基因OsARF4在控制水稻粒長(zhǎng)和千粒重中的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體為基因OsARF4在控制水稻粒長(zhǎng)和千粒重中的應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)水稻中表達(dá)的生長(zhǎng)素應(yīng)答因子編碼基因OsARF4，利用基因工程技術(shù)敲除OsARF4，改良水稻粒長(zhǎng)及千粒重性狀，從而提高產(chǎn)量。本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)OsARF4基因編碼區(qū)的sgRNA，利用CRISPR?CAS9技術(shù)破壞OsARF2基因編碼區(qū)，并通過(guò)分離去除T?DNA，獲得非轉(zhuǎn)基因水稻，此基因改良水稻植株僅在粒長(zhǎng)和千粒重方面有明顯的提高和改善，基本不改變其它農(nóng)藝性狀。通過(guò)比較，基因改良水稻在粒長(zhǎng)和千粒重方面都高于其對(duì)照。本發(fā)明提供的基因及操作技術(shù)在提高作物產(chǎn)量方面具有明顯的作用，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
基因在控制水稻粒長(zhǎng)和千粒重中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及在水稻中敲除一種生長(zhǎng)素應(yīng)答因子基因，以提高水稻的粒長(zhǎng)和千粒重性狀。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是世界上重要的糧食作物之一，全世界有30多億的人口以稻米為主食L在耕地面積逐漸減少的情況下，為了滿足日益增長(zhǎng)的人口對(duì)糧食的需求，提高水稻單位產(chǎn)量具有重要意義。水稻產(chǎn)量性狀屬于數(shù)量性狀(QTL)，由許多效應(yīng)不同的基因所控制2。以秈型栽培稻PA64與特種大粒稻CW23雜交并與PA64回交構(gòu)建的產(chǎn)量QTL近等基因系為材料，通過(guò)染色體片段疊代定位與基因組序列分析相結(jié)合的方法分離克隆了來(lái)自CW23基因組的一個(gè)控制水稻粒長(zhǎng)及千粒重的Q T L gD，研究表明粒型D編碼一個(gè)功能缺失型SK5S因(Glycogen synthase kinase)3。以野生型GSK5蛋白為誘t耳，在水稻cDNA文庫(kù)中篩選與之有互作的蛋白，篩選到一個(gè)生長(zhǎng)素應(yīng)答基因0sARF4(Auxin Reponse Factor 4)。植物生長(zhǎng)素應(yīng)答因子是調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素響應(yīng)基因表達(dá)的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，ARFs特異性地與生長(zhǎng)素響應(yīng)基因啟動(dòng)子區(qū)域的生長(zhǎng)素應(yīng)答元件(Auxin Response Element，AuxRE)TGTCTC或TGTCNN序列結(jié)合，并通過(guò)與Aux/IAA蛋白(Auxin/Indole Acetic Acid proteins)和/或ARFs相互作用，調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄4。
[0003]水稻基因組中含有25個(gè)ARFs基因，分別位于水稻的10條染色體上5，根據(jù)ARFs蛋白中間功能域(Middle Reg1n，MR)中氨基酸組成的分析，可以將ARFs分成兩類(lèi):MR區(qū)富含谷氨酰胺(Glutamine，Q)、絲氨酸(Serine，S)和亮氨酸(Leucine，L)的ARFs大多為轉(zhuǎn)錄激活因子;而MR區(qū)富含脯氨酸(Proline，P)，甘氨酸(Glycine，G)、絲氨酸和蘇氨酸(Threonine，T)的ARFs大多為轉(zhuǎn)錄抑制因子5 ^RFs在生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著重要作用，從而調(diào)控植物生長(zhǎng)和發(fā)育的多個(gè)方面。