一種與肺腺癌輔助診斷相關(guān)的血漿miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開一種與肺腺癌癌輔助診斷相關(guān)的血漿miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用，該標(biāo)志物為miR?19b?3p,miR?21?5p,miR?221?3p,miR?409?3p,miR?425?5p和miR?584?5p中的一種或多種。血漿miRNA作為新型的生物標(biāo)志物，具有穩(wěn)定性好、微創(chuàng)易獲取，靈敏性和特異性高的特點(diǎn)。這類分子標(biāo)志物的開發(fā)利用將為包括腫瘤在內(nèi)的各種疾病的診斷以及進(jìn)一步治療提供新的方向。本研究將更有針對性的得出具有臨床診斷潛能的肺腺癌血漿miRNA標(biāo)記物。研究證實(shí)了這組miRNA作為診斷肺腺癌的無創(chuàng)標(biāo)記物的可靠性以及可重復(fù)性。
【專利說明】
一種與肺腺癌輔助診斷相關(guān)的血漿mi RNA標(biāo)志物及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤學(xué)領(lǐng)域，涉及一種與肺腺癌輔助診斷相關(guān)的血漿 miRNA標(biāo)志物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌是世界上死亡率最高的一種惡性腫瘤，非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)占到了肺癌總數(shù)的80%。非小細(xì)胞肺癌根據(jù)病理分型又可以分為肺腺癌、肺 鱗癌等，且目前肺腺癌發(fā)病率已經(jīng)超過了肺鱗癌，成了最常見的肺癌類型。手術(shù)治療仍是目 前治療非小細(xì)胞肺癌的最有效方法。但是絕大部分患者在就診時已處于中晚期，使得中位 生存期始終徘徊在7-11個月，5年生存率只有17%左右。目前針對肺癌的分子和臨床特征的 研究不斷深入，臨床篩查和治療方法也有長足進(jìn)步，但是，這些方法或者過于依賴檢測者經(jīng) 驗(yàn)，或者價格太高無法推廣，或者檢測靈敏度和特異性還有待加強(qiáng)。因此，迫切需要開發(fā)新 的可靠的非侵入性早期診斷標(biāo)記物，促進(jìn)早期干預(yù)和治療，延長病人的生存期。
[0003] 微小RNA(Micro ribonucleic acids，miRNAs)的發(fā)現(xiàn)是最近這些年來重大發(fā)現(xiàn)之 一。成熟的miRNA是一類進(jìn)化保守，長度在18-25個核苷酸的小非編碼RNA分子。據(jù)研究， miRNA可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控機(jī)體1/3以上的基因，從而參與機(jī)體的眾多生理病理過程。miRNA 的表達(dá)具有時間特異性以及組織特異性。同時，一些miRNA能夠參與特定的生理病理以及特 異的疾病過程。因此，某些特異的miRNA可以作為某些生理病理以及某些疾病例如腫瘤等疾 病的標(biāo)志物。2008年，Mitchell在外周血中檢測到游離的miRNA，發(fā)現(xiàn)其能夠穩(wěn)定存在于外 周血，并且能夠作為診斷腫瘤的無創(chuàng)標(biāo)志物。這一研究發(fā)現(xiàn)拉開了全球眾多研究者開始探 索循環(huán)miRNA作為無創(chuàng)標(biāo)志物的大幕?，F(xiàn)有研究證實(shí)了循環(huán)miRNA在包括肺癌、胃癌、乳腺 癌、結(jié)直腸癌中的潛在診斷價值。最近的臨床試驗(yàn)顯示，對肺癌進(jìn)行精確的亞組分型能夠使 得患者獲得最大的治療益處并避免潛在的治療副反應(yīng)。這就是精準(zhǔn)醫(yī)療思想的體現(xiàn)。但目 前針對肺癌的循環(huán)miRNA研究，主要都是針對非小細(xì)胞肺癌這一含有眾多亞型的集合。研究 所選取的非小細(xì)胞肺癌亞型構(gòu)成的不同，都可能會引起結(jié)果的偏倚。
