Survivin啟動子控制的自殺基因HSVtk真核表達(dá)載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Survivin啟動子控制的自殺基因HSVtk真核表達(dá)載體，本發(fā)明所述真核表達(dá)載體結(jié)合外源藥物更昔洛韋(GCV)，對KYSE150食管癌細(xì)胞具有特異性殺傷作用，且其作用顯著強(qiáng)于HepG2肝癌細(xì)胞。
【專利說明】
Surv i v i η啟動子控制的自殺基因 //?Sl/i/f真核表達(dá)載體
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種由Survivin啟動子控制的自殺基因 "SK從真核表達(dá)載體，所述真核表達(dá)載體對KYSE150食管癌細(xì)胞具有特異性殺傷作用。
【背景技術(shù)】
[0002] 食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，這種腫瘤的發(fā)生與地區(qū)、種族和病理類型 差異有關(guān)。全世界每年約有20萬人死于食管癌，我國是食管癌的高發(fā)國家，在腫瘤死亡率中 僅次于胃癌，發(fā)病年齡多在40~60歲，男性多于女性。目前的食管癌治療策略包括手術(shù)和放 療、化療，手術(shù)為最主要的治療手段。但由于多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期，傳統(tǒng)治療方法對再 發(fā)和轉(zhuǎn)移的晚期腫瘤治療效果不理想，且會對患者造成較大的毒副作用。因此，腫瘤的基因 治療成為一種有前景的治療策略。
[0003] 基因治療是將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到靶細(xì)胞中，對疾病相關(guān)基因缺陷和異常進(jìn)行相應(yīng)的 修正或補(bǔ)償，以達(dá)到最終治療效果。腫瘤基因治療研究中常被關(guān)注的是單純皰疹病毒胸苷 激酶/丙氧鳥苷dKiA/GCV)自殺基因系統(tǒng)。治療腫瘤的機(jī)制主要包括自殺效應(yīng) 和旁觀者效應(yīng)。自殺效應(yīng)指從基因可編碼胸苷激酶，而胸苷激酶又可以磷酸化多種核苷 酸類似物，例如抗病毒藥物更昔洛韋(GCV)。在DNA的復(fù)制過程中，磷酸化的GCV可以終止DNA 鏈3'-OH端堿基的延長，從而終止DNA的復(fù)制過程，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。旁觀者效應(yīng)即自殺基因轉(zhuǎn) 染到部分腫瘤細(xì)胞中，當(dāng)加入GCV時，腫瘤細(xì)胞明顯被殺傷，而周圍未轉(zhuǎn)染目的基因的細(xì)胞 也被大量殺死。因此，/WKM/GCV自殺基因體系已經(jīng)成為惡性腫瘤基因治療的有效手段之 〇
[0004] 基因治療是否有效，取決于被轉(zhuǎn)染到靶細(xì)胞中的外源基因能否穩(wěn)定表達(dá)，而這需 要構(gòu)建一種安全性較高的載體。因此，需要選擇一種理想的特異性啟動子連接到載體中，以 限制治療基因的無選擇表達(dá)。目前的研究表明，一些啟動子已經(jīng)被成功運用到腫瘤基因治 療中，對腫瘤細(xì)胞的生長起到了明顯的抑制作用，這為腫瘤的基因治療創(chuàng)造了特異性的新 靶點。
[0005 ] 基因是凋亡抑制家族（IAP)中凋亡抑制作用最強(qiáng)的蛋白之一，該基因能 夠編碼142個氨基酸，過表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞中，但在正常人組織細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。研究 表明，基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，它能夠抑制細(xì)胞凋亡，使G2/M期細(xì)胞減 少，促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種由Survivin啟動子控制的自殺基因 TTSTtfr真核表達(dá)載 體，以調(diào)控所述自殺基因"SK從對KYSE150食管癌細(xì)胞的特異性殺傷作用。
[0007] 本發(fā)明所述的Survivin啟動子控制的自殺基因似以女真核表達(dá)載體中含有SEQ NO. 1所示核苷酸序列的自殺基因"SK從基因片段、SEQ N0.2所示核苷酸序列的Survivin啟 動子，所述Survivin啟動子和/基因片段被連接在質(zhì)粒載體pBI_CMV2上。
[0008] 進(jìn)一步地，本發(fā)明所構(gòu)建的真核表達(dá)載體為pBI-CMV^AcGFPi-pSurvivin-TK，在所 述真核表達(dá)載體的Amp和Ori之間依次連接有GFP、CMV增強(qiáng)子、Survivin啟動子和"外從基因 片段。
