一種稻粒黑粉病抗性檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種稻粒黑粉病抗性檢測方法，本發(fā)明選育稻粒黑粉病抗性品種雜交種F1，并對雜交種F1通過分子標記得到抗稻粒黑粉病的基因位點，并確定稻粒黑粉病在第1號染色體上的位置。本發(fā)明涉及的稻粒黑粉病抗性檢測方法，通過檢測水稻品種第1號染色體上引物標記的帶型數據，評估其對稻粒黑粉病的抗性，大大提高抗稻粒黑粉病水稻的選擇效率。
【專利說明】
一種稻粒黑粉病抗性檢測方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種稻粒黑粉病抗性檢測方法，具體涉及在稻粒黑粉病抗性品種的1 號染色體上分子標記出稻粒黑粉病抗性基因的方法，屬于農業(yè)生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 水稻稻粒黑粉病又稱黑穗病、稻墨黑穗病、烏米谷等。分布在我國長江流域及以南 地區(qū)，主要發(fā)生在水稻揚花至乳熟期，只為害谷粒，每穗受害1?；驍盗Ｄ酥翑凳?，一般在 水稻近成熟時顯癥。水稻稻粒黑粉病是一種最典型的母本特殊病害，大田普通水稻及少感 病，但在雜交水稻制種田中，發(fā)病普遍而嚴重，一般損失10~20 %，甚至有些高達50%以上。 因此，對稻粒黑粉病的研究與防治成為雜交水稻制種領域的重要課題。
[0003] 現(xiàn)有技術防治稻粒黑粉病主要方法是利用化學藥劑，化學藥劑的使用不可避免地 對環(huán)境造成污染和破壞?，F(xiàn)有技術還有的通過在生產過程中改進栽培技術條件對稻粒黑粉 病進行防治的措施，但收效甚微。
[0004] 現(xiàn)有技術在水稻生產上對稻粒黑粉病的防治對策在一定程度上增加了水稻生產 的成本，并且加重了環(huán)境壓力。
[0005] 利用水稻品種抗性被認為是目前防治稻粒黑粉病最經濟、有效的手段。將栽培水 稻或野生稻中的稻粒黑粉病抗性基因轉育到主栽稻品種中，是獲得安全的稻粒黑粉病抗性 品種的最有效方法，但現(xiàn)有技術育種的進程緩慢且未有專門針對稻粒黑粉病抗體的育種方 法。

【發(fā)明內容】

[0006] 基于現(xiàn)有技術的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種稻粒黑粉病抗性檢測方法，選育 稻粒黑粉病抗性品種雜交種F1，并運用SSR分子標記從稻粒黑粉病抗性品種中在1號染色體 上標記出稻粒黑粉病抗性基因。
[0007] 具體步驟如下：
[0008] (1)雜交種F1的獲得：以稻粒黑粉病抗源中優(yōu)781為母本，稻粒黑粉病高感品種揚 稻6號為父本，二者正季播種，于實驗秧田，單株移栽，株行距為30 X 30cm; -般大田肥水和 病蟲草害管理，至植株正常生長到揚花期，將中優(yōu)781植株的稻穗浸入39~46°C的溫水中， 浸泡6~10分鐘后取出，自然冷卻30分鐘，剪去1/3穎殼及未開穎的小花，用紙袋將中優(yōu)781 植株的稻穗套好并作標記，待用。當揚稻6號植株進入開花期時，將揚稻6號植株上稻穗的花 藥均勻落到紙袋中中優(yōu)781植株稻穗的柱頭上，人工授粉完成后將紙袋繼續(xù)套好，等待雜交 稻穗的籽粒成熟，即獲得雜交種F1。
[0009] (2)雜交種F1的花藥愈傷誘導：雜交種F1正季播種，稻穗中部花藥位置占穎殼的1/ 2為標準取穗，取穗后用70 %乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整個稻穗，保持稻穗濕潤 放入冰箱中，在4°C下低溫預處理3天;剪去1/3穎殼及未開穎的小花，在85%的酒精中消毒 處理2~10分鐘，晾干后用剪開花藥上部，將花藥置于第一培養(yǎng)基中，進行誘導培養(yǎng)，在22~ 28°C下暗培養(yǎng)2~3天后，轉移至第二培養(yǎng)基中，于25~29°C、光周期16h75001x光照8h黑暗 下進行繼代培養(yǎng)，50天后將獲得的雜交種F1的花藥愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)出花培苗、育苗、移 植到大田，等待稻穗籽粒成熟，通過篩選即獲得稻粒黑粉病抗性品種。
