一種香蕉枯萎病病原菌致病性鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種香蕉枯萎病病原菌致病性鑒定方法，該方法包括以下步驟：（1）致病菌的培養(yǎng)及孢子懸浮液的制備；（2）用具的消毒及滅菌；（3）香蕉假莖切段；（4）接種；（5）培養(yǎng)；（6）致病性觀察。本發(fā)明方法能對(duì)病原菌致病性實(shí)現(xiàn)簡易、快速、直觀的快速鑒定，可大幅度地提高工作效率，為植物病害的防治做出重要作用。此外還具有以下優(yōu)點(diǎn)：香蕉維管束變褐癥狀明顯，直觀性強(qiáng)，易判斷；保濕性好，發(fā)病快，1周左右可知結(jié)果；接種量均勻，發(fā)病一致性強(qiáng)；簡單易操作，無需額外增添貴重儀器或材料；數(shù)據(jù)穩(wěn)定好，重復(fù)性強(qiáng)；同期可進(jìn)行大批量病原菌致病性的鑒定；對(duì)類似的維管束性病原菌的致病性鑒定也有重要的參考作用。
【專利說明】
一種香蕉枯萎病病原菌致病性鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種植物病原菌致病性的方法，具體是涉及香蕉枯萎病病原菌致病性鑒定方法，屬于植物病理學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]香蕉是世界貿(mào)易量及消費(fèi)量最大宗的鮮果，許多國家和地區(qū)將香蕉作為主要出口商品和國家經(jīng)濟(jì)的基本收入來源。然而香蕉產(chǎn)業(yè)迅猛發(fā)展的同時(shí)，也遭遇著有史以來香蕉枯萎病最嚴(yán)重的威脅和挑戰(zhàn)。
[0003]香蕉枯萎病，又稱黃葉病，香蕉巴拿馬病，“蕉癌”，是典型維管束性病害，該病害由是由尖孢鐮刀菌古巴?；?/7Usariuffi oxysporium f.sp.cubense Race 4)侵染引起的一種毀滅性病害。為了有效地防控該病害，對(duì)該病原菌的研究及對(duì)香蕉不同品種的抗病性評(píng)價(jià)成為這項(xiàng)工作的重要內(nèi)容，而要完成這項(xiàng)工作，致病性鑒定是必須通過的路徑。
[0004]據(jù)報(bào)道，有研究以香蕉巴西蕉和粉蕉葉片為材料，采用香蕉離體葉片接種香蕉枯萎病菌，鑒定病斑大小來建立了一種簡便快速的香蕉枯萎病突變體致病性鑒定方法(符冬妹等，2015)。該方法得到了同行的認(rèn)可。但是，眾所周知，香蕉葉片的主要結(jié)構(gòu)為葉肉組織而非維管組織，這兩種組織受到病原菌的破壞所表現(xiàn)的癥狀是不同的，特別是對(duì)于典型維管束為害的香蕉枯萎病菌來說，其代表性是不充分的。有報(bào)道在三角瓶中以改良培養(yǎng)基培養(yǎng)生長的香蕉苗，并將病原菌接種于根外，然后觀察香蕉苗的發(fā)病情況24天(Wu et al,2010)。我們采用該方法進(jìn)行致病性鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)香蕉苗還沒有表現(xiàn)癥狀，病原菌就長滿了三角瓶，菌絲布滿整個(gè)瓶壁直至瓶口，嚴(yán)重影響了病害觀察。盆栽法是比較傳統(tǒng)的方法，從接種到癥狀表現(xiàn)大約需要40天，耗時(shí)過長，且工作量較大(胡適連等，1988 ;Matsumoto etal, 1995；Subramaniam et al，2006)o
[0005]目前較為常用的鑒定方法是水培系統(tǒng)的鑒定法(DeAscensao and Dubery，2000;Groenewald et al,2006 ; Van den Berg et a_/，2007)，但是一般需要超過40天才能有結(jié)果，該方法耗時(shí)較長，工作效率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種香蕉枯萎病病原菌致病性鑒定方法，該方法能對(duì)枯萎病病原菌致病性實(shí)現(xiàn)簡易、快速、直觀的快速鑒定，可大幅度地提高工作效率，為植物病害的防治做出重要作用。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種香蕉枯萎病病原菌致病性鑒定方法，包括如下步驟:
(1)致病菌的培養(yǎng)及孢子懸浮液的制備:將待測病菌接種在PDA培養(yǎng)基上，28°C恒溫箱中培養(yǎng)6天;刮取培養(yǎng)物，用無菌水配制成濃度I X 105CFU/mL孢子懸浮液，備用；
(2)用具的消毒及滅菌:取厚度2mm的PU海綿，剪成A4紙規(guī)格的長方形，滅菌，獲得無菌海綿;準(zhǔn)備規(guī)格為16 X 40cm的帶蓋塑料箱，表面消毒，備用；
(3)香蕉假莖切段:將新鮮香蕉假莖表面消毒，然后用無菌刀切成長度5cm的香蕉假莖段；
(4)接種:將無菌海綿浸入步驟(I)制備的孢子懸浮液中，使得海綿充分吸收孢子懸浮液，然后取出海綿，將海綿平鋪在步驟(2)經(jīng)消毒的塑料箱底部，然后將步驟(3)的香蕉假莖段底部切面朝下至于塑料箱中的海綿上;再取另一張吸收了孢子懸浮液的無菌海綿覆蓋在香蕉假莖段的頂部；
(5 )培養(yǎng):合上塑料箱蓋，將塑料箱放置在28-30 °C的室內(nèi)環(huán)境中培養(yǎng)6天；
(6 )致病性觀察:培養(yǎng)結(jié)束后，打開塑料箱蓋，移開覆蓋在香蕉假莖段頂部的海綿，觀察香蕉假莖的維管束變褐，則說明該待測病原菌具有致病性;對(duì)比香蕉假莖的維管束變褐程度來判斷該待測病原菌致病性的強(qiáng)弱。
[0008]本發(fā)明所述的待測病菌可以是香蕉枯萎病病原菌，也可以是棉花枯萎病病菌、黃瓜枯萎病病原菌等引致維管束病害的病原菌。本發(fā)明的方法也可應(yīng)用于棉花枯萎病病菌或黃瓜枯萎病病原菌等引致維管束病害的病原菌的致病性鑒定。
[0009]本發(fā)明方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)香蕉枯萎病病原菌致病性的快速鑒定，該方法步驟簡單、結(jié)果直觀，具有以下優(yōu)點(diǎn):
(1)培養(yǎng)結(jié)果直接反映的是病原菌對(duì)香蕉維管束的致病性，無需推斷，結(jié)果直觀；
(2)香蕉維管束變褐癥狀明顯，直觀性強(qiáng)，易判斷；
(3)保濕性好，發(fā)病快，一般只需I周時(shí)間便有結(jié)果；
(4)接種量均勾，發(fā)病一致性強(qiáng)；
(5)整個(gè)過程簡單易操作，無需額外增添貴重儀器或材料；
(6)數(shù)據(jù)穩(wěn)定好，重復(fù)性強(qiáng)；
(7)同期可進(jìn)行大批量病原菌致病性的鑒定；
(8)對(duì)類似的維管束性病原菌的致病性鑒定也有重要的參考作用。
【附圖說明】
[0010]圖1為實(shí)施例1所使用PU海棉；圖2為實(shí)施例1所使用塑料箱；圖3為切成5cm等段的香蕉假莖;圖4為切好的香蕉假莖段平鋪于放置在塑料箱中、預(yù)先吸收了孢子懸浮液的海綿上方狀態(tài)圖；圖5為接種后，香蕉假莖上再覆蓋另一張預(yù)先浸泡于孢子懸浮液的狀態(tài)圖；圖6為將塑料箱蓋合上，進(jìn)行培養(yǎng);圖7為培養(yǎng)7天后的結(jié)果；圖8為對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果與致病性鑒定試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比，其中A1-A3為對(duì)照試驗(yàn)鑒定結(jié)果，維管束無褐變，B1- B3為致病癥狀，維管束褐變腐爛；圖9為致病性鑒定結(jié)果，其中A為香蕉假莖的外觀，B為香蕉假莖縱切面;圖10為致病性鑒定結(jié)果中不同維管束褐變的程度。
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，這些實(shí)施例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。
[0012]實(shí)施例1采用以下步驟實(shí)現(xiàn)本發(fā)明:
1、致病性鑒定試驗(yàn):
(I)致病菌的培養(yǎng)及孢子懸浮液的制備:將香蕉枯萎病病原菌接種在I3DA培養(yǎng)基上，28°C恒溫箱中培養(yǎng)6天;刮取培養(yǎng)物，用無菌水配制成濃度I X 105CFU/mL孢子懸浮液，備用； (2)用具的消毒及滅菌:取厚度2mm的PU海綿，剪成A4紙規(guī)格的長方形，如圖1所示，將海綿滅菌，獲得無菌海綿;準(zhǔn)備規(guī)格為16X40cm的帶蓋塑料箱，表面消毒，備用，如圖2所示；
(3)香蕉假莖切段:將新鮮香蕉假莖表面消毒，然后用無菌刀切成長度5cm的香蕉假莖段，如圖3所示；