[0009] 本發(fā)明意外發(fā)現(xiàn)，Survivin啟動子能夠特異性調(diào)控從自殺基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞 的凋亡作用，即其能夠特異性選擇腫瘤細(xì)胞，從而提高自殺基因的靶向性。
[00? 0]據(jù)此，本發(fā)明成功構(gòu)建了 一種由Surv i V in啟動子驅(qū)動的調(diào)控自殺基因的真 核表達(dá)載體pBI-CMVfAcGFPi-pSurvivin-TK，并將其導(dǎo)入KYSE150食管癌細(xì)胞中，實驗證明 能夠?qū)崿F(xiàn)該載體在KYSE150食管癌細(xì)胞中的高效特異性表達(dá)。
[0011] 本發(fā)明所構(gòu)建的真核表達(dá)載體結(jié)合自殺基因系統(tǒng)能夠有效抑制KYSE150食管癌細(xì) 胞的生長增殖，表現(xiàn)出對KYSE150食管癌細(xì)胞的較高特異性及選擇性，并具有較好的選擇性 及低毒性。至關(guān)重要的是，這種凋亡抑制作用比在IfepG 2肝癌細(xì)胞中更加顯著。
[0012] 基于上述實驗效果，本發(fā)明還涉及所述真核表達(dá)載體在制備治療食管癌的藥物中 的應(yīng)用。
[0013] 將本發(fā)明構(gòu)建的由Survivin啟動子介導(dǎo)的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到KYSE150食管癌細(xì) 胞中，該啟動子在KYSE150食管癌細(xì)胞中被活化，從而啟動目的基因的表達(dá)，而在正常細(xì)胞 中Survivin啟動子無法被激活，目的基因不表達(dá)。因此，通過這個原理可將腫瘤細(xì)胞有效殺 死。
【附圖說明】
[0014] 圖1是本發(fā)明構(gòu)建的pBI-CMV^AcGFPi-pSurvivin-TK真核表達(dá)載體的質(zhì)粒圖譜。
[0015] 圖2是pBI-CMV^AcGFPi-pSurvivin-TK真核表達(dá)載體中"SK認(rèn)基因的酶切鑒定電泳 圖。
[0016] 圖3是流式細(xì)胞儀檢測的真核表達(dá)載體在KYSE150食管癌細(xì)胞和HepG2肝癌細(xì)胞中 的轉(zhuǎn)染效率。
[0017] 圖4是Western blotting法檢測真核表達(dá)載體在KYSE150食管癌細(xì)胞和HepG2肝癌 細(xì)胞中的蛋白表達(dá)情況。
[0018] 圖5是MTT法檢測KYSE150食管癌細(xì)胞和HepG2肝癌細(xì)胞的存活率。
[0019] 圖6是流式細(xì)胞儀檢測KYSE150食管癌細(xì)胞和HepG2肝癌細(xì)胞的凋亡情況。
[0020] 圖7是流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位的下降情況。
【具體實施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說明。本發(fā)明所述實施例僅 用于解釋本發(fā)明，而不應(yīng)理解為對本發(fā)明范圍的限制。在不背離本發(fā)明技術(shù)方案的前提下， 對本發(fā)明所作出的本領(lǐng)域技術(shù)人員容易實現(xiàn)的任何改動，都應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的內(nèi)容。
[0022] 本發(fā)明所述實施例中的主要試劑和材料如下所述，未注明具體條件的實驗方法， 通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。
[0023] 人食管麟癌細(xì)胞系KYSE150，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫；人肝癌細(xì)胞株 HepG2,購自中科院上海細(xì)胞庫；大腸桿菌DH5a，購自北京康為公司；各種限制性內(nèi)切酶，購 自Takara公司；質(zhì)粒抽提純化試劑盒，購自O(shè)MEGA公司；快速DNA提取擴(kuò)增試劑盒，購自北京 康為公司；所有引物購自上海生工生物工程公司；蛋白質(zhì)提取試劑盒、蛋白質(zhì)定量試劑盒， 購自北京康為公司；羊抗的胸苷激酶單克隆抗體HSV-1，購自Santa Cruz公司；辣根過氧化 物酶標(biāo)記驢抗山羊IgG(H+L)，購自碧云天公司;β-actin-抗為鼠抗人單抗和辣根過氧化物 酶標(biāo)記山羊抗小鼠 IgG，購自中杉金橋公司;MTT試劑，購自Solarbio公司；更昔洛韋(GCV)， 購自湖北科益藥業(yè);流式凋亡檢測試劑盒，購自南京凱基公司；線粒體膜電位檢測試劑盒， 購自碧云天公司。其他試劑皆為國產(chǎn)分析純。
[0024]實施例 1 :pBI-CMV2-AcGFPi_pSurvivin-TK 真核表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0025] 1、提取HepG2肝癌細(xì)胞的基因組DNA。