[0004] 因此，本研究將目光聚焦于肺癌最常見的亞型 肺腺癌，利用Exiqon miRNA qPCR panel芯片以及基于qRT-PCR的絕對定量法，來尋找具有潛在診斷肺腺癌的血漿 miRNA。并對這些miRNA在肺癌組織中以及血衆(zhòng)外泌體中的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，以進(jìn)一步明確其 與肺腺癌的關(guān)系。若根據(jù)這類miRNA設(shè)計(jì)針對于肺腺癌的診斷試劑盒，將會推動我國肺腺癌 的診治水平，也為將來對肺癌的進(jìn)一步研究提供思路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種與肺腺癌輔助診斷相關(guān)的血衆(zhòng)miRNA標(biāo)志物。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述血衆(zhòng)miRNA標(biāo)志物及其引物在制備肺腺癌輔助診 斷試劑盒以及在制備治療肺腺癌的藥物中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的又一目的在于提供用于肺腺癌輔助診斷和治療的試劑盒及藥物。
[0008]本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] -種與肺腺癌輔助診斷相關(guān)的血衆(zhòng)miRNA標(biāo)志物，該標(biāo)志物為miR-19b-3p (ugugcaaauccaugcaaaacuga)，miR-21-5p(uagcuuaucagacugauguuga)，miR-221-3p (agcuacauugucugcuggguuuc)，miR-409-3p(gaauguugcucggugaaccccu)，miR-425-5p (aaugacacgaucacucccguuga)和 miR-584_5p(uuaugguuugccugggacugag)中的一種或多種。 該血衆(zhòng) miRNA 標(biāo)志物優(yōu)選為 miR-19b-3p，miR-21-5p，miR-221-3p，miR-409-3p，miR-425-5p 和miR-584-5p中兩種或兩以上的組合，進(jìn)一步優(yōu)選為miR-19b-3p，miR-21-5p，miR-221-3p， miR-409-3p，miR-425-5p 和 miR-584-5p 六種 miRNA 所組成的組合。
[0010] 上述的血衆(zhòng)miRNA標(biāo)志物在輔助診斷肺腺癌中的應(yīng)用。
[0011] 上述的血楽;miRNA標(biāo)志物在制備肺腺癌輔助診斷試劑盒或治療肺腺癌藥物中的應(yīng) 用。
[0012] -種與肺腺癌輔助診斷相關(guān)的血衆(zhòng)miRNA標(biāo)志物的引物，該引物包含miR-19b-3p， miR-21-5p，miR-221-3p，miR-409-3p，miR-425-5p 和 miR-584-5p 中的一種或多種 miRNA 的引 物；優(yōu)選為包含血衆(zhòng) miRNA 中 miR-19b-3p，miR-21-5p，miR-221-3p，miR-409-3p，miR-425-5p 和miR-584-5p中兩種或兩以上miRNA的引物;進(jìn)一步優(yōu)選為包含血衆(zhòng)miRNA中miR-19b-3p， miR-21-5p，miR-221-3p，miR-409-3p，miR-425-5p和 miR-584-5p 六種 miRNA的引物。
[0013] 上述的引物在輔助診斷肺腺癌或制備肺腺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0014] 一種肺腺癌輔助診斷試劑盒，該試劑盒中含有血漿miRNA *miR-19b-3p，miR-21-5p，miR-221-3p，miR-409-3p，miR-425-5p 和 miR-584-5p 中的一種或多種 miRNA的引物；優(yōu)選 為含有血衆(zhòng) miRNA 中 miR-19b-3p，miR-21-5p，miR-221-3p，miR-409-3p，miR-425-5p 和 miR-584-5p中兩種或兩種以上miRNA的引物;進(jìn)一步優(yōu)選為含有血漿miRNA *miR-19b-3p，miR-21-5p，miR-221-3p，miR-409-3p，miR-425-5p和 miR-584-5p 六種 miRNA的引物。
[0015] 該試劑盒中還包括PCR技術(shù)常用的試劑和免疫組化技術(shù)常用的試劑。
[0016] 該試劑盒還可以包括PCR反應(yīng)常用試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液，dNTPs，MgCl2，DEPC 水和Taq酶等;還可以含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?br>[0017] 本發(fā)明所涉及的與肺腺癌診斷相關(guān)的血衆(zhòng)miRNA標(biāo)志物miR-19b-3p，miR-21-5p, miR-221-3p,miR-409-3p，miR-425-5p 和 miR-584-5p 中的每種 miRNA 的序列均已公開，但是 將各miRNA標(biāo)志物進(jìn)行組合作為肺腺癌輔助診斷標(biāo)志物需要本領(lǐng)域技術(shù)人員付出創(chuàng)造性勞 動。各miRNA標(biāo)志物的擴(kuò)增引物均可通過市場購買獲得，本發(fā)明實(shí)施例中使用的血漿miRNA 標(biāo)志物的引物為購自廣州銳博公司所合成生產(chǎn)的特異性miRNA莖環(huán)RT-PCR引物。
