一種松江鱸肌酸激酶TfM-CK基因、松江鱸TfM-CK重組蛋白及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種松江鱸肌酸激酶TfM?CK基因、松江鱸TfM?CK重組蛋白及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，不僅獲得了松江鱸肌酸激酶TfM?CK基因的cDNA全長(zhǎng)序列，還通過(guò)原核表達(dá)獲得了松江鱸TfM?CK重組蛋白。本發(fā)明提供了一種松江鱸肌酸激酶TfM?CK基因，其序列全長(zhǎng)為1474bp，包含1146bp基因開(kāi)放閱讀框。本發(fā)明可用于作為魚(yú)飼料免疫添加劑來(lái)增強(qiáng)魚(yú)類病抗病力。
【專利說(shuō)明】
一種松江鱸肌酸激酶TfM-CK基因、松江鱸TfM-CK重組蛋白及 其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種松江鱸肌酸激酶TfM-CK基因的cDNA 全長(zhǎng)序列，由其通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)得到的松江鱸TfM-CK重組蛋白及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 松江魚(yú)盧（Trachidermus fasciatus)又名四鮑魚(yú)盧，隸屬于軸形目 (Scorpaeniforme)，杜父魚(yú)科(Cottidae)，松江f盧屬(Trachidermus)，是一種典型的降海洄 游性的小型魚(yú)類，整個(gè)生長(zhǎng)期面臨海水與淡水兩種更加復(fù)雜的生存環(huán)境，曾廣泛分布于我 國(guó)沿海。近年來(lái)，由于水體污染及興建河道水利等原因破壞了松江鱸棲息、繁殖和洄游路 線，導(dǎo)致該物種種群數(shù)量銳減，分布區(qū)也急劇縮小，因此，研究、發(fā)展松江鱸的養(yǎng)殖和應(yīng)用， 具有重要的意義。
[0003] 肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)屬于高度保守的磷酸原激酶家族，能夠催化磷酸 肌酸中的磷酸和ADP結(jié)合生成ATP的可逆反應(yīng)。它廣泛存在于無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物。在脊 椎動(dòng)物體內(nèi)，CK是唯一的磷酸原激酶，通常存在于能量代謝旺盛的組織和細(xì)胞，是一個(gè)與細(xì) 胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶。臨床上，人血清肌酸激酶是診斷 組織病變的重要指標(biāo)。盡管沒(méi)有人提出CK是哺乳動(dòng)物的急性期蛋白，但一些報(bào)道顯示其可 能和哺乳動(dòng)物的急性期反應(yīng)(acute phage reponse APR)相關(guān)。幾乎所有動(dòng)物受到創(chuàng)傷和 感染等外界傷害時(shí)都會(huì)啟動(dòng)APR，合成APP(acute phage protein,APP)進(jìn)行快速自我保護(hù)， 抵御微生物的入侵，促進(jìn)創(chuàng)傷的修復(fù)等，APR歸于動(dòng)物的先天免疫系統(tǒng)。
[0004] CK有四種同功酶形式，即腦型、肌型、雜化型和線粒體型。目前，CK的研究大都集中 在哺乳動(dòng)物方面，尤其是人的肌型CK研究最多，且其在臨床上有很高的應(yīng)用價(jià)值。已有研究 表明，腦型CK和肌肉型CK兩種類型在魚(yú)類中均有分布，例如鯉魚(yú)(Cyprinus carpio)中存在 肌肉型CK，而虹鱒（Oncorhynchus myki ss )中存在腦型CK。就肌型CK而言，在電暢 (Electrophorus electricus)、斑馬魚(yú)（Danio rerio)和繼（Siniperca chuatsi)等中僅發(fā) 現(xiàn)了一種肌型CK，然而在斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus )、北極黑鰭冰魚(yú) (Chaenocephalus aceratus)等中則發(fā)現(xiàn)有2種不同的肌型CK，甚至在鯉中獲得了3種不同 的肌型CK。盡管魚(yú)類中有發(fā)現(xiàn)不同類型CK基因，但是其功能研究基本處于尚未開(kāi)展的階段。 最近高媛媛安艷、范寧寧研究等通過(guò)對(duì)文昌魚(yú)(Branchiostoma belcheri Gray)的研究發(fā) 現(xiàn)，文昌魚(yú)CK是一種應(yīng)激反應(yīng)蛋白，具有凝集素活性。在前期的工作中，我們從松江鱸皮膚 粘液刺激后明顯上調(diào)表達(dá)的蛋白質(zhì)譜分析中得到肌酸激酶CK的信息，故將其選為免疫蛋白 進(jìn)行進(jìn)一步的研究。作為一種洄游性小型魚(yú)類，復(fù)雜的生存環(huán)境導(dǎo)致其廣泛的適應(yīng)性及抵 抗力，因此以松江鱸為研究對(duì)象，克隆獲得CK基因全長(zhǎng)序列以開(kāi)展魚(yú)類肌酸激酶在免疫方 面的功能研究，并由此獲得一種可作為魚(yú)飼料免疫添加劑或免疫激活劑的魚(yú)源重組蛋白， 這對(duì)于本領(lǐng)域而言將具有深遠(yuǎn)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種松江鱸肌酸激酶TfM-CK基因，由其通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng) 表達(dá)得到的松江鱸TfM-CK重組蛋白及其應(yīng)用，不僅獲得了松江鱸肌酸激酶TfM-CK基因的 cDNA全長(zhǎng)序列，還通過(guò)原核表達(dá)獲得了松江鱸TfM-CK重組蛋白，以應(yīng)用于魚(yú)飼料免疫添加 劑方面來(lái)增強(qiáng)魚(yú)類病抗病力。