(4)接種:將無菌海綿浸入步驟(I)制備的孢子懸浮液中，使得海綿充分吸收孢子懸浮液，然后取出海綿，將海綿平鋪在步驟(2)經(jīng)消毒的塑料箱底部，然后將步驟(3)的香蕉假莖段底部切面朝下至于塑料箱中的海綿上，如圖4所示;再取另一張吸收了孢子懸浮液的無菌海綿覆蓋在香蕉假莖段的頂部，如圖5所示；
(5)培養(yǎng):合上塑料箱蓋，，如圖6所示，將塑料箱放置在30°C的室內(nèi)環(huán)境中培養(yǎng)6天，培養(yǎng)結(jié)果如圖7所不；
2、對(duì)照試驗(yàn):按照步驟I中的步驟(I)-(5)的方法，以無菌水作為對(duì)照，將無菌海綿浸入等量無菌水中，進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)；
3、致病性觀察:培養(yǎng)結(jié)束后，打開塑料箱蓋，移開覆蓋在香蕉假莖段頂部的海綿，觀察香蕉假莖的維管束變褐，則說明該待測病原菌具有致病性;對(duì)比香蕉假莖的維管束變褐程度來判斷該待測病原菌致病性的強(qiáng)弱。
[0013]本實(shí)施例的致病性鑒定結(jié)果如圖8-10所示。圖8中A1-A3為對(duì)照試驗(yàn)鑒定結(jié)果，維管束無褐變，B1- B3為致病癥狀，維管束褐變腐爛；圖9為致病性鑒定結(jié)果，其中A為香蕉假莖的外觀，B為香蕉假莖縱切面；圖10為不同維管束褐變的程度，通過觀察褐變程度顯示目標(biāo)菌的致病程度。
[0014]經(jīng)多次試驗(yàn)驗(yàn)證表明，本發(fā)明方法數(shù)據(jù)穩(wěn)定好，重現(xiàn)性佳。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種香蕉枯萎病病原菌致病性的鑒定方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)致病菌的培養(yǎng)及孢子懸浮液的制備:將待測病菌接種在PDA培養(yǎng)基上，28°C恒溫箱中培養(yǎng)6天;刮取培養(yǎng)物，用無菌水配制成濃度I X 15CFlVmL孢子懸浮液，備用； (2)用具的消毒及滅菌:取厚度2mm的PU海綿，剪成A4紙規(guī)格的長方形，滅菌，獲得無菌海綿;準(zhǔn)備規(guī)格為16 X 40cm的帶蓋塑料箱，表面消毒，備用； (3)香蕉假莖切段:將新鮮香蕉假莖表面消毒，然后用無菌刀切成長度5cm的香蕉假莖段； (4)接種:將無菌海綿浸入步驟(I)制備的孢子懸浮液中，使得海綿充分吸收孢子懸浮液，然后取出海綿，將海綿平鋪在步驟(2)經(jīng)消毒的塑料箱底部，然后將步驟(3)的香蕉假莖段底部切面朝下至于塑料箱中的海綿上;再取另一張吸收了孢子懸浮液的無菌海綿覆蓋在香蕉假莖段的頂部； (5)培養(yǎng):合上塑料箱蓋，將塑料箱放置在28-30°C的室內(nèi)環(huán)境中培養(yǎng)6天； (6)致病性觀察與測量:培養(yǎng)結(jié)束后，打開塑料箱蓋，移開覆蓋在香蕉假莖段頂部的海綿，觀察到香蕉假莖的維管束變褐，則說明該待測病原菌具有致病性;對(duì)比香蕉假莖的維管束變褐程度來判斷該待測病原菌致病性的強(qiáng)弱； 所述待測病原菌為香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusarium oxysporiumf.sp.cubense Race 4)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定方法，其特征在于:所述待測病原菌為尖孢鐮刀菌古巴專Vc型XFusarium oxysporium f.sp.cubense Race 4)時(shí)，所述步驟用于尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusarium oxysporium f.sp.cubense Race 4)病原菌致病性鑒定。
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK105950699SQ201610522934
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年7月6日
【發(fā)明人】劉月廉, 呂慶芳, 林巧玲, 張德濤
【申請(qǐng)人】廣東海洋大學(xué)