一種具有高丁醇耐受性的大腸桿菌菌株構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明通過隨機(jī)突變?nèi)洲D(zhuǎn)錄因子σ70編碼基因rpoD篩選具有高丁醇耐受性的大腸桿菌菌株，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用隨機(jī)突變法構(gòu)建全局轉(zhuǎn)錄因子σ70編碼基因rpoD的突變文庫，篩選獲得了一株攜帶σ70突變基因rpoDM2的大腸桿菌E.coli JM109/pHACMB8，可耐受2％(v/v)丁醇。本發(fā)明為具有高丁醇耐受性微生物菌株的構(gòu)建提供了理論依據(jù)和有效方法。
【專利說明】
一種具有高丁醇耐受性的大腸桿菌菌株構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種隨機(jī)突變?nèi)洲D(zhuǎn)錄因子〇7()編碼基因 rpoD篩選具有高丁醇耐受性 的大腸桿菌菌株，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生物菌株在生物能源制備及非水相生物催化等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，但有機(jī)溶 劑對微生物細(xì)胞的生長和生理功能具有抑制作用，這嚴(yán)重影響了微生物菌株在工業(yè)領(lǐng)域中 的應(yīng)用。因此，提高微生物細(xì)胞的有機(jī)溶劑耐受性具有重要的應(yīng)用價值。
[0003] 全局轉(zhuǎn)錄因子可通過對細(xì)胞基因組中上千個基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行特異性調(diào)控。通 過全局轉(zhuǎn)錄因子的突變，可以關(guān)閉或強(qiáng)化一些基因的轉(zhuǎn)錄，從而獲得具有特定目標(biāo)表型的 菌株。2012年，Zhang等對全局轉(zhuǎn)錄因子cAMP受體蛋白（CRP)進(jìn)行隨機(jī)突變得到能夠耐受 1.2% (v/v)丁醇的大腸桿菌。2010年，Liu等通過對釀酒酵母中全局轉(zhuǎn)錄因子sptl5進(jìn)行突 變，提高了酵母菌株對木糖的耐受及利用率。因此，通過對全局轉(zhuǎn)錄因子突變，可以對微生 物的自身代謝進(jìn)行優(yōu)化，從而獲得理想的細(xì)胞表型。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是通過對全局轉(zhuǎn)錄因子σ?編碼基因 rp〇D進(jìn)行隨機(jī)突變，提高大腸桿 菌的丁醇耐受性。該方法操作簡單，能有效地提高大腸桿菌的有機(jī)溶劑耐受性。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案:對pHACM質(zhì)粒上的rpoD基因（編碼0?因子)進(jìn)行突變，轉(zhuǎn)化于大 腸桿菌E.coli JM109中，篩選獲得攜帶有〇7Q突變基因 rp〇DM2的大腸桿菌E.coli JM109/ pHACMB8,該菌株能夠耐受2% (v/v)的丁醇。
[0006] 一種通過隨機(jī)突變?nèi)洲D(zhuǎn)錄因子σ7()編碼基因 rP〇D篩選丁醇耐受型大腸桿菌的方 法，其主要步驟為：
[0007] (1)以攜帶有野生型rpoD基因的pHACM質(zhì)粒為模板，全質(zhì)粒擴(kuò)增構(gòu)建，基因突變文 庫；
[0008] (2)轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行高通量篩選，以丁醇為有機(jī)溶劑壓力，采用24深孔板篩選高 丁醇耐受菌株。
[0009] (3)從一輪篩選中，選取丁醇耐受性最高的重組菌，提取質(zhì)粒，并以該〇7()突變基因 為模板再次進(jìn)行隨機(jī)突變，構(gòu)建σ?基因突變文庫。
[0010] (4)進(jìn)行二輪篩選，篩選獲得具有最高丁醇耐受性的重組菌E.coli JM109/ PHACMB8,提取質(zhì)粒并對突變基因進(jìn)行測序，即為σ?突變基因 rp〇DM2。