[0006] 本發(fā)明的一方面提供了一種松江鱸肌酸激酶TfM-CK基因，其序列全長(zhǎng)為1474bp， 包含1146bp基因開(kāi)放閱讀框，其核苷酸序列如下：
[0007]
[0008]
[0009] 其中，序列中下劃線標(biāo)示的ATG為起始密碼子，下劃線標(biāo)示的TAA為終止密碼子，下 劃線示出的AATAAA為加尾信號(hào)。
[0010] 本發(fā)明的另一方面提供了一種利用所述松江鱸肌酸激酶TfM-CK基因編碼的蛋白， 包括381個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如下：

[0013]其中，N端結(jié)構(gòu)域是從第24位氨基酸殘基到第99位氨基酸殘基，C端結(jié)構(gòu)域是從第 120為氨基酸殘基到第367位氨基酸殘基。
[0014] 本發(fā)明的再一方面提供了一種松江鱸TfM-CK重組蛋白，由上述技術(shù)方案所述的松 江鱸肌酸激酶TfM-CK基因通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)得到。在該技術(shù)方案中，所采用的原核表 達(dá)菌株為大腸桿菌BL21(DE3)，表達(dá)載體為pet30a。
[0015] 本發(fā)明的又一方面提供了一種由上述技術(shù)方案所述的松江鱸TfM-CK基因在制備 魚(yú)飼料添加劑中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的又一方面提供了一種由上述技術(shù)方案所述的松江鱸TfM-CK基因在制備 治療或預(yù)防水產(chǎn)養(yǎng)殖病害藥物中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的又一方面提供了一種由上述技術(shù)方案所述的松江鱸TfM-CK重組蛋白在 制備魚(yú)飼料添加劑中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明的又一方面提供了一種由上述技術(shù)方案所述的松江鱸TfM-CK重組蛋白在 制備治療或預(yù)防水產(chǎn)養(yǎng)殖病害藥物中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明通過(guò)松江鱸肌酸激酶TfM-CK基因的CDNA全長(zhǎng)序列的獲得，填補(bǔ)了松江鱸 TfM-CK基因研究的空缺。同時(shí)，根據(jù)松江鱸TfM-CK基因序列可以人工合成或轉(zhuǎn)基因生物合 成具有生物活性的重組蛋白，有助于我們了解松江鱸TfM-CK基因的基因組結(jié)構(gòu)，分析該基 因的表達(dá)和蛋白的功能。此外，發(fā)明人通過(guò)松江鱸TfM-CK基因序列還構(gòu)建得到了松江鱸 TfM-CK基因重組蛋白，可作為魚(yú)飼料中的免疫添加劑有效運(yùn)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖中。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例2所提供的鰻弧菌刺激后TfM-CK基因在各組織中的表達(dá)模式 變化圖，其中，誤差線是通過(guò)三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析所得的標(biāo)準(zhǔn)差；
[0021 ]圖2為本發(fā)明實(shí)施例5所提供的松江鱸肌酸激酶TfM-CK重組蛋白糖結(jié)合定量表，其 中，試驗(yàn)所得數(shù)值為3次重復(fù)試驗(yàn)平均值；
[0022]圖3為本發(fā)明實(shí)施例6所提供的TfM-CK重組蛋白對(duì)有凝集作用的金黃色葡萄球菌 (革蘭氏陽(yáng)性菌)和鰻弧菌(革蘭氏陰性菌）以及沒(méi)有凝集作用的綠膿桿菌的凝集示意圖； [0023]圖4為本發(fā)明實(shí)施例7所提供的TfM-CK重組蛋白對(duì)糖的抑制凝集對(duì)比圖；
[0024]圖5為本發(fā)明實(shí)施例8所提供的分別注射鰻弧菌、鰻弧菌+松江鱸肌酸激酶TfM-CK 重組蛋白后的趣魚(yú)死亡率不意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施 例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范 圍。
[0026] 實(shí)施例1:松江鱸肌酸激酶TfM-CK基因的cDNA全長(zhǎng)序列的獲得：