[0018] 具體地說，本發(fā)明解決問題的技術(shù)方案包括：（1)建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本庫和數(shù)據(jù) 庫：以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(S0P)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床資 料。（2)血衆(zhòng)miRNA差異表達(dá)譜分析:分析肺腺癌和正常對照人群中差異表達(dá)的血衆(zhòng)miRNA， 并對差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行進(jìn)一步大樣本多階段驗(yàn)證。（3)通過多階段的驗(yàn)證，明確這些 miRNA診斷肺腺癌的能力。（4)血衆(zhòng)miRNA診斷試劑盒的研制:根據(jù)肺腺癌與正常人群血衆(zhòng)中 的差異表達(dá)miRNA開發(fā)miRNAs診斷試劑盒，實(shí)現(xiàn)對肺腺癌患者的無創(chuàng)輔助診斷。（4)分析這 些m i RNA在肺腺癌組織、動脈血楽;以及外泌體中的表達(dá)情況，揭示這些m i RNA與肺腺癌的關(guān) 系，為將來研制可能與這些miRNA相關(guān)的治療肺腺癌的藥物提供依據(jù)。
[0019] 本發(fā)明人以標(biāo)準(zhǔn)操作程序(S0P)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口 學(xué)資料、臨床資料，并采用了Exiqon miRNA qPCR panel芯片以及qRT-PCR方法等。
[0020] 具體來說研究的實(shí)驗(yàn)方法主要包括以下幾個部分：
[0021] 1.研究樣本選擇:初治、未行手術(shù)以及放化療干預(yù)且之后經(jīng)病理確認(rèn)為肺腺癌的 病人。正常對照為在醫(yī)院進(jìn)行體檢的正常人群。
[0022] 2.Exiqon miRNA qPCR panel芯片初篩：利用TRIZ0L-LS試劑對血漿混合樣本進(jìn)行 RNA提取，并進(jìn)行qRT-PCR操作獲得初篩結(jié)果。
[0023] 3.訓(xùn)練集、驗(yàn)證集以及額外驗(yàn)證集:利用AM1556試劑盒(ABI公司）對每個血漿樣本 進(jìn)行RNA提取，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品，加入PCR引物和SYBR Green熒光染料進(jìn)行PCR 反應(yīng)。通過比對標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值，得出樣本中的miRNA含量。
[0024] 4.利用TRIZ0L-LS試劑提取肺腺癌和癌旁組織中的RNA，ExoQuick試劑盒（SBI公 司）和AM1556試劑盒(ABI公司）提取外泌體中的RNA，通過qRT-PCR的方法，檢測miRNA在組織 中、動靜脈血漿以及外泌體中的表達(dá)差異。
[0025] 5.統(tǒng)計(jì)分析:運(yùn)用X2檢驗(yàn)、配對t檢驗(yàn)以及非參數(shù)秩和檢驗(yàn)比較miRNA表達(dá)水平在 不同研究組中的差異。通過計(jì)算風(fēng)險值和R0C曲線分析證實(shí)血衆(zhòng)miRNA的診斷價值。
[0026]本發(fā)明研究組目前通過對肺腺癌病人的外周血漿中的miRNA進(jìn)行系統(tǒng)的表達(dá)分 析，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)了一組6個具有臨床診斷潛能的肺腺癌血衆(zhòng)microRNA標(biāo)記物(miR-19b-3p， miR-21-5p，miR-221-3p，miR-409-3p，miR-425-5p and miR-584_5p)。
[0027] 本發(fā)明的有益效果：