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種水稻生長(zhǎng)素響應(yīng)基因改良水稻粒長(zhǎng)及千粒重性狀方面的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明提供的基因是水稻第I號(hào)染色體上的一個(gè)生長(zhǎng)素響應(yīng)基因，基因編號(hào)為 0s01g0927600(NCBI 編號(hào))，1^0(:_0801870270(]\^1]編號(hào))。0^7?/;^的基因組0嫩全長(zhǎng)4264bp，共含有14個(gè)外顯子，序列如SEQ ID N0.1所示(其中紅色字體(加粗的)表示外顯子(exon)，黑色字體表示內(nèi)含子(intron))，其結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖UOWTM基因編碼區(qū)⑶S全長(zhǎng)為2427bp，序列如SEQ ID N0.2所示，還包括與基因編碼序列相似度在90%以上的基因；
基因編碼808個(gè)氨基酸，具體序列如SEQ ID N0.3所示，還包括與0sARF4蛋白相似度在90%以上的蛋白。0sARF4蛋白含有一個(gè)B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(B3 DNA binding domain)，一個(gè)生長(zhǎng)素響應(yīng)因子域(Auxin response factor domain),一個(gè)具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的中間區(qū)域(Middle Reg1n)和一個(gè)Aux/IAA蛋白超家族域(Aux/IAA superfamily domain)，具體見(jiàn)圖2所示。
[0006]本發(fā)明提供一種利用基因改良水稻粒長(zhǎng)及千粒重性狀方面的應(yīng)用，具體為:設(shè)計(jì)針對(duì)基因的sgRNA，采用CRISPR-CAS9基因組編輯技術(shù)，在基因組特定位置造成堿基突變、缺失或插入;利用孟德?tīng)柗蛛x定律在Tl代種子中通過(guò)分離而去除插入的含有CRISPR-CAS9和潮霉素篩選標(biāo)記的T-DNA序列，從而獲得沒(méi)有外源T-DNA插入，但基因組改變的基因改良水稻植株。
[0007]本發(fā)明提供設(shè)計(jì)并合成SgRNA所需的前導(dǎo)序列(GuideSequence)，其序列堿基為: CC-ARF2-F2 5- GTGTGCCACCCACACAGGAGCTCG-3 24mer(SEQ ID N0.8)
CC-ARF2-R2 5- AAACCGAGCTCCTGTGTGGGTGGC-3 24mer(SEQ ID N0.9)
將CC-ARF2-F2和CC-ARF2-R2等量混合后，合成雙鏈。具體為:在94 °C加熱5min，在60 °C保持30min。將此合成的雙鏈插入到CRISPR-CAS9載體中。
[0008]本發(fā)明提供含有以上設(shè)計(jì)的SgRNA的CRISPR-CAS9載體。
[0009]本發(fā)明提供含有以上CRISPR-CAS9載體的大腸桿菌和農(nóng)桿菌工程菌。
[0010]本發(fā)明提供利用農(nóng)桿菌將設(shè)計(jì)的CRISPR-CAS9載體轉(zhuǎn)化到水稻品種日本晴中，并篩選得到基因改良水稻植株。具體方法如下:
(1)構(gòu)建工程菌:將構(gòu)建的CRISPR-CAS9載體通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株EHA105中，通過(guò)卡那霉素和利福平篩選，獲得含有此CRISPR-CAS9載體的基因工程菌；
(2)CRISPR-CAS9載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷并獲得水稻再生苗:用含有CRISPR-CAS9載體的EHA105侵染水稻愈傷組織，并于22°C培養(yǎng)室中共培養(yǎng)3天，再用液體培養(yǎng)基洗去農(nóng)桿菌后，將水稻愈傷放置在含有合適抗生素的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)3-4周培養(yǎng)后，可獲得抗性愈傷，將抗性愈傷分化成小苗，種植于水稻田；