[0027]將鰻弧菌(V. angu i 1 larum)刺激后的松江鱸皮膚粘液(實(shí)驗(yàn)組)與正常狀態(tài)下的松 江鱸皮膚粘液(對(duì)照組)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)，通過(guò)對(duì)比兩組蛋白的不同， 將實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組上調(diào)表達(dá)的蛋白條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示松江鱸Μ型肌酸激酶 中含有FEE ILTR、QKRGTGGVDT、ASVGGVFDIS肽段，根據(jù)已知的蛋白序列所對(duì)應(yīng)的核苷酸序列 以及NCBI網(wǎng)站上下載的其他物種:斑頭魚(yú)(Hexagrammos agrammus，AY583132.1)、十線六線 魚(yú)（Hexagrammos decagrammus，AY583138 · 1)、長(zhǎng)線六線魚(yú)（Hexagrammos lagocephalus, AY583136 · 1)、大洗六線魚(yú)（Hexagrammos otakii，AY583133 · 1)、叉線六線魚(yú)（Hexagrammos octogrammus，AY583134· 1)、白斑六線魚(yú)（Hexagrammos stelleri，AY583137 · 1)、喬氏杜父 魚(yú)（Jordania zonope，AY583146 · 1)、鹿角杜父魚(yú)（Leptocottus armatus，AY583147 · 1)、墨 綠平軸（Sebastes atrovirens，ΑΥ583131·1)、棘胸星八角魚(yú)（Stel lerina xyosterna， AY583148 · 1)、斑馬魚(yú)（Danio rerio，BC056706 · 1)、安大略鮭（Salmo salar，BT044639 · 1)、 美洲胡瓜魚(yú)（Osmerus mordax，BT074432 · 1)、真鯛（Pagrus ma jor，GU135652 · 1)、底鎌 (Fundulus heteroclitus，AB290197. 1)、星斑川鱗（Platichthys stellatus， GU062902 · 2)、斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus，AF227794 · 1)、白斑狗魚(yú)（Esox lucius， BT079098.1)、虹蹲（Oncorhynchus mykiss，EZ907109.1)、頭帶冰魚(yú)（Chaenocephalus aceratus，AY 161313.1)、羅非魚(yú)（Oreochromis mossambicus，AY034098· 1)和鉤吻杜父魚(yú) (Rhamphocottus richardsonii，AY583145 · 1)的肌酸激酶同源序列設(shè)計(jì)引物CKF1、CKR1 和 CKF2、CKR2，以松江鱸肌肉組織的cDNA為模板進(jìn)行PCR(PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94 。(:變性45s，56°C復(fù)性45s，72°C延伸30s，35個(gè)循環(huán)，72°C總延伸lOmin。）。經(jīng)測(cè)序得到序列片 段，根據(jù)片段和上述同源序列設(shè)計(jì)CKF3、CKR3，PCR后經(jīng)測(cè)序得到序列片段后，根據(jù)片段和上 述同源序列設(shè)計(jì)CKF4、CKR4、CKF5，并將CKF5和3' anchor R、5' Pr imer和CKR4配對(duì)進(jìn)行PCR， 將PCR產(chǎn)物純化后與pMD-18-T載體(TaKaRa生物技術(shù)公司）連接，并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌感 受態(tài)(DH5a)中，經(jīng)平板涂布后，挑出菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的菌株送上海生 工公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物為Ml 3-47和RV-M。經(jīng)測(cè)序、拼接后得到松江鱸肌酸激酶TfM-CK基 因的cDNA全長(zhǎng)序列(參見(jiàn)序列表〈400>1)，并對(duì)其進(jìn)行了編碼，得到了相應(yīng)的氨基酸序列(參 見(jiàn)序列表〈400>2)。預(yù)測(cè)蛋白分子量為42985.8Da，理論等電點(diǎn)（pi)為6.44AMART結(jié)構(gòu)域預(yù) 測(cè)表明，TfM-CK包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是N端的ATP-gua_PtransN結(jié)構(gòu)域，一個(gè)是C端ATP-gua_Ptrans結(jié)構(gòu)域。所用引物序列參見(jiàn)表1。
[0028] 表1松江鱸肌酸激酶TfM-CK基因 cDNA全長(zhǎng)序列獲得過(guò)程中所用引物序列
[0030] 實(shí)施例2:實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)檢測(cè)Tf M-CK基因的組織分布及鰻弧菌刺激 后的表達(dá)模式變化