[0026] 培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，待細(xì)胞生長密度達(dá)80%時，收集細(xì)胞，PBS緩沖液洗兩遍，以DNA提 取擴(kuò)增試劑盒提取基因組DNA，加入200μ1 Buffer SA及10μ1 Proteinase K混勻，56°C孵育 10min，95°C孵育5min，13000rpm離心5min，轉(zhuǎn)移上清液至1.5ml EP管，得到基因組DNA。
[0027] 2、PCR擴(kuò)增Survivin啟動子序列。
[0028] 反應(yīng)體系：2XPCR Master Mix，10yl;上游引物與下游引物各ΙμL;基因組DNA 2μ l;RNase-Free Water 6μ1。反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性3min，94°C變性40s，65°C退火30s，72°C延 伸40s，共30個循環(huán)，最后72°C終延伸3min。
[0029] 其中上游引物序列：5'-GCCATTAATCTGGCCATAGAACCAGAGAAGTGA-3'（SEQN0·5)，下 游引物序列：5 '-ATACGCTAGCCGCACGCCCTCTTAGGCGGTCCACC-3 '（ SEQ NO · 6)。
[0030] 擴(kuò)增結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳30min，成像。紫外儀下按照OMEGA公 司購得的DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，洗脫出DNA，即Survivin啟動子序列。 [0031 ] 3、真核表達(dá)載體 pBI-CMV2-AcGFPi_pSurvivin-TK 的構(gòu)建。
[0032] 真核表達(dá)載體pBI-CMVrAcGFPi-pSurvivin-TK的設(shè)計由本實驗室完成，在質(zhì)粒 pBI-CMV2的基本結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上構(gòu)建所述真核表達(dá)載體，保留原有結(jié)構(gòu)中的CMV增強(qiáng)子，并以凋 亡抑制蛋白啟動子(Survivin啟動子)代替原有的巨細(xì)胞病毒啟動子(CMV啟動子）。
[0033] 取由普如汀生物技術(shù)有限公司構(gòu)建的質(zhì)粒載體pAFP-TK-IRES2-EGFP，以SEQ N0.3 所示的上游引物5 ' -CGCGGATCCATGGCTTCGTACCCCTGC-3 '和SEQ N0 · 4所示的下游引物5 ' -CCCAAGCTTTCAGTTAGCCTCCCCCATC-3 ' 進(jìn)行擴(kuò)增，得到基因。取質(zhì)粒載體pBI-CMV2，用 BamHI和Hindll I雙酶切后，以T4DNA連接酶與上述擴(kuò)增得到的"SK從基因連接，構(gòu)建成含目 的基因的質(zhì)粒載體。
[0034]進(jìn)一步將上述構(gòu)建成功的質(zhì)粒載體與擴(kuò)增得到的Survivin啟動子分別用Xhol和 BamHI雙酶切后，用T4DNA連接酶相連，構(gòu)建成圖1所示的在食管癌細(xì)胞中特異性高表達(dá)的真 核表達(dá)載體 pBI-CMV2~AcGFPi-pSurvivin-TK。
[0035] 4、菌體轉(zhuǎn)化。
[0036]離心管中加入DH5a感受態(tài)細(xì)胞1〇〇μ1，置于冰浴中，待感受態(tài)細(xì)胞融化后，向感受 態(tài)細(xì)胞懸液中加入lng構(gòu)建的真核表達(dá)載體pBI-CMV^AcGFPi-pSurvivin-TK，用移液器輕輕 吹打混勻，冰浴30min; 42 °C熱擊90s，迅速轉(zhuǎn)移至冰浴中靜置3min。向每個離心管中加入900 μL不含抗生素的無菌LB培養(yǎng)基，混勾后置于37°C搖床，150rpm振蕩培養(yǎng)45min，使菌體復(fù)蘇。 取100μ1已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，加到含氨芐青霉素的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的涂布棒 將細(xì)胞均勻涂開，直至干燥，倒置平板，37 °C培養(yǎng)12~16h，隨后挑取單克隆菌落加入到LB培 養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，37 °C、220rpm孵育4h。
[0037] 5、質(zhì)粒提取。
[0038] 質(zhì)粒提取采用OMEGA公司的質(zhì)粒快速提取試劑盒。