[0028] 1.相較于傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物，血漿miRNA作為新型的生物標(biāo)志物，具有穩(wěn)定性好、 微創(chuàng)易獲取，靈敏性和特異性高的特點(diǎn)。這類分子標(biāo)志物的開發(fā)利用將為包括腫瘤在內(nèi)的 各種疾病的診斷以及進(jìn)一步治療提供新的方向。
[0029] 2.相較于以前的研究，本研究將目光聚焦于肺癌最常見的亞型，即肺腺癌，而不是 針對整個肺癌或者非小細(xì)胞肺癌這一眾多肺癌亞型的合集。本研究將更有針對性的得出具 有臨床診斷潛能的肺腺癌血衆(zhòng)miRNA標(biāo)記物。
[0030] 3.研究者通過Exiqon miRNA qPCR panel芯片以及基于qRT-PCR的絕對定量法，對 肺腺癌和正常對照人群血漿中的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行嚴(yán)密、多階段的驗(yàn)證和評價。證實(shí)了這 組miRNA作為診斷肺腺癌的無創(chuàng)標(biāo)記物的可靠性以及可重復(fù)性。
[0031] 4.研究者發(fā)現(xiàn)了血漿中的miR-19b-3p及miR-425-5p在EGFR DelE746-A7750的患 者中要比EGFR野生型的患者中表達(dá)高，提示潛在的指示EGFR突變的作用以及將來可能用于 EGFR突變的相關(guān)治療作用。
[0032] 5.研究者發(fā)現(xiàn)除miR-584-5p外，其余5個miRNA在肺癌組織中的表達(dá)均與血漿中表 達(dá)一致，顯示了這組miRNA與肺癌之間的緊密關(guān)系。同時miR-19b-3p，miR-21-5p和miR-221-3p在血漿外泌體中的表達(dá)也是高于正常對照的。研究組還發(fā)現(xiàn)miR-19b-3p在動脈血中較靜 脈血中高表達(dá)。這些結(jié)果將給未來研究這些miRNA對于肺腺癌的機(jī)制以及針對這些miRNA對 于肺腺癌的治療提供新的思路。
【附圖說明】
[0033]圖1:實(shí)驗(yàn)流程圖
[0034] 圖2:在肺腺癌血漿中高表達(dá)的6個miRNA
[0035]圖3:對所獲得的miRNA進(jìn)行ROC曲線分析。
[0036] A:訓(xùn)練集與驗(yàn)證集的合集;B:訓(xùn)練集;C:驗(yàn)證集;D:外部驗(yàn)證集。
[0037] 圖4:miR-19b-3p及miR-425-5p在EGFR突變的患者中的表達(dá)情況。
[0038] 圖5:6個miRNA在肺腺癌組織中的表達(dá)情況
[0039] 圖6:6個miRNA在肺腺癌患者動靜脈血漿中的表達(dá)情況
【具體實(shí)施方式】
[0040] 發(fā)明人于2012年至2014年從南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收集了大量的肺腺癌患 者和正常體檢人群的靜脈血漿樣品，通過對樣品資料的整理，從中選擇了 141例肺腺癌和 124例正常對照的樣本作為Exiqon miRNA qPCR panel芯片初篩和后續(xù)一系列qRT-PCR驗(yàn)證 的實(shí)驗(yàn)樣品。同時還留取了 19對肺腺癌和癌旁組織，以及5例動脈血漿樣本。所選擇的患者 血漿樣本均來自于初治、未行手術(shù)以及放化療干預(yù)且之后經(jīng)病理確認(rèn)為肺腺癌的病人。并 系統(tǒng)采集了這些樣本的人口學(xué)資料、臨床資料。
[0041]參照流程圖（圖1)，從肺腺癌以及正常對照血漿樣本中隨機(jī)選擇了30例肺腺癌樣 本以及10例正常對照，并且分別混合成了 3例肺腺癌血漿混合樣本和1個正?；旌蠘颖?一 個混合樣本由10例200ul血漿樣本匯合形成2ml的樣本）。對這4例混合樣本進(jìn)行Exiqon miRNA qPCR panel芯片初篩和分析，具體步驟參照Exiqon miRNA qPCR panel芯片的說明 書：
[0042] 1.血漿抽提
[0043] 取出血漿樣品，樣品化凍后3000x g離心5min去除一些碎片及一些不溶成分。轉(zhuǎn)移 上清至新的1.5ml管中，加入750ul TRIZ0L-LS后，劇烈震蕩5s。
[0044] 2.兩相分離
[0045] 勻漿后樣品于15到30°C孵育5分鐘。每lml的TRIZ0L-LS試劑勻漿的樣品中加入 0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30°C孵育2到3分鐘。4°C下13,000g 離心15分鐘。
[0046] 3.RNA 沉淀
[0047] 將水相轉(zhuǎn)移到新離心管中。水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入異丙醇的量 為:每個樣品勻漿時加入lml TRIZ0L-LS試劑的同時加0.5ml的異丙醇和5ul的糖元。4°C靜 置半小時，讓RNA盡可能的析出。于4 °C 13，000g離心15分鐘。