[0031] 根據(jù)克隆所得的TfM-CK基因 cDNA序列設(shè)計(jì)qRT-PCR的引物CKRTF、CKRTR，以對(duì)照組 和刺激組的各時(shí)間點(diǎn)的cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR。具體反應(yīng)體系和步驟參見(jiàn)SYBR? Premix Ex Taq?說(shuō)明書(shū)。
[0032]
[0033] 由上述試驗(yàn)得出，鰻弧菌（V. angui 11 arum)刺激后松江鱸TfM-CK基因在肌肉、皮 膚、脾臟和頭腎中均上調(diào)表達(dá)，其中在肌肉中直至24h時(shí)表達(dá)量開(kāi)始上調(diào)至對(duì)照組的12倍左 右，這可能是由于機(jī)體受到外界病原體侵?jǐn)_后，需要調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)免疫機(jī)能來(lái)應(yīng)對(duì)細(xì)菌的感 染，待魚(yú)體適應(yīng)這種刺激后會(huì)迅速調(diào)動(dòng)體內(nèi)各種免疫因子來(lái)抵制病原體的入侵;而松江鱸 的皮膚、脾臟和頭腎中則分別在12h、24h、2h時(shí)TfM-CK基因表達(dá)量上調(diào)至最高，皮膚、脾臟和 頭腎與魚(yú)類的免疫息息相關(guān)，受病原體刺激后TfM-CK基因作為能量代謝酶在免疫器官和組 織中表達(dá)量上調(diào)。具體如圖1所示，其中，柱狀圖顯示了qRT-PCR的實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果，表示實(shí) 驗(yàn)組與Oh的顯著差異性(*P〈0.05;**P〈0.01)，誤差線是通過(guò)三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析所 得的標(biāo)準(zhǔn)差。TfM-CK基因在受到鰻弧菌刺激后的各免疫組織的表達(dá)量的增多說(shuō)明TfM-CK基 因是松江鱸體內(nèi)的一種急性時(shí)相蛋白，在松江鱸的固有免疫中發(fā)揮著重要的作用，因此可 用于制備治療、預(yù)防水產(chǎn)養(yǎng)殖病害藥物或魚(yú)飼料添加劑。
[0034]實(shí)施例3:松江鱸肌酸激酶TfM-CK重組蛋白的表達(dá)、純化與濃度測(cè)定 [0035] 1)表達(dá)菌株的篩選
[0036]提取表達(dá)載體pet30a構(gòu)建成功的DH5a菌中的質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21 (DE3)中，進(jìn)行篩選陽(yáng)性克隆。篩選出TfM-CK原核表達(dá)菌株，經(jīng)37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)12-16h〇
[0037] 2)重組蛋白的試表達(dá)
[0038] 將培養(yǎng)12-16h的TfM-CK原核表達(dá)菌株株按照1:100的比例轉(zhuǎn)培養(yǎng)約3-4h，加入終 濃度為〇.5mM的硫代半乳糖苷（IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE，將表達(dá)較好的菌株加1/10 體積甘油(80 % )，-70 °C保種。
[0039] 3)重組蛋白的大規(guī)模表達(dá)與純化
[0040] 將保種的菌株按照1:100的比例接種到含lOOyg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C、 200rpm過(guò)夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)培養(yǎng)至300mL含卡那霉素（100yg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)并進(jìn) 行誘導(dǎo)，并利用GenScript的His-tag親和層析柱根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化，將得到的純化蛋白 經(jīng)過(guò)尿素梯度透析復(fù)性，經(jīng)濃縮后重組蛋白濃度為1.7mg/mL。用Bradford法對(duì)重組蛋白濃 度進(jìn)行測(cè)定，具體步驟參見(jiàn)上海生工Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)。
[0041 ]實(shí)施例4:松江鱸肌酸激酶TfM-CK重組蛋白的酶活性的測(cè)定 [0042] 肌酸激酶CK可以催化三磷酸腺苷(ATP)和肌酸反應(yīng)生成磷酸肌酸，磷酸肌酸很快 會(huì)在水解、鉬酸銨和還原作用下生成鉬藍(lán)，而三磷酸腺苷(ATP)和二磷酸腺苷(ADP)很穩(wěn)定， 不會(huì)和鉬酸銨反應(yīng)，因此，可以根據(jù)生成無(wú)機(jī)磷的量來(lái)計(jì)算酶的活力。