(3 )鑒定位點(diǎn)突變情況:設(shè)計(jì)弓I物將CRISPR-CAS9的編輯位點(diǎn)區(qū)域擴(kuò)增出來(lái)，引物序列為:
CC-ARF2-F4: 5-GTGGAGAAGACGACTCCTACG-3 2Imer(SEQ ID N0.10)
CC-ARF2-R4: 5- AAGGAGATGCCTCCTCGGTTG-3 2Imer(SEQ ID N0.11)
PCR產(chǎn)物為620bp。用SacI酶切此PCR產(chǎn)物，若為野生型，則得到290bp和330bp兩條條帶;若為基因編輯過(guò)的植株，假如酶切后得到一條620bp的條帶，則為純和突變體，假如得到290bp、330bp和620bp三條條帶，則為雜合突變體。進(jìn)一步將620bp的PCR產(chǎn)物委托公司測(cè)序，確定突變類(lèi)型;并在后代中篩選沒(méi)有T-DNA插入，并且突變類(lèi)型穩(wěn)定遺傳的植株。
[0011 ]本發(fā)明提供基因改良水稻在粒長(zhǎng)和千粒重方面的應(yīng)用。敲除水稻基因后，其籽粒長(zhǎng)度和重量都比對(duì)照提高，具體見(jiàn)圖8?；蛲蛔凅w和對(duì)照日本晴稻谷粒長(zhǎng)的統(tǒng)計(jì)比較見(jiàn)圖9，千粒重見(jiàn)圖10所示。本發(fā)明可顯著提高水稻產(chǎn)量，具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1基因組結(jié)構(gòu)圖。
[0013]圖2 0sARF4蛋白結(jié)構(gòu)圖。
[0014]圖3酵母雙雜交驗(yàn)證0sARF4與0sGSK5的相互作用。
[0015]圖4體外口1111(10￥11實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證0841^4與08631(5的相互作用。
[0016]圖5熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證0sARF4與0sGSK5的相互作用。
[0017]圖6酶切鑒定基因突變情況。泳道I是沒(méi)用酶切的對(duì)照，泳道2-9為酶切的情況。其中^?/^-CC5的泳道9為全部切開(kāi)，泳道2、3、4、6、7、8為部分切開(kāi)，泳道5為沒(méi)有切開(kāi);ARF4-CC8的泳道2、7為全部切開(kāi)，泳道4、5、6、8、9為部分切開(kāi)，泳道3為沒(méi)有切開(kāi)。
[0018]圖7在^?/M-CC5和辦/M-CC8的子代中篩選沒(méi)有T-DNA插入的植株。其中他/^_CC5是第12、22、25、32為沒(méi)有T-DNA插入的個(gè)體;^?/M-CC8的第3、20、26、27為沒(méi)有T-DNA插入的個(gè)體。
[0019]圖8對(duì)照日本晴和^?/M-CC5、^?/M-CC8的稻谷長(zhǎng)度的比較。其中從上至下依次為日本晴、A?/M-CC5 和 A?/M-CC8。
[0020]圖9野生型日本晴對(duì)照和突變體稻谷長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)比較。
[0021 ]圖10野生型日本晴對(duì)照和突變體稻谷千粒重的統(tǒng)計(jì)比較。
[0022]圖11對(duì)照日本晴和辦/^-CC5、辦/^-CC8的株型比較。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0024]以下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，均按照常規(guī)步驟進(jìn)行，所用材料和試劑均為市售商品。
[0025]實(shí)施例1:0sARF4蛋白與0sGSK5相互作用的驗(yàn)證
控制水稻粒長(zhǎng)及千粒重的QTL TGW3是一個(gè)功能缺失型(??基因(Glycogen synthasekinase)，本發(fā)明稱(chēng)之為08?λ5?5。以野生型0sGSK5為誘餌，在水稻cDNA文庫(kù)中篩選與之有互作的蛋白，篩選到一個(gè)生長(zhǎng)素應(yīng)答基因0sARF4(Auxin Reponse Factor OaOsARFA蛋白含有一個(gè)B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(B3 DNA binding domain), 一個(gè)生長(zhǎng)素響應(yīng)因子域(Auxinresponse factordomain)，一個(gè)具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的中間區(qū)域(Middle Reg1n)和一個(gè)Aux/IAA蛋白超家族域(Aux/IAA superfamily domain)，具體見(jiàn)圖2所示。