長鏈非編碼rnaenst00000511346的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種長鏈非編碼RNA(long no?coding RNA,LncRNA)ENST00000511346的應(yīng)用，即用于制備預(yù)測人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的檢測試劑，特別是制備出實(shí)時(shí)熒光定量分析法預(yù)測人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的試劑盒。通過研究證實(shí)LncRNA ENST00000511346在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)處理后，ENST00000511346高表達(dá)，因此，將ENST00000511346的表達(dá)用于間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的預(yù)測，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和推廣性。
【專利說明】
長鏈非編碼RNAENST00000511346的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[00011 本發(fā)明涉及干細(xì)胞分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及長鏈非編碼RNA ENST00000511346 在制備預(yù)測人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化制劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一種具有自我復(fù)制能力和多向 分化潛能的成體干細(xì)胞，屬于非終末分化細(xì)胞，在體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、 軟骨、骨、肌肉、肌腱、神經(jīng)、肝、心肌、胰島辟田胞和內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷 凍保存后仍具有多向分化潛能，是一種理想的骨組織工程種子細(xì)胞。目前應(yīng)用最廣泛的骨 髓、脂肪、臍帶和臍帶血等來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，它們均具有多向分化潛能；而且易于獲得 及擴(kuò)增，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可為組織器官的修復(fù)和再生提 供所需的大量細(xì)胞;同時(shí)免疫原性低，不論是自體還是同種異源的間充質(zhì)干細(xì)胞，一般都不 會引起宿主的免疫反應(yīng)，還具有獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能。
[0003] 長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA, IncRNAs)，是一類大于200bp的不編碼蛋 白的RNA。隨著高通量測序技術(shù)的普及以及對LncRNAs的了解，人們發(fā)現(xiàn)LncRNAs在基因表達(dá) 調(diào)控中起著舉足輕重的作用。同樣在間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化的過程中，LncRNA也通過調(diào)控 相關(guān)基因的表達(dá)影響著分化的方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種LncRNA ENST0000051 1346的應(yīng)用。LncRNA ENST00000511346(N0NC0DE ID:N0NHSAT099313.2)定位于4號染色體，其表達(dá)情況能作為判 斷臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是否誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的依據(jù)，因此可以用于制備預(yù)測人臍帶來源 的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的制劑，更進(jìn)一步能夠提供一種性價(jià)比高，易于推廣應(yīng)用 的成骨效率評價(jià)的試劑盒。
[0005] 長鏈非編碼RNA ENST00000511346的應(yīng)用，用于制備預(yù)測人臍帶來源的間充質(zhì)干 細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化制劑，該長鏈非編碼RNA ENST00000511346的轉(zhuǎn)錄本序列如SEQ N0:1 所示。
[0006] 所述的預(yù)測人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化制劑包括檢測長鏈非編 碼RNA ENST00000511346表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑。
[0007] 所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性引物：
[0008] IncRNA ENST00000511346特異性正向引物：
[0009] 5，-CTTCAGTCTCCCAGGATCGT-3，；
[0010] IncRNA ENST00000511346特異性反向引物：
[0011] 5，-TCGAGAAACCGAACACTGATT-3，。
[0012] -種預(yù)測人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的試劑盒，該試劑盒包括：
[0013] IncRNA ENST00000511346特異性正向引物：
[0014] 5，-CTTCAGTCTCCCAGGATCGT-3，；
[0015] IncRNA ENST00000511346特異性反向引物：
[0016] 5，-TCGAGAAACCGAACACTGATT-3，。
[0017] 該試劑盒還包括：
[0018]內(nèi)參β-actin的特異性引物：
[0019] 正向引物5'-CCTATCGAGCATGGAGTGGT-3'
[0020] 反向引物5，-CTGAGGCATAGAGGGACAGC-3，
[0021] 內(nèi)參α-Tubulin的特異性引物：
[0022] 正向引物5，-CCTGATGTATGCCAAACGTG-3 '
[0023] 反向引物5，-TCCCTGTAAAAGCAGCACCT-3 '。
[0024]該試劑盒全套試劑包括：
[0025] (1)從誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞抽提總RNA所用試劑，包括Tr izol試劑，三氯甲烷，異丙 醇，無酶水；（2)以總RNA為模板將IncRNA ENST00000511346逆轉(zhuǎn)錄為cDNA所用試劑，包括逆 轉(zhuǎn)錄緩沖液，dNTP，RNA酶抑制劑，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及隨機(jī)引物；（3)將cDNA實(shí)時(shí)定量PCR所用 試劑，包括IncRNA ENST00000511346的特異性引物、實(shí)時(shí)熒光定量SYBR染料、無酶水。