[0039] 收集細(xì)菌于1.5ml離心管中，加入250μ1 Solution I/RNaseA混和液，漩渦振蕩；加 入250μ1 Solution II，溫和顛倒6次;加入350μ1 Solution III，溫和顛倒數(shù)次至形成白色 絮狀沉淀，12000Xg離心10min;轉(zhuǎn)移上清液至套有2ml收集管的HiBind DNA結(jié)合柱中， 10000 X g離心lmin，棄去收集管濾液;裝回收集管，加入500μ1 HB Buff er，10000 X g離心 lmin，棄濾液;重新裝回收集管，加入700μ1 DNA Wash 131^€61'，10000\8離心1111；[11，棄濾液； 重新裝回收集管，10000 X g離心空柱2min以甩干柱子基質(zhì);把柱子裝在干凈的1.5ml離心管 上，加入40μ1 Elution Buffer，靜置2min，10000 X g離心 lmin，洗脫出質(zhì)粒DNA，即為pBI-CMV2_AcGFPi-pSurvivin-TK。通過酶標(biāo)儀測定質(zhì)粒DNA的濃度。
[0040] 6、pBI-CMV2-AcGFPi-pSurvivin-TK 的酶切鑒定。
[0041 ] 在真核表達(dá)載體pBI-CMV2-AcGFPi-pSurvivin-TK的多克隆位點(MCS)中，BamHI與 Hindlll酶切位點之間存在著基因，經(jīng)雙酶切后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，如若插 入正確，將能被核酸內(nèi)切酶切出一條113 lbp的DNA條帶。
[0042] 酶切反應(yīng)體系：真核表達(dá)載體pBI-CMV2~AcGFPi-pSurvivin-TK，lyg; BamHI，2μ1; Hindlll，2μ1; 10 XK Buffer，ΙμL;以滅菌水補(bǔ)足體積至20μ1。
[0043] 電泳結(jié)果如圖2所示，證明//5Τ?Α基因被成功插入，pBI-CMV2_AcGFPi-pSurvivin-TK 真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。圖中：Marker:D2000 plus DNA Ladder，泳道1:真核表達(dá)載體的 BamHI::/HindIII 雙酶切驗證。
[0044]實施例2:真核表達(dá)載體在KYSE150食管癌細(xì)胞和HepG2肝癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。 [0045]通過脂質(zhì)體Lipofectamine 2000?介導(dǎo)，將pBI-CMV2~AcGFPi-pSurvivin-TK真核 表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到KYSE150食管癌細(xì)胞和HepG 2肝癌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48h，消化、收集細(xì)胞，以PBS 重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)EGFP的細(xì)胞，計算表達(dá)EGFP細(xì)胞的百分比。通過各組細(xì)胞 表達(dá)EGFP的百分比確定真核表達(dá)載體對兩種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率(轉(zhuǎn)染率=綠色熒光細(xì)胞數(shù)/細(xì) 胞總數(shù)XI00%)。
[0046]圖3給出了流式細(xì)胞儀檢測真核表達(dá)載體在KYSE150食管癌細(xì)胞和HepG2肝癌細(xì)胞 中的轉(zhuǎn)染效率結(jié)果。圖中：A為KYSE150食管癌細(xì)胞不轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體的綠色熒光蛋白檢 測結(jié)果;B為KYSE150食管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體48h后檢測的綠色熒光蛋白結(jié)果，間接表 示細(xì)胞轉(zhuǎn)染率;C為HepG 2肝癌細(xì)胞不轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體的綠色熒光蛋白檢測結(jié)果;D為!fepG2 肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體48h后檢測的綠色熒光蛋白結(jié)果;柱狀圖表示四組細(xì)胞轉(zhuǎn)染率 的變化。
[0047] 由圖3結(jié)果可知，真核表達(dá)載體pBI-CMV2-AcGFPl-pSurvivin-TK被轉(zhuǎn)染到KYSE150 細(xì)胞和HepG2細(xì)胞后，KYSE150細(xì)胞和HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率均較高，兩組轉(zhuǎn)染率差異無統(tǒng)計學(xué) 意義(P>0.05)。