為了驗(yàn)證0sARF4蛋白與0sGSK5的相互作用，并進(jìn)一步研究0sARF4蛋白與0sGSK5相互作用的具體位置，我們將全長(zhǎng)或從N端或C端截短的片段，分別構(gòu)建在pGADT7載體上，形成AA1-808全長(zhǎng)、ΑΑ1-336、ΑΑ341-808、ΑΑ463-808、ΑΑ593-808 等多個(gè)載體(圖 3)。把以上載體和 ρ6ΒΚΤ7-?；5?5共轉(zhuǎn)化到酵母菌AH109后，打點(diǎn)到營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上。全長(zhǎng)的0sARF4與0sGSK5有相互作用，截短的0sARF4中，AA341-808和AA463-808與GSK5也具有相互作用(圖3)。
[0026]為了驗(yàn)證0sARF4與0sGSK5是否具有直接相互作用，我們把全長(zhǎng)克隆到pET28a原核表達(dá)載體上，將全長(zhǎng)克隆到pGEX-4T-l原核表達(dá)載體上。轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)菌株Rosetta(DE3)中，用0.5 mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。用N1-NTA Agarose(Qiage)IM1IHtHis-0sARF4，用Glutath1ne-Superflow Resin(Clontech)純化GST-GSK5。把His_ARF4和GST-GSK5體外孵育做pulldown，結(jié)果如圖4所示，從結(jié)果可以看到，單獨(dú)GST不能與His-ARF4共沉淀，而GST-GSK5與Hi S-ARF4共沉淀。這個(gè)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明GSK5和0sARF4具有直接相互作用。
[0027]為了驗(yàn)證GSK5和0sARF4在植物細(xì)胞中是否具有相互作用，我們用熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(split Firefly Luciferase Complementat1n Assay)驗(yàn)證。將全長(zhǎng)克隆到JW771 (35S LUC-N)和JW772 (35S LUC-C)載體上，將全長(zhǎng)0sGSK5克隆到JW771 (35S LUC-N)和JW772 (35S LUC-C)載體上，分別將以上載體和空載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中，在含卡那霉素和利福平的5 mL LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。設(shè)置合適的組合，取0.5個(gè)OD6qq的菌液混合，注射到煙草葉片中，2-3天后在LB985植物活體成像系統(tǒng)觀察熒光，結(jié)果如圖5所示?？蛰d體組合nLUC和cLUC，以及空載體和0sARF2或0sGSK5的組合都沒(méi)有熒光信號(hào)，只有含有0sARF4和0sGSK5的組合才有熒光信號(hào)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明0sARF4和0sGSK5在植物細(xì)胞中也具有相互作用。
[0028]實(shí)施例2:用CRISPR-CAS9敲除基因改良水稻粒長(zhǎng)和千粒重方面的應(yīng)用
以下實(shí)施例采用水稻粳稻品種日本晴(sat i va L.japonica.c v.Nipponbare)為例。利用農(nóng)桿菌將設(shè)計(jì)的CRISPR-CAS9載體轉(zhuǎn)化到日本晴基因組中，并篩選得到基因改良水稻植株。具體方法如下:
(I) CRISPR-CAS9載體構(gòu)建
設(shè)計(jì)并合成SgRNA所需的前導(dǎo)序列(Guide Sequence)，其序列堿基為:
CC-ARF2-F2 5- GTGTGCCACCCACACAGGAGCTCG-3 24mer(SEQ ID N0.12)
CC-ARF2-R2 5- AAACCGAGCTCCTGTGTGGGTGGC-3 24mer(SEQ ID N0.13)
將CC-ARF2-F2和CC-ARF2-R2等量混合后，合成雙鏈。具體為:在94 °C加熱5min，在60 °C保持30min。將此合成的雙鏈插入到CRISPR-CAS9中間載體中6，并通過(guò)酶切連接到雙元載體PCAMBIA1300 上。
[0029](2) CRISPR-CAS9載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
將構(gòu)建的CRISPR-CAS9載體通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株EHA105中，在LB平板上通過(guò)卡那霉素和利福平篩選，獲得含有此CRISPR-CAS9載體的基因工程菌。
[0030](3)水稻轉(zhuǎn)基因
A:培養(yǎng)基配方:
N6D固體培養(yǎng)基:N6基本培養(yǎng)基+0.1 g/L肌醇+ 2 g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+3g/LPhytagel + 2 mg/L 2，4_D，pH5.8
N6I固體培養(yǎng)基:N6基本培養(yǎng)基+0.1 g/L肌醇+ 2 g/L水解酪蛋白+40g/L蔗糖+10 g/L 葡萄糖+3g/L Phytagel + 2 mg/L 2，4_D，pH5.2
N6CH固體培養(yǎng)基:N6基本培養(yǎng)基+0.1 g/L肌醇+ 2 g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+3g/LPhytagel + 2 mg/L 2,4-D + 50 mg/L潮霉素B+300 mg/L 頭孢霉素，ρΗ5.8
N6R固體培養(yǎng)基:Ν6基本培養(yǎng)基+0.1 g/L肌醇+ 2 g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+3g/LPhytagel + 2 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L NAA + 50 mg/L潮霉素B+300 mg/L 頭孢霉素，pH5.80
[0031 ] B:水稻愈傷組織誘導(dǎo):
去殼的水稻成熟種子先用70%乙醇浸泡l-2min，然后用15% NaC10(v/v)浸泡并搖晃30min，進(jìn)行表面滅菌(可在搖床上進(jìn)行)，然后在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌水沖洗3-4次，再將種子放在無(wú)菌濾紙上吸干水分后，放在成熟胚愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6D上，28°C暗培養(yǎng)。約10-15天后，可見(jiàn)到從胚的位置生長(zhǎng)出愈傷組織。
[0032]C:水稻愈傷組織的繼代培養(yǎng)
剝下從成熟胚上長(zhǎng)出的愈傷組織，轉(zhuǎn)入同樣的N6D固體培養(yǎng)基上，在28°C下繼代培養(yǎng)。以后每?jī)芍芾^代培養(yǎng)一次。
[0033]D:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)基因方法
農(nóng)桿菌的培養(yǎng):在轉(zhuǎn)化前一天將含有目的載體的農(nóng)桿菌加入到50 mL LB + 50 mg/L卡那霉素+ 25 mg/L利福平的液體培養(yǎng)基中，28°C，200 rpm震蕩培養(yǎng)12_16h至0D600=0.4_
0.6ο
[0034]水稻愈傷的收集:將培養(yǎng)的水稻愈傷組織在超凈工作臺(tái)上收集到一個(gè)滅過(guò)菌的容器中待用。
[0035]侵染菌液的準(zhǔn)備:將新鮮培養(yǎng)的農(nóng)桿菌加入到50mL離心管中，5000 rpm,10 min收集農(nóng)桿菌。用10 mM MgS04洗一次。沉淀懸浮于N6I液體培養(yǎng)基(成分同N6I固體培養(yǎng)基，但不加phytagel)中，調(diào)整菌體濃度至OD6qq為0.5，加入AS(乙酰丁香酮)，使AS終濃度為10mM0