[0048] 4.RNA 清洗
[0049] 移去上清液，每lml TRIZ0L-LS試劑勻漿的樣品中加入至少lml的75%(v/v)乙醇， 清洗RNA沉淀。靜置10分鐘，然后4°C下10000g離心5分鐘。
[0050] 5.重新溶解RNA沉淀
[00511去除乙醇溶液，空氣中干燥RNA沉淀5-10分鐘，加入無 RNA酶的水用槍反復(fù)吹打幾 次，然后55到60°C孵育10分鐘。
[0052] 6.測量濃度：
[0053] 通常能得到~5yg RNA/50ml血清。
[0054] 7.cDNA 合成
[0055] (1)稀釋模板RNA:使用DEPC水將20 - 25ng模板RNA稀釋至14ul (終濃度為1.492 - 1.786ngAU)。
[0056] (2)準(zhǔn)備反應(yīng)液:將5 X Reaction Buffer以及DEPC水置于冰上溶解，并震蕩混勻。 Enzyme mix置于-20°C冰盒，使用前輕彈混勻后置于冰上。所有試劑均離心后使用。
[0057] (3)配置反應(yīng)液:配置下表中的反應(yīng)液
[0059] 總體積20
[0060] (4)混合并離心試劑:震蕩或者抽吸混勻反應(yīng)液后離心，以保證所有溶液徹底混合 均勻。
[0061] (5)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及熱失活:將反應(yīng)液于42°C溫育60分鐘后，于95°C溫育5分鐘以失 活逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0062] 8.Real-Time PCR
[0063] 試劑：
[0064] Nuclease free water(Exiqon)
[0065] SYBR?Green master mix(Exiqon)
[0066] CDNA 模板
[0067] R0X(Invitrogen)
[0068] miRNA PCR ARRAY(Exiqon)
[0069] 儀器：
[0070] ABI PRISM7900system(Applied Biosystems)
[0071] (1)準(zhǔn)備Real-time PCR試劑：將制備的cDNA模板，DEPC水和SYBR?Green master mix置于冰上溶解15-20分鐘。
[0072] (2)稀釋cDNA模板:將RT反應(yīng)獲得的cDNA模板用nuclease free water稀釋110倍 (例如，向反應(yīng)液中加入2l8〇ul nuclease free water)。
[0073] (3)混合所有反應(yīng)試劑：
[0074] A.將PCR板簡單離心后，移去封膜。
[0075] B.將110倍稀釋的cDNA模板與2XSYBR Green master mix按照 1:1混合。
[0076] C.倒置混勻反應(yīng)液并離心
[0077] D.將混合反應(yīng)液加入板中的每個孔
[0078] E.重新封好PCR板
[0079] (4)將PCR板簡單低溫離心
[0080] (5)Real_time PCR擴(kuò)增:根據(jù)下表中的反應(yīng)條件進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增和溶解 曲線分析。
[0081 ] Real-time PCR循環(huán)條件如下表：
[0083] 數(shù)據(jù)分析:采用Δ Δ Ct方法
[0084] 使用PCR儀器附帶的軟件進(jìn)行初步數(shù)據(jù)分析，獲得原始的Cq值(Cp或Ct，依儀器不 同名稱可能不同）。
[0085] 我們建議使用GenEx qPCR分析軟件(www.exiqon.com/mirna-pcr-analysis)對數(shù) 據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)和深入的數(shù)據(jù)分析。
[0086] a.計(jì)算每個處理組中的每個通路相關(guān)基因的ACt。
[0087] Δ Ct(group 1)=average Ct-average of HK genes'Ct for group 1array
[0088] Δ Ct(group 2)=average Ct-average of HK genes'Ct for group 2array
[0089] b.計(jì)算2個PCR Array(或兩組）中每個基因的Δ Δ Ct。
[0090] Δ ACt= ACt(組2)-ACt(組 1)
[0091] 備注:通常組1是對照，組2是實(shí)驗(yàn)組。
[0092] c.同過2-Δ ACt計(jì)算組2與組1對應(yīng)基因的表達(dá)差異。