[0043] 參照南京建成肌酸激酶(CK)測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行復(fù)性后重組蛋白TfM-CK的酶活力 測(cè)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Y = 7.4491 X絕對(duì)0D值-0.0716計(jì)算TfM-CK的酶活力(U/ml)。將TfM-CK 酶活力帶入公式:CK活力(U/mgpr〇t)=根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得的CK酶活力(U/mL)/待測(cè)樣 本蛋白濃度(mgprot/mL)。最終求的TfM-CK復(fù)性后的酶活力為3.1U/mg。根據(jù)酶活力測(cè)定結(jié) 果表明，本申請(qǐng)實(shí)施例所提供的松江鱸肌酸激酶TfM-CK重組蛋白具有較高的生物活性。 [0044]實(shí)施例5:松江鱸肌酸激酶TfM-CK重組蛋白糖結(jié)合試驗(yàn)
[0045] 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對(duì)TfM-CK重組蛋白對(duì)糖的直接結(jié)合活性進(jìn)行測(cè)定， 所選用的多糖為：肽聚糖(？6口1^(1(^17〇3118，？61'0、脂多糖（1^口(^〇1783(^1^1^(168，1^5)、脂 磷壁酸(Lipoteichoic acid，LTA)。將多糖用無(wú)菌水溶解，濃度為80yg/mL，超聲破碎（20% 功率，2s，3次）。具體步驟如下：
[0046] (1)包板:在96孔板中加入50yL多糖，并置于25°C恒溫培養(yǎng)箱中過(guò)夜晾干。
[0047] (2)固定:次日清晨，轉(zhuǎn)到60 °C雜交爐中烘烤30min。
[0048] (3)封閉：每孔加入200yL含5%的脫脂奶粉的PBS，37°C封閉2h。
[0049] (4)洗板:倒掉封閉液，每孔加入200yL的PBST (20 % Tween-80: PBS = 1:100)洗4次， 每次5min〇
[0050] (5)蛋白結(jié)合:每孔加入50yL的蛋白（蛋白用含1%脫脂奶粉的PBS稀釋），對(duì)照組加 入50yL不同濃度梯度的BSA，室溫下孵育3h。
[0051 ] (6)洗板:倒掉蛋白，每孔加入200yL的PBST( 20 % Tween-80: PBS= 1:100)洗4次，每 次5min〇
[0052] (7)加一抗:將TfM-CK的抗體按照1:300的比例稀釋于含1 %脫脂奶粉的roS中，每 孔加入lOOyL，室溫條件下反應(yīng)1-2h。
[0053] (8)洗板:倒掉一抗，每孔加入200yL 的 PBST(20%Tween-80:PBS=l:100)洗 4 次，每 次5min〇
[0054] (9)加二抗:將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔(二抗)按照1:3000的比例稀釋于含1 % 脫脂奶粉的PBS中，每孔加入100yL，室溫條件下反應(yīng)lh。
[0055] (10)洗板：倒掉二抗，每孔加入200yL的PBST( 20 % Tween-80: PBS= 1:100)洗4次， 每次5min〇
[0056] (11)顯色：按照上海生工IL-TMB顯色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行顯色，37°C條件下顯色5-1 Omin，酶標(biāo)儀450nm處讀取吸光值。
[0057] 結(jié)果可見(jiàn)，本實(shí)施例用ELISA法對(duì)3種糖：肽聚糖(peptidoglycans，PGN)、脂多糖 (lipopolysaccharides，LPS)、脂磷壁酸（lipoteichoic acid,LTA)進(jìn)行糖的直接結(jié)合實(shí) 驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示，糖結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明：松江鱸肌酸激酶TfM-CK重組蛋白可以和以上三種糖 特異性結(jié)合，并且隨著蛋白濃度的增加結(jié)合能力呈現(xiàn)出飽和性。這說(shuō)明松江鱸肌酸激酶 TfM-CK重組蛋白可作為模式識(shí)別受體發(fā)揮作用，在這種情況下，重組蛋白可通過(guò)糖結(jié)合等 識(shí)別致病菌，從而介導(dǎo)下游的免疫效應(yīng)作用，例如凝集、固化、誘導(dǎo)吞噬作用、激活補(bǔ)體、激 活血小板、加強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性。
[0058]實(shí)施例6:松江鱸肌酸激酶TfM-CK重組蛋白的細(xì)菌凝集試驗(yàn)
[0059]選擇抑菌實(shí)驗(yàn)中的8種細(xì)菌進(jìn)行細(xì)菌凝集實(shí)驗(yàn)，將細(xì)菌接種于3mL液體培養(yǎng)基中37 °C(鰻弧菌28°C)過(guò)夜培養(yǎng)，按照1:100的比例轉(zhuǎn)培養(yǎng)3-4h左右至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，6000rpm，5min 離心，用TBS洗滌兩次后重懸，并用TBS將菌濃度調(diào)至3X106個(gè)細(xì)胞/mL。將重組蛋白加入96 孔板中，每孔25yL，然后加入25yL細(xì)菌，室溫孵育lh，陰性對(duì)照組將重組蛋白用BSA代替。實(shí) 驗(yàn)結(jié)束后將以上各組在倒置顯微鏡下觀察拍照。