[0048] 以下實施例在轉(zhuǎn)染率一致的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步檢測自殺基因系統(tǒng)對食管癌和肝癌兩 種細(xì)胞的凋亡影響。
[0049] 實施例3:Western blot法檢測"SK認(rèn)自殺基因的蛋白表達(dá)。
[0050] 將KYSE150食管癌細(xì)胞和HepG2肝癌細(xì)胞分別接種于6孔板中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至70 ~80%匯合時，參照Lipofectamine 2000?說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。更換六孔板細(xì)胞的舊培養(yǎng)基為 無血清培養(yǎng)基，將脂質(zhì)體和質(zhì)粒復(fù)合物均勻加入相應(yīng)孔中，6h后換液為含10%血清的培養(yǎng)基 繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍，每孔加入150μ1 RIPA裂解液及蛋白 酶抑制劑PMSF(RIPA:PMSF=100:1)，充分裂解后轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管，12000rpm離心10min， 取上清，轉(zhuǎn)移到新的離心管中。
[0051 ] 配制工作液為A:B=50:1，充分混勻；用0.9%NaCl溶液將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成2000yg/ ml儲存液，然后稀釋至0~2000μg/ml;將25μ1標(biāo)準(zhǔn)品和合適濃度范圍的樣本添加于96孔板 的微孔中，各孔中加入200μ1 BCA工作液，充分混勻;蓋上96孔板蓋，37°C孵育30min。用酶標(biāo) 儀測定吸光度值(0D值562nm)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度。
[0052]安裝電泳儀并配膠，上樣后開始電泳（電壓100V)，完畢后切下合適尺寸的含目的 條帶凝膠，裁剪與膠大小一致的PVDF膜和6張濾紙一起放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中，再擺放于轉(zhuǎn)膜儀 轉(zhuǎn)膜，結(jié)束后將膜置于5%脫脂奶粉中封閉lh，之后孵育一抗，即羊抗胸苷激酶單克隆抗體 HSV-1稀釋液（1:800 )4°C孵育過夜，次日，TBST洗三次，5min/次，再于二抗辣根酶標(biāo)記的山 羊抗小鼠 IgG( 1:10000)稀釋液中孵育lh，TBST洗三次，5min/次，凝膠成像儀曝光分析結(jié)果。 [0053]結(jié)果如圖4所示，圖中泳道1為HepG2肝癌細(xì)胞;泳道2為KYSE150食管癌細(xì)胞;泳道3 為轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體的HepG 2肝癌細(xì)胞;泳道4為轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體的KYSE150食管癌細(xì)胞。 實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pBI-CMV^AcGFPi-pSurvivin-TK真核表達(dá)載體的KYSE150食管癌細(xì)胞中 形以感因的蛋白表達(dá)量高，相對分子量約為36kD，在HepG 2細(xì)胞中似以感因呈現(xiàn)弱表達(dá)， 而在空對照組中未見明顯表達(dá)。
[0054]實施例4 :MTT法檢測細(xì)胞毒性作用。
[0055] 以pBI-CMV^AcGFPi-pSurvivin-TK真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染對數(shù)期生長的KYSE150 食管癌細(xì)胞和HepG2肝癌細(xì)胞，并設(shè)置未轉(zhuǎn)染的KYSE150細(xì)胞和HepG2細(xì)胞作為陰性對照，培 養(yǎng)48h。消化收集細(xì)胞沉淀，細(xì)胞計數(shù)并用新鮮培養(yǎng)基稀釋，將細(xì)胞按5000/孔接種于96孔板 中，每孔培養(yǎng)液體積1〇〇μ1，邊緣孔用PBS緩沖液填充，置于C0 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種24h后，按 照劑量梯度為〇、1、5、10、20、40、60、80yg加入GCV，每個劑量設(shè)5個復(fù)孔，置于⑶ 2培養(yǎng)箱中繼 續(xù)培養(yǎng)。三天后，向待測孔加入20μ1 MTT溶液(5mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，輕輕吸去孔 內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μ1二甲基亞砜，置于搖床上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解，用 酶標(biāo)儀測定吸光度0D值，細(xì)胞生長抑制率(％) = [(對照組0D值一實驗組0D值)/對照組0D值] X100%〇