[0010] 所述第一培養(yǎng)基的成分為:N6基礎培養(yǎng)基1900mg/L、甘氨酸2.0mg/L，煙酸0.5mg/ L，瓊脂7.5g/L;激動素 KT 2. Omg/L，山梨醇25g/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺500mg/L，丙氨酸 0 · 6mg/L，葉酸0 · 5mg/L，秋水仙堿 0 · 3mg/L; pH 值為6 · 0。
[0011]所述第二培養(yǎng)基的成分為:MS基本培養(yǎng)基1900mg/L、肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/ L，維生素 B1 0.4mg/L，維生素 B6 0.5mg/L，鹿糖25g/L，萘乙酸NAA 0.5mg/L，生物素 O.lmg/ L，甲基亞硝基脲0.8mg/L，調環(huán)酸鈣0.4mg/L，水解蛋白1. Og/L;以及濃度20 %的稻粒黑粉病 菌粗毒素提取液，pH值為6.0。
[0012] 所述稻粒黑粉病菌粗毒素提取液的制備方法為:將感染稻粒黑粉病水稻的穗頸部 剪下，清潔表面后置于濕潤培養(yǎng)皿中，在30°C條件下暗培養(yǎng)，在菌絲產生后加入營養(yǎng)瓊脂繼 續(xù)培養(yǎng)，得到菌株;將菌株接種到液體培養(yǎng)基中30 °C下?lián)u床培養(yǎng)30天，超聲振蕩15~60分 鐘、過濾、以500~1500rpm的速度離心5~10分鐘，得到的上清液即水稻細菌性基腐病菌粗 毒素。
[0013] (3)預處理:取新鮮水稻葉片加入液氮研磨成細粉，加入體積百分比2%的β-巰基 乙醇，震蕩，加入50mM的三(羥甲基）氨基甲烷Tris-HCl、30mM的乙二胺四乙酸EDTA、質量體 積百分比為2%的聚乙烯吡咯烷酮PVP以及質量體積百分比為5%的十六烷基三甲基溴化銨 CTAB，混合均勻，將混合物加熱到50~60 °C并保持該溫度，在水浴搖床上搖擺50~80min，將 混合物離心分散15~30min，提取上清液，在-20°C環(huán)境中沉淀120~480min，離心分散后棄 上清液得到DNA沉淀物。
[0014] 所述水稻葉片與β-巰基乙醇、1^8-!1(：1、？￥?、0^的質量體積比11^/^/^/^/^ 為1:1 ~5:1 ~5:3~8:8~12,優(yōu)選為1:3:3:5:10。
[0015] 所述兩次離心分散的速率為800~1600rpm，優(yōu)選為900rpm。
[0016] (4)SSR引物：用實驗室已有的大體平均分布于水稻12條染色體的296對SSR引物， 所述296對SSR引物含54對自行合成引物。
[0017] (5) PCR反應:PCR反應體系為：總體積為1 OyL，0.5yL 15mM的脫氧核糖核苷三磷酸 dNTP，1 · 2yLl0 X PCR buffer，上下游引物各 1 · 5yL，5U/yL的Taq酶0 · 2yL，補水至 10yL; PCR擴 增程序為：94°C預變性5min ;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共35個循環(huán)；最后 得到的PCR擴增產物4 °C保存lh。