[0000] 結(jié)果表明：TfM-CK重組蛋白可以凝集暢弧菌（V.anguillarum)、金黃色葡萄球菌 (S. aureus )、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)和肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae )，而對(duì) 于巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、枯草芽孢桿菌(B. subtilis)、大腸桿菌(E. coli)和綠膿 桿菌(P. aeruginosa)無(wú)凝集作用。如圖3所示，其列舉了 TfM-CK重組蛋白對(duì)有凝集作用的金 黃色葡萄球菌(革蘭氏陽(yáng)性菌)和鰻弧菌(革蘭氏陰性菌）以及沒(méi)有凝集作用的綠膿桿菌的 凝集示意圖。
[0061 ]實(shí)施例7:松江鱸肌酸激酶TfM-CK重組蛋白的糖的抑制凝集實(shí)驗(yàn)
[0062] 將TfM-CK重組蛋白（200yg/mL，25yL)與不同濃度的25yL PGN、LPS、LTA加入96孔板 中室溫孵育lh后加入25yL的鰻弧菌，室溫孵育lh，陰性對(duì)照組將重組蛋白用BSA代替，陽(yáng)性 對(duì)照組只加重組蛋白和細(xì)菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將96孔板在倒置顯微鏡下觀察拍照。
[0063]結(jié)果表明：在加入三種糖后，細(xì)菌的凝集現(xiàn)象明顯減弱，但并沒(méi)有完全抑制凝集， 如圖4所示。
[0064]結(jié)合實(shí)施例6、7所提供的松江鱸肌酸激酶TfM-CK重組蛋白的細(xì)菌凝集試驗(yàn)及糖的 抑制試驗(yàn)可知，本發(fā)明實(shí)施例得到的TfM-CK重組蛋白是一種具有凝集素活性的抑菌因子， 既可以作為一種模式識(shí)別受體(PRR)(參見(jiàn)實(shí)施例5)，又可以作為效應(yīng)子發(fā)揮作用（參見(jiàn)實(shí) 施例6、7)。
[0065]實(shí)施例8:松江鱸肌酸激酶TfM-CK重組蛋白的細(xì)菌感染試驗(yàn)
[0066]將鰻弧菌在28°C溫度下振蕩培養(yǎng)并轉(zhuǎn)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，用TBS洗滌2次后重懸 至1 %體積。將個(gè)體大小相似的鯉魚(yú)(Cyprinus carpio)飼養(yǎng)于充氣的淡水中，室溫下適應(yīng) 一周后進(jìn)行試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)鯉魚(yú)平行分為3組，分別注射鰻弧菌、0.65%NaCl溶液（陰性對(duì)照）、松 江鱸肌酸激酶TfM-CK重組蛋白（1.5mg/ml)+鰻弧菌（1:1混合），每12小時(shí)統(tǒng)計(jì)死亡率，直至 96小時(shí)。
[0067]結(jié)果如圖5所示，鰻弧菌刺激后松江鱸肌酸激酶TfM-CK重組蛋白在松江鱸體內(nèi)的 免疫作用實(shí)驗(yàn)表明，相比于只注射鰻弧菌組，注射鰻弧菌+松江鱸肌酸激酶TfM-CK重組蛋白 組在96小時(shí)內(nèi)的致死率相比降低到35%。由于0.65%NaCl溶液為陰性對(duì)照，沒(méi)有死亡，因此 圖5中未示出該條曲線。
[0068]可以理解的是，鰻弧菌是條件致病菌，當(dāng)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物在不良的環(huán)境條件下，遭遇 不利刺激或是受傷時(shí)，鰻弧菌會(huì)誘發(fā)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物疾病的發(fā)生。但結(jié)合實(shí)施例8所給出的細(xì) 菌感染試驗(yàn)可知，在向鰻弧菌中加入松江鱸肌酸激酶TfM-CK重組蛋白后，可明顯降低鯉魚(yú) 在96小時(shí)內(nèi)的致死率，因此，可將松江鱸肌酸激酶TfM-CK重組蛋白作為添加劑加入到魚(yú)飼 料中，作為魚(yú)飼料投喂水產(chǎn)動(dòng)物時(shí)，不僅可降低其致死率，而且結(jié)合上述實(shí)施例可知，松江 鱸肌酸激酶TfM-CK重組蛋白還具有免疫識(shí)別效應(yīng)，因此還可提高水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫能 力。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種松江鱸肌酸激酶TfM-CK基因，其特征在于，其序列全長(zhǎng)為1474bp，包含1146bp基 因開(kāi)放閱讀框，其核苷酸序列如下： 1 (ΧΛΛΤ(:Λ?'(.;(，CTTTC.GGTAA 61 GA(j I AC C C.C (.i ACV ! G lCL AA GC ACAACAAC C A I Λ IGGC I A AGG I I C l C AC C AACK.iAGC I G 121 I'A rCiCiCAACiC ??'Α??Γ?ΠΛΓAG Γ?ΓΑΟΑΓΑΓΓΓ ΛΓ??'(iG( ?'