[0026]本發(fā)明通過成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，處理1，2,3周后，提 取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析LncRNA ENST00000511346的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)： 誘導(dǎo)14天LncRNA ENST00000511346表達(dá)是未誘導(dǎo)的95倍左右，誘導(dǎo)后表達(dá)增高顯著，其它 經(jīng)典的成骨細(xì)胞分子11^461'如0 8丨60〇31〇；[11和0 8丨60卩0111：；[11也增加，但倍數(shù)不如]^11〇1?財(cái) ENST00000511346的表達(dá)增高顯著。據(jù)此，
【申請人】提出利用LncRNA ENST00000511346制備預(yù) 測人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化試劑。將LncRNA ENST00000511346用于預(yù)測 人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞是否向成骨細(xì)胞分化的方法：（1)收集成骨誘導(dǎo)后或未誘導(dǎo)的 人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，抽提總RNA; (2)以總RNA為模板將LncRNA ENST00000511346逆 轉(zhuǎn)錄為cDNA; (3)用LncRNA ENST00000511346特異性引物和內(nèi)參引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 擴(kuò)增獲得相對表達(dá)量，誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)的表達(dá)量差異明顯，可以作為是否成骨分化的預(yù)測試 劑。
[0027]利用本發(fā)明的試劑可以檢測LncRNA ENST00000511346在成骨誘導(dǎo)后的人臍帶來 源的間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)水平從而判斷是否成骨分化，為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化提 供了 IncRNA的分子標(biāo)志物，具有深遠(yuǎn)的實(shí)踐意義和推廣性。
[0028]以下結(jié)合【附圖說明】和【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
【附圖說明】
[0029] 圖1為實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析LncRNA ENST00000511346成骨誘導(dǎo)后或未誘導(dǎo)的人 臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)差異；雖然誘導(dǎo)21天的表達(dá)水平要低于誘導(dǎo)14天，可能是 由于其他基因或因子共同調(diào)控導(dǎo)致的，但是不論誘導(dǎo)時(shí)間的長短依舊能看出誘導(dǎo)后都要比 誘導(dǎo)前的表達(dá)水平明顯增高;該IncRNA ENST00000511346可作為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨 細(xì)胞分化標(biāo)志物；
[0030]圖2為成骨標(biāo)志物分子Osterix表達(dá)水平分析。
[0031] QC1205con代表用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)組；
[0032] QC1205diff代表用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)組。
【具體實(shí)施方式】
[0033]實(shí)施例1成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)1、2、3周和未誘導(dǎo)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中LncRNA ENST00000511346的檢測試劑盒
[0034] 1.異丙醇 100ml
[0035] 2 · Trizol 試劑 100ml
[0036] 3 ·三氯甲烷50ml
[0037] 4.1μΜ隨機(jī)逆轉(zhuǎn)錄引物50μ1
[0038] 5.無酶水 2ml
[0039] 6.10mM dNTP 100μΙ
[0040] 7·20〇υ/μ1 RNA 逆轉(zhuǎn)錄酶 50μ1
[0041] 8· 5 X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液lml
[0042] 9·4〇υ/μ1 RNA抑制劑 500μ1
[0043] 10.Premix Ex Taq 50μ1
[0044] ΙΙ.ΙΟμΜ IncRNA ENST00000511346特異性引物50μ1
[0045] 熒光定量PCR的特異性引物：
[0046] IncRNA ENST00000511346正向引物：
[0047] 5，-CTTCAGTCTCCCAGGATCGT-3，；
[0048] IncRNA ENST00000511346反向引物：
[0049] 5，-TCGAGAAACCGAACACTGATT-3，。
[0050] 12·10μΜ內(nèi)參對照引物各50μ1
[0051] 內(nèi)參β-actin的特異性引物：
[0052] 5 '-CCTATCGAGCATGGAGTGGT-3 '
[0053] 5 '-CTGAGGCATAGAGGGACAGC-3 '
[0054] 內(nèi)參α-Tubulin的特異性引物：
[0055] 5 '-CCTGATGTATGCCAAACGTG-3 '
[0056] 5 '-TCCCTGTAAAAGCAGCACCT-3 '。
[0057] 實(shí)施例2人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)后LncRNA ENST00000511346的檢測
[0058] (1)收集成骨誘導(dǎo)1，2,3周后和未誘導(dǎo)的人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，
[0059] 抽提總RNA:去盡誘導(dǎo)后的培養(yǎng)板中培養(yǎng)基，加入lml Trizol，在室溫下水
[0060] 平放置5min，使裂解液均勻分布于細(xì)胞表面，然后用移液槍吹打細(xì)胞使細(xì)胞
[0061]脫落;將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入200μ1三氯甲烷，蓋緊離心管管 [0062] 蓋，上下振蕩15秒，室溫靜置3分鐘，12,000g，4°C尚心15分鐘。取出尚心
[0063]管，樣品分為三層:淡色的上清水相、中間的白色層及粉紅色的下層有機(jī)相。
[0064] 小心吸取淡色上清水相移至另一離心管，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，
[0065] 室溫靜置10分鐘，然后12,000g，4°C離心10分鐘，在管底可見RNA沉淀。
[0066] 小心去除上清，緩慢沿管壁加入lmL75 %乙醇，輕輕混勻。12，000g，4°C離
[0067] 心10分鐘，小心吸盡上清。室溫干燥沉淀2~5分鐘，加入30~50yL的無
[0068] RNase水溶解RNA沉淀，分光光度計(jì)檢測RNA的濃度和質(zhì)量，0D260/280