[0036]侵染和共培養(yǎng):在收集的水稻愈傷組織中加入適量體積的農(nóng)桿菌懸浮液，使菌液沒(méi)過(guò)水稻愈傷組織，室溫放置20min，并不時(shí)晃動(dòng)。倒掉菌液，將愈傷組織放在無(wú)菌濾紙上吸去多余菌液，隨即轉(zhuǎn)移到鋪有一層無(wú)菌濾紙的固體共培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基為加入100 mM AS的N61固體培養(yǎng)基，24 0C黑暗培養(yǎng)2-3天。
[0037]除菌:將共培養(yǎng)后的愈傷轉(zhuǎn)移至50mL的滅菌離心管，用無(wú)菌水清洗3次以上，直至洗脫液體比較清亮。倒出洗脫液后，用加入300 mg/L頭孢霉素的N6D液體培養(yǎng)基再洗一次，倒去洗脫液后，將洗凈后的水稻愈傷組織倒在一張無(wú)菌濾紙上，吸干多余的水分。
[0038]篩選:將洗過(guò)的水稻愈傷轉(zhuǎn)移至N6CH固體培養(yǎng)基上，在28 °C暗室中培養(yǎng)。每2周繼代一次。約4周后，可看到新鮮長(zhǎng)出來(lái)的抗性愈傷，將這些抗性愈傷轉(zhuǎn)移到新鮮的N6CH培養(yǎng)基上繼代。
[0039]分化:將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至N6R固體培養(yǎng)基上，在光照培養(yǎng)室16h光/8h暗培養(yǎng)。一般經(jīng)過(guò)7-10天左右有綠點(diǎn)出現(xiàn)。30-40天后綠點(diǎn)進(jìn)一步分化出小苗。將小苗種植于水稻田。
[0040](4)鑒定目的位置突變情況
設(shè)計(jì)弓I物將CRISPR-CAS9的編輯位點(diǎn)區(qū)域擴(kuò)增出來(lái)，引物序列為:
CC-ARF2-F4: 5-GTGGAGAAGACGACTCCTACG-3 2Imer(SEQ ID N0.14)
CC-ARF2-R4: 5- AAGGAGATGCCTCCTCGGTTG-3 2Imer(SEQ ID N0.15)
PCR產(chǎn)物為620bp。用SacI酶切此PCR產(chǎn)物，若得到290bp和330bp兩條條帶，則為野生型;若為基因編輯過(guò)的植株，假如酶切后得到一條620bp的條帶，則為純和突變體，假如得到290bp、330bp和620bp三條條帶，則為雜合突變體。在本實(shí)施例中，酶切后的結(jié)果如圖6所示，其中^?/^-CC5的第5泳道和^?/^-CC8的第3泳道是完全沒(méi)有切開(kāi)的。進(jìn)一步將這兩個(gè)樣品的PCR產(chǎn)物委托上海杰李生物技術(shù)有限公司測(cè)序，確定突變類(lèi)型，其中^?/^_CC5的突變?yōu)樵谀繕?biāo)區(qū)域少了一個(gè)T，引起移碼突變，突變后的⑶S序列如SEQ ID勵(lì).4所示(^?例-(:〇5的DNA序列，其中紅色字體(加粗的)表示^?/^-CC5的編碼區(qū)域)，其編碼的氨基酸序列如SEQID N0.5所示;A?/^-CC8的突變?yōu)樵谀繕?biāo)區(qū)域多了一個(gè)T，也引起移碼突變，突變后的⑶S序列如SEQ ID N0.6所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示。在^?/^_CC5和ARF4-CC8這兩個(gè)植株的后代中通過(guò)分離去除T-DNA。利用T-DNA上的潮霉素篩選基因(Hy gr omy c i η )設(shè)計(jì)引物，引物序列如下所示:
Hyg-F: GCTGTTATGCGGCCATTGTC(SEQ ID N0.16)
Hyg-R: GACGTCTGTCGAGAAGTTTC (SEQ ID N0.17) 提取^?/^-CC5和A?/^_CC8這兩個(gè)植株后代的基因組DNA，用以上引物PCR擴(kuò)增，若有T-DNA插入，則可得到一條615bp的條帶，若沒(méi)有T-DNA插入，則不能擴(kuò)出條帶。具體實(shí)施例如圖7所示。通過(guò)篩選，我們得到^?/M_CC5和^?/M-CC8子代中沒(méi)有T-DNA插入，但基因突變的植株。
[0041](5)基因改良水稻在粒長(zhǎng)和千粒重方面的考察