Α?'A ( Γ( ??Κ?Α ΙΤ?Α ΓΑ?'( Α?'( ('AG 181 ΑΓ?'00?Χ3?Γα ACAACCTrOG TC ACCCCTW ATC*ATGAC^r〇 ???(.Κ??(：Ο?'C Ο???Ο??ΑΤ 24.1 GAGGAG rCCrr A l'GAGCi? C ? Γ CAAGGAGC l'G TYGGACCC CG ?Χ A IX l'CC GA l'CCi ! CA ΓΑΛ?' mi CiGA 1'ACAAGC CCAC IGAC AA CiCACAAGACC GACC I'GAAC l' 1TGAGAACX：T CiAAGGCVJ'GGT 361 GACGACCTGG ACCCCAACTA CGTTCTGTCC AGCCGCGTTC GTACCGGCCG CAOCATCAAG 421 ΓΚ?Α??? A( ( ( ?(?ΓΓ( ( ΓΓ( A (?ΑΓΑ(?('Γ(Π CKKiCiACiCOr A (iACi( ( A Ι?'(iA ??ΛΑΓ?Γ?ΧΓΓΠ 481 QTVGAGGCIC I'GACCAGC Γ Γ GCJA IXiGCGAG i' l'CAAGGCiGA ΑΟ? AC ! ACCC CC ?ΟΛΑΟ?ΓΓ .54.1 ATGACTGAOG GCGAGGAGGA GCAGCTGATG AGTGATCACT XCTTGTXTGA CAAGCCTGIC 601 TC I'U CX I GC I'GACC 1OCGC ? GGC A I GGCC C CrKiAC I'CKiC C C'GA I (jGC'AG AGGC Α?Ι Λ?'Ο 661 C ACAAC GAC A ACAAAACCII' CC'!Xii：i! Cl GG GIGAACGAGG AGCiAC C" ACC 1 GCG IΟ?? AIC 721 ?Γ(：Α? (Κ ACiC AGCKH CKiCAA ΓΛ?Τ?Α(Κ?( iAG 0-ΓΓ??? ΑΑΑΓ GC ?? Γ?Χ?Γ(??' I GiiCC I CiCAG 781 AMjATTGAGG AOGTCTTGAA GAGQCACAAC CACOGCTTCA TCiTGGAACCjA GCATCTCGGC .84.1 TACATCCTGA CTTCjCCCTK CAACCIXKiGT ACCGGCXn'GC Ο??σΓΟΟ?'σΓ CCACGICAAG 901 C IOC.C C AAGC K AGC AC AC'A 1 CXX ΑΑ?? 11 C.iAC.K.iACiA IC C K ACX AGCiC I GCiiK IGC AO 961 ΑΑ(Χ'(.ι?Χ??Α A CAGGJGGTiyY GGACACTGCC ?ΓΧ (.H CiGCiK； G I G I'G? ? ! GA CATCTCCAAC 102! GCCGM CQJC rl'GCiGC I'CC ΓΓ ??Α?.?σΓ?.??Χ'? CAGCi l (X AGC' ?ΧΚΠ 'Ο?Π'? CiA CGGVGTYAAG 1081 C I'C Α?GG i'CG AGA i'GGAGAA GAAGC I'GGA(.i AAGGGAGAGG CCAWGACAG C Α? (?Λ?'(：CC(； 1 14! GCACAGAACiT AAAG/\(iGGAC ΛΛ?ΓΤΤΛΤ i T ??'Λ?Γ?C (iT(j AC t A ΓΙΓΛ Γ(.廠「(.?ΓΛΛΤΓ 1201 CCAGCTGACGGGCGTOCAGA GGAAACAGCC GCTCACCAAG AGACTGACTC TGCGCACCTC 1261 Ι ? ? ??? ΓΓ?Χ： (；??'( C ΑΟ???' I ????Τ. ??? (' (? ( ? ??'( Π ? ? ? IΚ ΑΓ ΓΓΙ? Γ?'Γ( ?'Ο?' 132! (??? CiCi l ΚΚ??' AACATCCTGG ΟΛ?Χ ?.?ΟΓΓΙC CA( ICiAGC ICi GGC TCGC (；?'0 GC AGACGI GG 1381 GATCACCTAC TTTTTCCTAT AAAAAOTAAT GACTATTGAA GCTGTCTATA CTGCTCAATA 1441 ΑΑΑΑΑΑΟ? ΑΓ (: ACCCT ATAA AAAAAAAaAA AAA A 其中，序列中下劃線標(biāo)示的ATG為起始密碼子，下劃線標(biāo)示的TAA為終止密碼子，下劃線 示出的AATAAA為加尾信號(hào)。2. -種利用如權(quán)利要求1所述的松江鱸肌酸激酶TfM-CK基因編碼的蛋白，其特征在于， 包括381個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如下： 1 MET Pro Plae Cly. A.sn Thr His Asn Mil Phe Lys Leu isn Tyr Lys Va.l. :Gl.u Asp. Gill Ty.r 5 10 15： 20 21 Pro Asp Leu S：er Lys- His Apn Asn. His. MET Ala Lys Val Leu 'Ihr Ly：s, Glu Leu fyr Gly 2.5 m 35 40 41 :Lys Leu A丄 g Asp Ai.g Gl.ii Thi· Pro Ser :Gly Tyi· Tlu· Leu Agp. Aep lie lie Gin Thr :Gly 45 50 55 60 61 Val Asp Asn Ρτσ GI:y .His Prx>： Phe lie. MET Thr Val. Cys Val Ala Gly Asp G.lu -Glu m 70： 75 80 8:1 Ser Tyr Glu Val Phe' Lys ；GIu Leu Leu Asp Pr:a. Val. He· Ser Asp- Ar-g His As:n Gly Tyr E5 90 '95 Γ00 101 Lys Pro Thr Asp Lys H.i-s Lys- Thr Asp· Leu Asn Fhe· Glu Am Leu Lys Gly Gly A.sp Asp 105 110 115 120 J21 Leu Asp Pro Asn Tyi- Val Leu Ser Ser .Arg Val Ai.g Thr Gly Arg Ser lie Lys Gly Phe 125 1:30 1? 