[0056]結(jié)果如圖5所示，KYSE150食管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體48h后加入不同濃度的GCV 可見，GCV對轉(zhuǎn)染后的KYSE150細(xì)胞和HepG2細(xì)胞均有顯著抑制作用，且隨著藥物濃度的增 高，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的存活率也呈現(xiàn)出顯著的下降趨勢，而對于不轉(zhuǎn)染任何真核表達(dá)載體的 KYSE150細(xì)胞和HepG2細(xì)胞未見明顯抑制。并且結(jié)果還顯示，真核表達(dá)載體對KYSE150細(xì)胞的 毒性作用明顯強(qiáng)于HepG2細(xì)胞。
[0057] 實施例5:流式細(xì)胞術(shù)檢測自殺基因系統(tǒng)對細(xì)胞凋亡率的影響。
[0058] 將pBI-CMV2-AcGFPi-pSurvivin-TK真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到KYSE150食管癌細(xì)胞和 HepG2肝癌細(xì)胞中，并培養(yǎng)未轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體的KYSE150細(xì)胞和HepG2細(xì)胞作為對照，繼續(xù) 培養(yǎng)48h后，用不含EDTA的胰酶將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，lOOOrpm離心3min，收集各組細(xì)胞 約1 X 106個，棄上清，PBS洗兩次后，加入Binding Buffer重懸細(xì)胞沉淀，過濾至流式管中， 加入5μ1 Annexin V-APC和5μ1 7-AAD，避光染色 15min，再加入200μ1 Binding Buffer重 懸，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率的變化。
[0059] 結(jié)果如圖6所示，圖中A代表KYSE150食管癌細(xì)胞不轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體，也不加藥物 GCV處理，24h后流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率;B代表KYSE150食管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體 后，用前體藥物GCV作用24h，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率;C代表HepG 2肝癌細(xì)胞不轉(zhuǎn)染真核 表達(dá)載體，也不用GCV處理，24h后流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率;D代表HepG2肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染真 核表達(dá)載體后，通過GCV處理24h，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。柱狀圖表示四組細(xì)胞凋亡率 的變化(n=3，*P<0 · 05，**P<0 · 01)。
[0060] 右下象限為早期凋亡細(xì)胞，左上象限為總死亡細(xì)胞，早期凋亡率=右下象限細(xì)胞 數(shù)/細(xì)胞總數(shù)，死亡率=左上象限細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。實驗結(jié)果顯示，相比于未轉(zhuǎn)染真核表達(dá) 載體的KYSE150細(xì)胞和Η印G 2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的KYSE150細(xì)胞和HepG2細(xì)胞凋亡率均顯著提高，且 KYSE150細(xì)胞的凋亡率高于!fepG2細(xì)胞，兩者間變化具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
[0061 ]實施例6:流式細(xì)胞術(shù)檢測自殺基因系統(tǒng)對線粒體膜電位的影響。