本發(fā)明提供的基因在改良水稻粒長(zhǎng)和千粒重方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。敲除水稻基因后，其籽粒長(zhǎng)度和千粒重都比對(duì)照提高，具體見(jiàn)圖8所示。OsARFM因突變體和對(duì)照日本晴稻谷粒長(zhǎng)的比較見(jiàn)圖9，千粒重見(jiàn)圖10所示。本發(fā)明提供的基因和基因工程技術(shù)手段在不影響水稻其他農(nóng)藝性狀(圖11)的前提下，可顯著提高水稻產(chǎn)量，具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
[0042I 參考文獻(xiàn):
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【主權(quán)項(xiàng)】
1.水稻基因在改良水稻粒長(zhǎng)及千粒重性狀方面的應(yīng)用，其特征在于，利用基因工程技術(shù)敲除水稻基因，以提高水稻的粒長(zhǎng)和千粒重性狀； 水稻的基因組DNA序列如SEQ ID N0.1所示，以及與制例基因編碼序列相似度在90%以上的基因，其編碼序列⑶S如SEQ ID N0.2所示。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，基因編碼的氨基酸序列如SEQIDN0.3所示，及與0sARF4蛋白相似度在90%以上的蛋白。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，設(shè)計(jì)針對(duì)0d 7?/?基因的s g R N A，采用CRISPR-CAS9基因組編輯技術(shù)，在基因組特定位置造成堿基突變、缺失或插入;利用孟德?tīng)柗蛛x定律在Tl代種子中通過(guò)分離而去除插入的含有CRISPR-CAS9和潮霉素篩選標(biāo)記的T-DNA序列，從而獲得沒(méi)有外源T-DNA插入、但基因組改變的基因改良水稻植株； 其中，設(shè)計(jì)并合成SgRNA所需的前導(dǎo)序列為:SEQ ID N0.8,SEQ ID N0.9，將兩者等量混合后，合成雙鏈;將此合成的雙鏈插入到CRISPR-CAS9載體中。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，利用農(nóng)桿菌將設(shè)計(jì)的CRISPR-CAS9載體轉(zhuǎn)化到水稻品種日本晴中，并篩選得到基因改良水稻植株，具體方法如下: (1)構(gòu)建工程菌:將構(gòu)建的CRISPR-CAS9載體通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株EHA105中，通過(guò)卡那霉素和利福平篩選，獲得含有此CRISPR-CAS9載體的基因工程菌； (2)CRISPR-CAS9載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷并獲得水稻再生苗:用含有CRISPR-CAS9載體的EHA105侵染水稻愈傷組織，并于22°C培養(yǎng)室中共培養(yǎng)3天，再用液體培養(yǎng)基洗去農(nóng)桿菌后，將水稻愈傷放置在含有合適抗生素的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng);經(jīng)過(guò)3-4周培養(yǎng)后，獲得抗性愈傷，將抗性愈傷分化成小苗，種植于水稻田； (3)鑒定位點(diǎn)突變情況:設(shè)計(jì)引物將CRISPR-CAS9的編輯位點(diǎn)區(qū)域擴(kuò)增出來(lái)，引物序列為..SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.11，PCR產(chǎn)物為620bp;用SacI酶切此PCR產(chǎn)物，若為野生型，則得到290bp和330bp兩條條帶;若為基因編輯過(guò)的植株，假如酶切后得到一條620bp的條帶，則為純和突變體，假如得到290bp、330bp和620bp三條條帶，則為雜合突變體； 進(jìn)一步，將620bp的PCR產(chǎn)物測(cè)序，確定突變類(lèi)型；并在后代中篩選沒(méi)有T-DNA插入、并且突變類(lèi)型穩(wěn)定遺傳的植株。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK105950633SQ201610430815
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月16日
【發(fā)明人】劉建祥, 陸孫杰
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)