[0011] 運(yùn)用上述方法獲得的可顯著提高大腸桿菌丁醇耐受性的σ?突變基因 rp〇DM2,其特 征為：
[0012] (1)該σ?突變基因 rp〇DM2,包含三個突變位點(diǎn)：Ile41Leu，Glu57Asp，Pro97Gln。 [0013] 攜帶該突變基因 rp〇DM2的大腸桿菌E.coli JM109/pHACMB8能夠耐受2%(v/v) 丁醇，而野生型大腸桿菌在〇. 1 % (v/v)的丁醇濃度下就停止生長。野生型σ?基因 rpoD的氨 基酸序列為:SEQ ID Ν0:1;σ?突變基因 rp〇DM2的氨基酸序列為：SEQ ID N0:2。
[0014]本發(fā)明的有益效果：
[0015] 1.通過對全局轉(zhuǎn)錄因子σ7()編碼基因 rP〇D進(jìn)行隨機(jī)突變，經(jīng)過高通量篩選，在較短 時間內(nèi)獲得了丁醇耐受性顯著提高的大腸桿菌菌株。為改造微生物菌株的有機(jī)溶劑耐受性 提供了理論依據(jù)和有效方法。
[0016] 2.在〇7()突變文庫中，使用24深孔板代替搖瓶篩選，即提高了實(shí)驗(yàn)效率，又節(jié)約了實(shí) 驗(yàn)成本。
【附圖說明】
[0017]圖1第一輪0?突變文庫的篩選。
[0018] 圖2第二輪0?突變文庫的篩選。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例1 0?隨機(jī)突變文庫的構(gòu)建
[0020] 利用隨機(jī)突變試劑盒（GeneMorph II Random Mutagenesis Kit)，以攜帶有rpoD 基因的質(zhì)粒pHACM為模板，以p-rpoD-F、p-rpoD-R為引物對rpoD(編碼σ?轉(zhuǎn)錄因子)進(jìn)行隨機(jī) 突變。其中，p-rpoD-F、p-rpoD-R引物序列為：
[0021 ] p-rpoD-F:5，-AACCTAGGAGCTCTGATTTAACGGCTTAAGTGCCGAAGAGC-3，
[0022] p-rpoD-R:5，-TGGAAGCTTTAACGCCTGATCCGGCCTACCGATTA-3，。
[0023]易錯PCR反應(yīng)體系如下：
[0025] PCR 條件為:951€5111丨11，951€3〇8,57°(：1111丨11，72 1€2111丨11，反應(yīng)30個循環(huán)后72°(：再延伸 10min。對突變后的rpoD片段經(jīng)凝膠電泳后切膠回收，以純化后的rpoD片段為引物對pHACM 進(jìn)行全質(zhì)粒大引物PCILPCR體系如下：
[0028] PCR 條件為：68 °C 5min，95 °C lmin，95 °C 30s，55 °C 20s，68 °C 6min，反應(yīng) 30 個循環(huán)后 68 °C再延伸20min。
[0029] 反應(yīng)結(jié)束后向PCR產(chǎn)物中加入Dpn頂每消化模板質(zhì)粒，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后切膠 回收?；厥蘸蟮馁|(zhì)粒按照常規(guī)熱激方法，轉(zhuǎn)入E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，同時將未突變的 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞后獲得的菌株作為對照菌。37°C后培養(yǎng)1.5h后涂布于氯 霉素固體平板中培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)，即獲得rpoD基因的隨機(jī)突變文庫。
[0030] 實(shí)施例2 rpoD隨機(jī)突變文庫的丁醇耐受性篩選