[0062]以 pBI-CMV2-AcGFPi-pSurvivin-TK 真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染 KYSE150 食管癌細(xì)胞和 HepG2 肝癌細(xì)胞，并設(shè)置未轉(zhuǎn)染的KYSE150細(xì)胞和HepG2細(xì)胞作為陰性對照。加入前體藥物GCV處理 24h，消化收集各孔內(nèi)細(xì)胞，分別重懸于0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液中；加入0.5ml JC-1染色工作液， 置于C02培養(yǎng)箱中孵育20min;細(xì)胞孵育結(jié)束后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至備好的1.5ml離心管中， lOOOrpm離心3~5min，沉淀細(xì)胞，棄上清；用（1 X ) JC-1染色緩沖液洗滌細(xì)胞兩次;最后加入 適量(1 X )JC-1染色緩沖液重懸細(xì)胞;流式細(xì)胞儀可檢測到紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變。 [0063]流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果如圖7所示，圖中A代表KYSE150食管癌細(xì)胞不做任何干預(yù)后 檢測紅色熒光的數(shù)量;B代表KYSE150食管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體后，前體藥物GCV干預(yù) 24h，檢測紅色熒光轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色熒光的水平;C代表HepG 2肝癌細(xì)胞不轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體，也 不用GCV處理，24h后檢測紅色熒光轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色熒光的水平;D代表HepG 2肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染真核 表達(dá)載體后，通過GCV處理24h，檢測紅色熒光轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色熒光的水平。通過比較能夠顯示出 線粒體膜電位的下降情況。柱狀圖代表四組細(xì)胞線粒體膜電位下降百分比的變化(n=3，**P <0·01，***Ρ<0·001)〇
[0064]由圖7可知，轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體后的KYSE150食管癌細(xì)胞中紅色熒光轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色熒 光的數(shù)量比轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體的HepG2細(xì)胞明顯增加，表明線粒體膜電位下降，兩組線粒體 膜電位的變化具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<〇. 05)。而未轉(zhuǎn)染組大多呈現(xiàn)紅色熒光，細(xì)胞基本不死 亡。
【主權(quán)項】
1. 一種Survi Vin啟動子控制的自殺基因從真核表達(dá)載體，含有SEQ NO. 1所示核苷 酸序列的自殺基因狀Kd基因片段、SEQN0.2所示核苷酸序列的Survivin啟動子，所述 Sur V i V i η啟動子和"SKiA基因片段被連接在質(zhì)粒載體pB I-CMV2上。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的真核表達(dá)載體，其特征是所述真核表達(dá)載體為PBI-CMV2-AcGFPi-pSurvivin-TK，在所述真核表達(dá)載體的Amp和Ori之間依次連接GFP、CMV增強(qiáng)子、 Survivin啟動子和//STiA基因片段。3. 權(quán)利要求1或2所述真核表達(dá)載體在制備治療食管癌的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/85GK105950655SQ201610333337
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月18日
【發(fā)明人】于保鋒, 李勇芳, 孟凡秀, 張琪, 齊永利, 李卓奇, 趙娜, 張英敏, 袁洋洋, 曾思衡, 姚志堅, 楊巧艷, 溫曉薇, 溫麗敏, 白欣艷, 張紫燕, 解軍, 徐鈞, 郭睿, 張悅紅, 王惠珍, 弓韜, 王海龍, 楊麗紅, 刁海鵬, 陳顯久, 秦琴, 董秀山, 胡曉年
【申請人】山西醫(yī)科大學(xué)