[0093]在芯片初篩后，得到了如下表中的39個差異表達(dá)miRNA(3個肺腺癌血漿混合樣本 中相對于正常樣本都超過了 2倍差異）。接著我們通過對混合樣本中的40例樣本，采取逐一 驗(yàn)證的方法對這39個miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，得到了 14個差異表達(dá)miRNA(差異倍數(shù)大于1.5倍且P 值小于0.05)。
[0096] 對于初篩得到的14個差異表達(dá)miRNA，通過訓(xùn)練集、驗(yàn)證集以及額外驗(yàn)證集，采用 基于qRT-PCR的絕對定量法進(jìn)行驗(yàn)證，具體步驟為：
[0097] 1.血漿RNA提取:選用ABI公司血漿RNA提取試劑盒(AM1556)，參照試劑盒說明，每 個樣本吸取200ul進(jìn)行提取RNA，并最后用100ul DEPC水進(jìn)行溶解。
[0098] 2.CDNA 的制備：
[0099] 1)采用50yL反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)
[0101 ]以上反應(yīng)體系混勻，瞬時離心后，以下列程序進(jìn)行反應(yīng)：
[0103] 2)上述反應(yīng)之后再反應(yīng)體系中再加入如下反應(yīng)物
[0105] 3.qPCR
[0106] 1)采用5yL反應(yīng)體系，按以下比例進(jìn)行試驗(yàn)
[0108]反應(yīng)體系混勻，瞬時離心后，放置于實(shí)時定量PCR儀中，以下列程序進(jìn)行反應(yīng)：
[0110] 反應(yīng)結(jié)束后添加溶解曲線。
[0111] 數(shù)據(jù)分析:通過比對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品的ct值，匯成標(biāo)準(zhǔn)曲線后可以計(jì)算獲得每 個樣本中的miRNA的絕對濃度。利用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到了一組在訓(xùn)練集，驗(yàn) 證集中都一致于肺腺癌血衆(zhòng)中高表達(dá)的6個111丨1?祖:111丨1?-1913-3口，111丨1?-21-5口，111丨1?-221-3卩， miR-409-3p，miR-425-5p和miR-584-5p(在訓(xùn)練集，驗(yàn)證集中P值都小于0.05,圖2)。通過這6 個miRNA，可以計(jì)算每個樣本的風(fēng)險值RSF，具體步驟為：
[0112] 1.利用R0C曲線，計(jì)算每個miRNA區(qū)分肺腺癌以及正常對照的截?cái)嘀担?br>[0113] 2.若該樣本大于該截?cái)嘀祫t記為1，反之記為0;
[0114] 3.運(yùn)用公式風(fēng)險值 中所算得的樣本i相對的miRNAj的數(shù) ，. 值，Wj為該miRNA的單因素回歸系數(shù)。
[0115] 如圖3,這6個miRNA組成的分子標(biāo)志物能夠很好的區(qū)分肺腺癌患者和正常人群。額 外訓(xùn)練集則進(jìn)一步證實(shí)了結(jié)果的可靠性。
[0116] 研究組中共有46例肺腺癌患者進(jìn)行了臨床EGFR突變分析，其中20例為野生型，12 例為EGFR DelE746-A7750突變型，14例為L858R突變型。通過卡方檢驗(yàn)分析得出，miR-19b-3p及miR-425-5p在EGFR DelE746-A7750的患者中要比EGFR野生型的患者中表達(dá)高（圖4)。
[0117] 研究組之后進(jìn)一步檢測了這6個miRNA在肺腺癌組織、動脈血以及血漿中外泌體的 表達(dá)，肺腺癌組織提取RNA利用TRIZ0L，外泌體提取試劑盒為ExoQuick試劑盒（SBI公司）。 200ul血漿所提取出的外泌體用200ul DEPC水重懸后，利用AM1556試劑盒(ABI公司）對外泌 體RNA進(jìn)行提取，步驟同血漿RNA提取過程。
[0118] 運(yùn)用非參數(shù)檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，除miR-584-5p外，其余5個miRNA在肺腺癌組織中的表 達(dá)都要高于癌旁組織（圖5)。同時，通過配對t檢驗(yàn)分析，miR-19b-3p在肺腺癌患者的動脈血 中的含量要高于其在靜脈血中的含量（圖6)。11^1?-1%-3?，1^1?-21-5?和1^1?-221-3?在肺腺 癌血漿中外泌體中的表達(dá)較正常人群血漿外泌體中是呈高表達(dá)的(P〈〇. 05，見下表）。