[0018] (6)染色：向PCR擴增產物加入2yL上樣緩沖液，混合均勻后加入10%的聚丙烯酰胺 PAGE的點樣孔，恒壓180V電泳2~3h，PAGE在硝酸銀溶液和蒸餾水中銀染15min，在顯影液作 用下染色。
[0019] (7)檢測：根據定位群體各單株分子標記多態(tài)性檢測結果，并結合其抗性表型參 數，進行基因和分子標記位點的遺傳連鎖分析；檢測稻粒黑粉病的抗性數量性狀基因座 QTL，L0D值的閾值定為2.5~3.0，按P = 0.005的概率值檢測抗性QTL的數目及其在染色體上 的位置。
[0020]本發(fā)明涉及的一種稻粒黑粉病抗性檢測方法，以稻粒黑粉病抗源中優(yōu)781為母本， 稻粒黑粉病高感品種揚稻6號為父本，選育稻粒黑粉病抗性品種雜交種F1。通過對雜交種F1 通過花藥愈傷誘導培育的新品種進行分子標記得到抗稻粒黑粉病基因位點qRBSDV16,位于 第1號染色體分子標記RM6092與RM5501之間。本發(fā)明涉及的稻粒黑粉病抗性染色體的分子 標記方法，可以通過檢測某一品種第1號染色體上下游兩個引物標記的帶型數據，評估其對 稻粒黑粉病的抗性，大大提高抗稻粒黑粉病水稻的選擇效率。
[0021]本發(fā)明通過分子標記的方法對稻粒黑粉病的抗性進行評估，避免使用化學藥劑增 加水稻生產的成本且避免對環(huán)境造成污染和破壞，無需多世代重復雜交回交，縮短了育種 周期。
【附圖說明】
[0022]圖1為1號染色體上抗稻粒黑粉病基因位點qRBSDV16在染色體上的位置。
[0023] 圖2為1號染色體上抗稻粒黑粉病基因位點評估水稻品種對稻粒黑粉病的抗性的 電泳圖譜。M: Mark; 1:中優(yōu)781; 2:揚稻6號;3: F1; 4-11 :抗病單株;12-20:感病單株。
【具體實施方式】
[0024] 下面通過具體實施例，進一步對本發(fā)明的技術方案進行具體說明。應該理解，下面 的實施例只是作為具體說明，而不限制本發(fā)明的范圍，同時本領域的技術人員根據本發(fā)明 所做的顯而易見的改變和修飾也包含在本發(fā)明范圍之內。
[0025] 實施例1
[0026] (1)雜交種F1的獲得:正季收集來源于12個省份共189份水稻品種進行抗稻粒黑粉 病田間誘發(fā)鑒定，結果表明，不同省區(qū)水稻品種對稻粒黑粉病的抗性存在明顯差異，品種中 優(yōu)781稻粒黑粉病抗性較好，大田發(fā)病率僅有5 %，屬于高抗水平。以稻粒黑粉病抗源中優(yōu) 781為母本，稻粒黑粉病高感品種揚稻6號為父本，二者正季播種，于實驗秧田，單株移栽，株 行距為30 X 30cm; -般大田肥水和病蟲草害管理，至植株正常生長到揚花期，將中優(yōu)781植 株的稻穗浸入39~46°C的溫水中，浸泡6~10分鐘后取出，自然冷卻30分鐘，剪去1/3穎殼及 未開穎的小花，用紙袋將中優(yōu)781植株的稻穗套好并作標記，待用。當揚稻6號植株進入開花 期時，將揚稻6號植株上稻穗的花藥均勻落到紙袋中中優(yōu)781植株稻穗的柱頭上，人工授粉 完成后將紙袋繼續(xù)套好，等待雜交稻穗的籽粒成熟，即獲得雜交種F1。
[0027] (2)雜交種F1的花藥愈傷誘導：
[0028]雜交種F1正季播種，稻穗中部花藥位置占穎殼的1/2為標準取穗，取穗后用70%乙 醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整個稻穗，保持稻穗濕潤放入冰箱中，在4°C下低溫預處 理3天;剪去1/3穎殼及未開穎的小花，在85%的酒精中消毒處理2~10分鐘，晾干后用剪開 花藥上部，將花藥置于第一培養(yǎng)基中，進行誘導培養(yǎng)，在22~28°C下暗培養(yǎng)2~3天后，轉移 至第二培養(yǎng)基中，于25~29°C、光周期16h75001x光照8h黑暗下進行繼代培養(yǎng)，50天后將獲 得的雜交種F1的花藥愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)出花培苗、育苗、移植到大田，等待稻穗籽粒成熟， 通過篩選即獲得稻粒黑粉病抗性品種。