140 14：i Thr Leu Ρτ：?· Pr〇· His Asii S$r Arg Gly Glu Arg .Arg. Ala 11? ：G'lU Lys: L.eu S&r Val Glu 145 150 155 160 161 Ala Leu Thr Sex Leu A.sp· Gly Glu. Phe：· Lys: Gly Lys. Tyr Tyr Pro Leu Ly：s Ser MET Thr 1.65 170 175 180 181 Asp: Ma Glu G.lrr Glu Gin Leu lie Set' Asp His Pha Leu Phe Asp Lys Pj-〇 Val 5er Pro 185 .190 195 200 201 Leu. Leu Thr. Cys- Aia (}ly MET Ala. Arg. Asp Trp. Pro. Asp Gly Arg Gly Il.e MET His Asn 205 210 .21.5 .220 221 Asp· Asn Lys Thr Phe Leu Val Trp Val. Asn Glu Glu Asp His Leu Arg ￥al lie Ser .MET 225 230 23-5 240 24. Gin. GIri Gly Gly Asii· MET Arg Glu Val. Phe Lys Ar.g Phe Cys Val Gly Leu &-1η. Lys lie 245 250 255 280 261 Gl.u Glu Val Phe Lys Arg： His- Asn Eis： Gly Phe Met Trp -Asn Glu His Leu Gly Tyr lie 265 270 275 .280 2:81 Leti T.h；r Cys Pro Ser Asn Le.u Gly. Thr Gl5f L.eti Arg 6iy G.l-y His :Ya:l Lys Leu Pi-o 2S5 290 .2^5 300 .3()1 'Lys Leu Ser Thr His Pro L.ys Phe. Gi/u G丄? Il:e Leu Thr Arg Leu .Arg Leu Gin Ly's Arg 305 310 315 320 321 Gly Thr Gly Gly Val A$p Thr Ala Ser Val Gly Gly Val Phe Asp lie Ser Asn Ala A$p 325 330 335 340 3:4.1. Arg Leti- Ser Ser :G；iu Val S:er Gin Yal G：ln L.e；u Val Val Asp Gly Val Lyg L,eii' let 345 3：S；0 355 36：0 361 Yal GLu MET Glu Lys Lys Leu Glu Lys GLy Glu Ala lie Asp Ser MET lie Pro Ala .Gin 36'5 370 375· 3S0 3? Lys本縣 其中，N端結(jié)構(gòu)域是從第24位氨基酸殘基到第99位氨基酸殘基，C端結(jié)構(gòu)域是從第120為 氨基酸殘基到第367位氨基酸殘基。3. -種松江鱸TfM-CK重組蛋白，其特征在于，由權(quán)利要求1所述的松江鱸肌酸激酶TfM-CK基因通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)得到。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的松江鱸TfM-CK重組蛋白，其特征在于，所述原核表達(dá)系統(tǒng)中所 采用的原核表達(dá)菌株為大腸桿菌BL21(DE3)，表達(dá)載體為pet30a。5. -種如權(quán)利要求1所述的松江鱸TfM-CK基因在制備治療或預(yù)防水產(chǎn)養(yǎng)殖病害藥物中 的應(yīng)用。6. -種如權(quán)利要求1所述的松江鱸TfM-CK基因在制備魚(yú)飼料添加劑中的應(yīng)用。7. -種如權(quán)利要求3所述的松江鱸TfM-CK重組蛋白在制備魚(yú)飼料添加劑中的應(yīng)用。8. -種如權(quán)利要求3所述的松江鱸TfM-CK重組蛋白在制備治療或預(yù)防水產(chǎn)養(yǎng)殖病害藥 物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A23K20/153GK105950636SQ201610404973
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月6日
【發(fā)明人】劉瑩瑩, 祝茜, 陳學(xué)昭, 于珊珊, 宋翠, 蔣東方, 王琛琪
【申請(qǐng)人】山東大學(xué)（威海）