[0069]比值在1 · 8-2 · 0之間，-70 °C保存。
[0070] (2)以總RNA為模板將LncRNA ENST00000511346逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;
[0071] 01igo(dT)18primer(100yM) ΙμL
[0072] Total RNA lyg
[0073] 無酶水 Total 12μ1
[0074] 逆轉(zhuǎn)錄第一步條件:62 °C 5分鐘
[0075] 5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μ1
[0076] dNTP(lOmM) 2μ1
[0077] RNA酶抑制劑(4〇υ/μ1) ΙμL
[0078] MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(20〇υ/μ1) ΙμL
[0079] 第一步產(chǎn)物12μ1
[0080] Total 20μ1
[0081 ] 逆轉(zhuǎn)錄第二步程序，42 °C 60分鐘，72 °C 5分鐘。
[0082] (3)用LncRNA ENST00000511346特異性引物和內(nèi)參引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR: ENST00000511346特異性引物DNA序列由Invitrogen公司合成。
[0083]先將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋5倍，混勻，20μ1反應(yīng)體系如下：
[0084] SYBR Premix 2 ΧΙΟμΙ
[0085] ENST00000511346或內(nèi)參引物 ΙμL
[0086] cDNA產(chǎn)物 0·5μ1
[0087] 無酶水Total 20μ1
[0088] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)95 °C 30秒，40個(gè)循環(huán)的95 °C 5秒，65 °C 30秒，72 °C 30秒，65~ 95°C，每0 · 05秒增加0 · 5°C。
[0089] IncRNA ENST00000511346特異性正向引物：5，-CTTCAGTCTCCCAGGATCGT-3'
[0090] IncRNA ENST00000511346特異性反向引物：5，-TCGAGAAACCGAACACTGATT-3'
[0091] 內(nèi)參β-actin的特異性引物：
[0092] 正向引物5，-CCTATCGAGCATGGAGTGGT-3 '
[0093] 反向引物5，-CTGAGGCATAGAGGGACAGC-3，
[0094] 內(nèi)參α-Tubulin的特異性引物：
[0095] 正向引物5，-CCTGATGTATGCCAAACGTG-3 '
[0096] 反向引物5，-TCCCTGTAAAAGCAGCACCT-3 '
[0097] (4)成骨誘導(dǎo)的測定:本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用相對定量的分析方法，β-actin和a-Tubulin 作為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)利用GraphPad Prism進(jìn)行分析。成功誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì) 胞分化后IncRNA ENST00000511346顯著上調(diào)，差異具有顯著性(p〈0.05)。
[0098] 以上研究表明，IncRNA ENST00000511346可作為臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分 化標(biāo)志物。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 長鏈非編碼RNAENST00000511346的應(yīng)用，其特征在于，用于制備預(yù)測人臍帶來源的 間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的制劑，該長鏈非編碼RNAENST00000511346的轉(zhuǎn)錄本序列如 SEQ NO: 1 所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，預(yù)測人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì) 胞分化的制劑包括檢測長鏈非編碼RNAENST00000511346表達(dá)量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試 劑。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑包括實(shí) 時(shí)熒光定量PCR的特異性引物： IncRNA ENST00000511346特異性正向引物： 5 '-CTTCAGTCTCCCAGGATCGT-3 '； IncRNA ENST00000511346特異性反向引物： 5 '-TCGAGAAACCGAACACTGATT-3，。4. 一種預(yù)測人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的試劑盒，其特征在于，該試 劑盒包括： IncRNA ENST00000511346特異性正向引物： 5 '-CTTCAGTCTCCCAGGATCGT-3 '； IncRNA ENST00000511346特異性反向引物： 5 '-TCGAGAAACCGAACACTGATT-3，。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的預(yù)測人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的試劑盒， 其特征在于，該試劑盒包括： 內(nèi)參β-actin的特異性引物： 正向引物5 ' -CCTATCGAGCATGGAGTGGT-3 ' 反向引物5 ' -CTGAGGCATAGAGGGACAGC-3 ' 內(nèi)參α-Tubulin的特異性引物： 正向引物5 ' -CCTGATGTATGCCAAACGTG-3 ' 反向引物5 '-TCCCTGTAAAAGCAGCACCT-3 '。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的預(yù)測人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的試劑 盒，其特征在于，該試劑盒包括： (1)從誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞抽提總RNA所用試劑，包括Trizol試劑，三氯甲烷，異丙醇， 無酶水；（2)以總RNA為模板將IncRNA ENST00000511346逆轉(zhuǎn)錄為cDNA所用試劑，包括逆轉(zhuǎn) 錄緩沖液，dNTP，RNA酶抑制劑，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及隨機(jī)引物；（3)將cDNA實(shí)時(shí)定量PCR所用試 劑，包括IncRNA ENST00000511346的特異性引物、實(shí)時(shí)熒光定量SYBR染料、無酶水。
【文檔編號】C12Q1/68GK105950754SQ201610435609
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月17日
【發(fā)明人】帥詞俊, 彭淑平, 高丹, 何世微, 鐘雁城, 熊煒
【申請人】中南大學(xué)