17、18、20、22、23的單株番茄?0財廣增后的條帶大小僅為687&?，編號 為6、9、13、14、24的單株番茄PCR擴增后的條帶大小僅為896bp，編號為1、2、4、5、7、8、10、11、 12、13、16、19、21的單株番茄?0財廣增后出現(xiàn)條帶為896匕?和687匕？的兩條條帶，由此得知，除 編號為3、17、18、20、22、23的單株番茄是感病植株外，其余編號的番茄均為抗病植株。將24 個F2單株分別進行自交，自交后得到F3植株，將F3植株分別進行接種試驗，試驗發(fā)現(xiàn)編號為 3、17、18、20、22、23的單株番茄自交后的？3植株全部感染番茄枯萎病;編號為6、9、13、14、24 的單株番茄自交后的F3植株全部抗番茄枯萎病;編號為1、2、4、5、7、8、10、11、12、13、16、19、 21的單株番前自交后的F3植株內(nèi)部出現(xiàn)抗性分尚，即出現(xiàn)抗病番前和感病番前，且抗病番 茄和感病番茄的分布比例為3:1。由附圖4所示出的內(nèi)容可知，編號為3、17、18、20、22、23的 F2單株番茄均為純合感病單株，編號為6、9、13、14、24的F2單株番茄均為純合抗病單株，編 號為1、2、4、5、7、8、10、11、12、13、16、19、21的？2單株番茄為雜合抗病單株。由上述內(nèi)容可 知，本發(fā)明實施例提供的分子標記TJ-1能夠篩選抗番茄枯萎病生理小種3的單株番茄。
[0091] 實施例4
[0092] 本發(fā)明實施例提供的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記還能夠用于鑒定抗 枯萎病生理小種3番茄與感枯萎病生理小種3番茄配制產(chǎn)生的雜交種種子純度。本發(fā)明實施 例提供了鑒定抗枯萎病生理小種3番茄與感枯萎病生理小種3番茄配制產(chǎn)生的雜交種種子 純度的方法，該方法具體包括：
[0093] 將感病番茄母本C與抗病番茄父本D進行雜交，得到24顆F1代番茄種子；
[0094]提取F1代番茄種子的DNA;
[0095]以分子標記TJ-1為引物PCR擴增F1代番茄種子DNA得到擴增產(chǎn)物；
[0096] 將PCR擴增產(chǎn)物置于1%瓊脂糖凝膠上，在120V的電壓條件下恒壓電泳20min，經(jīng)EB 染色后置于凝膠成像系統(tǒng)中成像，觀察電泳結(jié)果圖上擴增條帶的大??；
[0097] 若得到雙帶PCR擴增產(chǎn)物，則所述F1代番茄種子為雜交種；
[0098] 若得到單帶PCR擴增產(chǎn)物，則所述F1代番茄種子為自交種；
[0099] 分別統(tǒng)計雜交種和自交種的數(shù)量，計算雜交種和自交種的比例，得到抗枯萎病生 理小種3番茄與感枯萎病生理小種3番茄配制產(chǎn)生的雜交種種子純度。
[0?00] 其中，在進行F1代番前種子DNA的提取時，采用已知的SDS(sodium dodecyl sulfate，sodium salt，即十二烷基硫酸鈉)法提取DNA。
[0101] 請參考附圖5,附圖5示出了本發(fā)明實施例提供的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分 子標記為引物擴增由感枯萎病生理小種3番茄母本與抗枯萎病生理小種3番茄父本配制的 F1單株的電泳結(jié)果圖。從附圖5中能夠看出，編號為3、21的番茄種子進行PCR擴增后的條帶 大小僅為687bp，其余編號的番茄種子進行PCR擴增后出現(xiàn)的條帶為896bp和687bp兩條條 帶，由此可知，編號為3、21的番茄種子為純合感病種子，其余22顆番茄種子為雜合抗病種 子，由感病番茄母本C與抗病番茄父本D進行雜交得到的種子中抗病種子所占比例為22/24， 即該批次種子的純度為22/24,進而表明，本發(fā)明實施例提供的分子標記TJ-1能夠快速鑒定 抗枯萎病生理小種3番茄與感枯萎病生理小種3番茄配制產(chǎn)生的雜交種種子純度。
[0102] 由實施例2-4可知，本發(fā)明實施例提供的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記 TJ-1能夠用于快速鑒定番前枯萎病生理小種3抗性、篩選抗番前枯萎病生理小種3的單株番 茄、鑒定抗枯萎病生理小種3番茄與感枯萎病生理小種3番茄配制產(chǎn)生的雜交種種子純度， 從而提高番茄枯萎病生理小種3育種的效率。同時本發(fā)明實施例提供的與番茄枯萎病抗性 基因連鎖的分子標記TJ-1制備簡單、生產(chǎn)成本低，適用于大范圍的推廣與應(yīng)用，具有較大的 應(yīng)用前景。
[0103] 本發(fā)明實施例提供的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記TJ-1還能夠用于制 備鑒定番茄枯萎病生理小種3抗性的試劑盒，所制備的試劑盒還可以包含酶混合液、PCR反 應(yīng)液等。本發(fā)明實施例提供的試劑盒能夠用于鑒定番茄枯萎病生理小種3抗性、篩選抗番茄 枯萎病生理小種3的單株番茄和/或鑒定抗枯萎病生理小種3番茄與感枯萎病生理小種3番 茄配制產(chǎn)生的雜交種種子純度。
[0104] 本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮說明書及實踐這里發(fā)明的公開后，將容易想到本發(fā)明的其 它實施方案。本申請旨在涵蓋本發(fā)明的任何變型、用途或者適應(yīng)性變化，這些變型、用途或 者適應(yīng)性變化遵循本發(fā)明的一般性原理并包括本發(fā)明未公開的本技術(shù)領(lǐng)域中的公知常識 或慣用技術(shù)手段。說明書和實施例僅被視為示例性的，本發(fā)明的真正范圍和精神由下面的 權(quán)利要求指出。