[0031]第一輪篩選:為獲得具有較高丁醇耐受的大腸桿菌菌株，將構(gòu)建的rpoD隨機(jī)突變 文庫中的單菌落接種于含有LB/Cm液體培養(yǎng)基的24深孔板中，當(dāng)0D66Q~0.2時，向培養(yǎng)基中 加入0.5% (v/v)丁醇，繼續(xù)培養(yǎng)8h后分別測定菌體在0D66Q時的濃度，見圖1。選取0D66Q較高 的10株菌株，分別命名為JM109/pHACMDl-D10(以下簡稱D1-D10)，對這10株菌在丁醇濃度以 0.1 % (v/v)梯度遞增的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，繼續(xù)進(jìn)行復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)D3在1.2% (v/v)丁醇濃度 下，0D66q達(dá)到了 0.76，其他9株重組菌和對照菌株0D66q均低于0.60，見表1。提取菌株D3的質(zhì) 粒，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)rp 〇DD3基因中兩個堿基發(fā)生了突變，相應(yīng)的氨基酸突變?yōu)镮le41Leu， Pro97Gln〇
[0032]表1第一輪篩選獲得的丁醇耐受菌株在1.2% (v/v)丁醇濃度下的生長情況
[0034]第二輪篩選:為進(jìn)一步提高大腸桿菌的丁醇耐受性，以攜帶有〇7()突變基因 rp〇DD3 的質(zhì)粒為模板，按照實(shí)施例1中的方法再次構(gòu)建隨機(jī)突變文庫，并按照一輪篩選的方法進(jìn)行 二輪篩選，如圖2所示，在483個重組菌中有8株菌的0D 66Q>2，明顯高于其他重組菌。將這8株 菌分別命名為JM109/pHACMBl-B8(以下簡稱B1-B8)。對這8株菌在丁醇濃度0.1%(v/v)梯 度遞增的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)繼續(xù)進(jìn)行復(fù)篩，發(fā)現(xiàn)B8在1.2% (v/v)丁醇濃度下0D66Q達(dá)到了 1.43，其他菌株0D66Q〈 1.0，見表2。同時提取菌株B8的質(zhì)粒進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)在rp〇DD3氨基酸突 變的基礎(chǔ)上，又增加了 Glu57Asp這個位點(diǎn)的突變，即現(xiàn)在所得B8菌株所攜帶的〇7()突變基因 rpoDM2的突變位點(diǎn)為：Ile41Leu，Glu57Asp，Pro97Gln，如SEQIDN0 :2所示。
[0035]表2第二輪篩選獲得的丁醇耐受菌株在1.2% (v/v)丁醇濃度下的生長情況
[0037] 實(shí)施案例3菌株JM109/pHACMB8的丁醇耐受濃度實(shí)驗(yàn)
[0038]為了進(jìn)一步測定丁醇耐受菌株JM109/pHACMB8對丁醇的極限耐受濃度。我們將攜 帶有野生型rpoD基因的對照菌株和丁醇耐受菌株JM109/pHACMB8分別在1.2-2.2%(v/v) 丁 醇濃度遞增的培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)8h，測定各丁醇濃度下菌株的0D66Q值。如表3所示，當(dāng)丁醇 濃度達(dá)到2.0 % (v/v)時，JM109/pHACMB8的0D66Q達(dá)到0.372，隨著丁醇濃度的增加，JM109/ PHACMB8停止生長;而對照菌株在所測定的丁醇濃度下均無生長。表明菌株JM109/pHACMB8 最高能夠耐受2.0 % (v/v)的丁醇。
[0039] 表3菌株JM109/pHACMB8的最大丁醇耐受濃度測定
【主權(quán)項(xiàng)】
1.采用隨機(jī)突變?nèi)洲D(zhuǎn)錄因子σ70編碼基因 rpoD的方法，獲得一種顯著提高大腸桿菌 丁醇耐受性的〇70突變基因 rp〇DM2，其特征在于:rp〇DM2的氨基酸序列為SEQ ID NO:2;與野 生型σ?基因 rpoD的氨基酸序列SEQ ID NO: 1相比，其特點(diǎn)為： (1) 該〇70突變基因 rpoDM2,攜帶三個突變位點(diǎn)，分別為：Ile41Leu，Glu57Asp，Pro97Gln。 (2) 攜帶該σ70突變基因 rpoDM2的大腸桿菌E · co I i JMl09/pHACMB8能夠耐受2 % (v/v) 丁 醇，而野生型大腸桿菌在0.1 % (v/v)丁醇濃度下就停止生長。
【文檔編號】C12R1/19GK105950634SQ201610351243
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月25日
【發(fā)明人】倪曄, 司海明, 韓瑞枝, 許國超, 董晉軍
【申請人】江南大學(xué)