[0120] 試劑盒包括一批血漿miRNA qRT-PCR引物，還可以有相應(yīng)PCR技術(shù)所需的常用試 劑，如:逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液，dNTPs，MgCl 2，DEPC水，熒光探針，RNA酶抑制劑，Taq酶等，可根據(jù) 具體采用的實(shí)驗(yàn)方法選用，這些常用試劑都是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，另外還可以有標(biāo)準(zhǔn) 品和對照（如定量標(biāo)化的正常人樣本等）。此試劑盒的價值在于只需要血漿而不需要其它組 織樣品，通過最精簡的熒光法檢測血漿樣本中miRNA的表達(dá)含量，來輔助診斷該樣本來源患 者的罹患肺腺癌的可能性。血楽BiRNA不僅穩(wěn)定，檢測方便，且定量精確，大大提高疾病診斷 的敏感性和特異性，因此將此試劑盒投入實(shí)踐，可以幫助指導(dǎo)診斷以及進(jìn)一步的個體化治 療。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種與肺腺癌輔助診斷相關(guān)的血衆(zhòng)miRNA標(biāo)志物，其特征在于該標(biāo)志物為11^1?-1%-3p，miR-21-5p，miR-221-3p，miR-409-3p，miR-425-5p 和 miR-584-5p 中的一種或多種。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的血漿mi RNA標(biāo)志物，其特征在于該血漿mi RNA標(biāo)志物為!^尺-19b-3p，miR-21-5p，miR-221-3p，miR-409-3p，miR-425-5p 和 miR-584-5p 中兩種或兩以上的 組合，優(yōu)選為 miR-19b-3p，miR-21-5p，miR-221-3p，miR-409-3p，miR-425-5p 和 miR-584-5p 六種miRNA所組成的組合。3. 權(quán)利要求1或2所述的血衆(zhòng)miRNA標(biāo)志物在輔助診斷肺腺癌中的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求1或2所述的血漿miRNA標(biāo)志物在制備肺腺癌輔助診斷試劑盒或治療肺腺癌 藥物中的應(yīng)用。5. -種與肺腺癌輔助診斷相關(guān)的血漿miRNA標(biāo)志物的引物，其特征在于該引物包含 miR-19b-3p，miR-21-5p，miR-221-3p，miR-409-3p，miR-425-5p 和 miR-584-5p 中的一種或多 種 miRNA的引物；優(yōu)選為包含血衆(zhòng) miRNA 中miR-19b-3p，miR-21-5p，miR-221-3p，miR-409-3p，miR-425-5p和miR-584-5p中兩種或兩以上miRNA的引物;進(jìn)一步優(yōu)選為包含血漿miRNA 中 miR-19b-3p，miR-21-5p，miR-221-3p，miR-409-3p，miR-425-5p 和 miR-584-5p 六種 miRNA 的引物。6. 權(quán)利要求5所述的引物在輔助診斷肺腺癌或制備肺腺癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。7. -種肺腺癌輔助診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒中含有血衆(zhòng)miRNA中miR-19b-3p， miR-21-5p，miR-221-3p，miR-409-3p，miR-425-5p 和 miR-584-5p 中的一種或多種 miRNA 的引 物；優(yōu)選為含有血衆(zhòng) miRNA 中 miR-19b-3p，miR-21-5p，miR-221-3p，miR-409-3p，miR-425-5p 和miR-584-5p中兩種或兩種以上miRNA的引物;進(jìn)一步優(yōu)選為含有血漿miRNA*miR-19b-3p，miR-21-5p，miR-221-3p，miR-409-3p，miR-425-5p和 miR-584-5p 六種 miRNA的引物。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒中還包括PCR技術(shù)常用的試 劑和免疫組化技術(shù)常用的試劑。
【文檔編號】C12N15/113GK105950753SQ201610431741
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月16日
【發(fā)明人】朱偉, 周鑫, 束永前, 劉平, 聞偉, 陳彥, 齊煉文, 單霞
【申請人】朱偉