[0105] 應(yīng)當理解的是，本發(fā)明并不局限于上面已經(jīng)描述并在附圖中示出的精確結(jié)構(gòu)，并 且可以在不脫離其范圍進行各種修改和改變。本發(fā)明的范圍僅由所附的權(quán)利要求來限制。
【主權(quán)項】
1. 一種與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記，其特征在于，所述分子標記的特異性 引物對為： 上游引物：5 ' -TTGTCAACCTTACCTTGCGTAC-3 ' ； 下游引物：5 ' -AGGAACTTTATCACCATTGACA-3 '。2. -種如權(quán)利要求1所述的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記的獲得方法，其特 征在于，所述獲得方法包括： 獲得P7-43DF3/R1標記的引物序列； 通過blast工具分別獲得所述P7-43DF3/R1標記在加工番茄M82和潘那利番茄中的擴增 序列； 對比所述加工番茄M82和所述潘那利番茄擴增序列中的同源序列，在多態(tài)序列兩側(cè)設(shè) 計引物； 篩選有效引物，得到與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記的獲得方法，其特征 在于，所述P7-43DF3/R1標記的引物序列為： 上游序列：5'-CACGGGATATGTTATTGATAAGCATGT-3' ； 下游序列：5 '-GTCTTTACCACAGGAACTTTATCACC-3 '。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記的獲得方法，其特征 在于，所述P7-43DF3/R1標記在加工番茄M82和潘那利番茄中的擴增序列分別為序列表中的 序列1和序列2。5. -種如權(quán)利要求1所述的與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記的應(yīng)用，其特征在 于，所述分子標記應(yīng)用于鑒定番茄枯萎病生理小種3抗性、篩選抗番茄枯萎病生理小種3的 單株番茄和/或鑒定抗枯萎病生理小種3番茄與感枯萎病生理小種3番茄配制產(chǎn)生的雜交種 種子純度。6. -種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含如權(quán)利要求1所述的與番茄枯萎病抗性基 因連鎖的分子標記，所述試劑盒應(yīng)用于鑒定番茄枯萎病生理小種3抗性、篩選抗番茄枯萎病 生理小種3的單株番茄和/或鑒定抗枯萎病生理小種番茄3與感枯萎病生理小種3番茄配制 產(chǎn)生的雜交種種子純度。7. -種鑒定番前枯萎病生理小種3抗性的方法，其特征在于，所述方法包括： 提取待測番茄的DNA; 以與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記為引物PCR擴增所述番茄DNA得到擴增產(chǎn)物； 將所述擴增產(chǎn)物進行電泳測試，觀察PCR擴增產(chǎn)物的條帶大??； 若得到896bp條帶的PCR擴增產(chǎn)物，則所述待測番茄具有枯萎病生理小種3抗性； 若得到687bp條帶的PCR擴增產(chǎn)物，則所述待測番茄不具有枯萎病生理小種3抗性。8. -種篩選抗番茄枯萎病生理小種3的單株番茄的方法，其特征在于，所述方法包括： 將感病番茄與抗病番茄進行雜交，得到Fl代，所述Fl代自交后得到F2代單株番茄； 提取所述F2代單株番茄的DNA; 以與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記為引物PCR擴增所述F2代單株番茄DNA得到 擴增產(chǎn)物； 將所述擴增產(chǎn)物進行電泳測試，觀察PCR擴增產(chǎn)物的條帶大??； 若得到896bp條帶的PCR擴增產(chǎn)物，則所述F2代單株番茄為純合抗枯萎病生理小種3單 株； 若得到896bp+687bp條帶的PCR擴增產(chǎn)物，則所述F2代單株番茄為雜合抗枯萎病生理小 種3單株； 若得到687bp條帶的PCR擴增產(chǎn)物，則所述F2代單株番茄為純合感枯萎病生理小種3單 株。9. 一種鑒定抗枯萎病生理小種3番茄與感枯萎病生理小種3番茄配制產(chǎn)生的雜交種種 子純度的方法，其特征在于，所述方法包括： 將感病番茄母本與抗病番茄父本進行雜交，得到Fl代番茄種子； 提取所述Fl代番茄種子的DNA; 以與番茄枯萎病抗性基因連鎖的分子標記為引物PCR擴增所述F2代番茄種子DNA得到 擴增產(chǎn)物； 將所述擴增產(chǎn)物進行電泳測試，觀察PCR擴增產(chǎn)物的條帶大?。? 若得到雙帶PCR擴增產(chǎn)物，則所述Fl代番茄種子為雜交種； 若得到單帶PCR擴增產(chǎn)物，則所述Fl代番茄種子為自交種； 分別統(tǒng)計所述雜交種和所述自交種的數(shù)量，計算所述雜交種和所述自交種的比例，得 到抗枯萎病生理小種3番茄與感枯萎病生理小種3番茄配制產(chǎn)生的雜交種種子純度。10. 根據(jù)權(quán)利要求7-9中任意一項所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增的反應(yīng)條件 為：94°C，5min;94°C，30s，55°C，30s，72°C，45s，33個循環(huán)；72°C延伸 10min，4°C保存。
【文檔編號】C12N15/11GK105950617SQ201610514852
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月4日
【發(fā)明人】周渭皓, 張景龍, 裴卓強, 沈啟海, 沈松真, 翟天天
【申請人】寧夏泰金種業(yè)有限公司