[0029] 所述第一培養(yǎng)基的成分為:N6基礎培養(yǎng)基1900mg/L、甘氨酸2.0mg/L，煙酸0.5mg/ L，瓊脂7.5g/L;激動素 KT 2. Omg/L，山梨醇25g/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺500mg/L，丙氨酸 0 · 6mg/L，葉酸0 · 5mg/L，秋水仙堿 0 · 3mg/L; pH 值為6 · 0。
[0030]所述第二培養(yǎng)基的成分為:MS基本培養(yǎng)基1900mg/L、肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/ L，維生素 B1 0.4mg/L，維生素 B6 0.5mg/L，鹿糖25g/L，萘乙酸NAA 0.5mg/L，生物素 O.lmg/ L，甲基亞硝基脲0.8mg/L，調環(huán)酸鈣0.4mg/L，水解蛋白1. Og/L;以及濃度20 %的稻粒黑粉病 菌粗毒素提取液，pH值為6.0。
[0031]所述稻粒黑粉病菌粗毒素提取液的制備方法為:將感染稻粒黑粉病水稻的穗頸部 剪下，清潔表面后置于濕潤培養(yǎng)皿中，在30°C條件下暗培養(yǎng)，在菌絲產生后加入營養(yǎng)瓊脂繼 續(xù)培養(yǎng)，得到菌株;將菌株接種到液體培養(yǎng)基中30 °C下?lián)u床培養(yǎng)30天，超聲振蕩15~60分 鐘、過濾、以500~1500rpm的速度離心5~10分鐘，得到的上清液即水稻細菌性基腐病菌粗 毒素。
[0032] (3)預處理:取新鮮水稻葉片加入液氮研磨成細粉，加入體積百分比2%的β-巰基 乙醇，震蕩，加入50mM的三(羥甲基）氨基甲烷Tris-HCl、30mM的乙二胺四乙酸EDTA、質量體 積百分比為2%的聚乙烯吡咯烷酮PVP以及質量體積百分比為5%的十六烷基三甲基溴化銨 CTAB，混合均勻，將混合物加熱到50~60 °C并保持該溫度，在水浴搖床上搖擺50~80min，將 混合物離心分散15~30min，提取上清液，在-20°C環(huán)境中沉淀120~480min，離心分散后棄 上清液得到DNA沉淀物。
[0033] 所述水稻葉片與β-巰基乙醇、 為1:3:3:5:10。
[0034] 所述兩次離心分散的速率為800~1600rpm。
[0035] (4)SSR引物：用實驗室已有的大體平均分布于水稻12條染色體的296對SSR引物， 所述296對SSR引物含54對自行合成引物。
[0036] (5)PCR反應:PCR反應體系為：總體積為10yL，0.5yL15mM的脫氧核糖核苷三磷酸 dNTP，1 · 2yLl0 X PCR buffer，上下游引物各 1 · 5yL，5U/yL的Taq酶0 · 2yL，補水至 10yL; PCR擴 增程序為：94°C預變性5min ;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共35個循環(huán)；最后 得到的PCR擴增產物4 °C保存lh。
[0037] (6)檢測:PCR擴增產物用10%的聚丙烯酰胺PAGE經硝酸銀染色后，再用NaOH顯色。
[0038]向PCR擴增產物加入2yL上樣緩沖液，混合均勻后加入PAGE的點樣孔，恒壓180V電 泳2~3h，PAGE在硝酸銀溶液和蒸餾水中銀染15min，在顯影液作用下染色。
[0039] (7)根據定位群體各單株分子標記多態(tài)性檢測結果，并結合其抗性表型參數，用 Mapmaker/Exp3.0軟件進行基因和分子標記位點的遺傳連鎖分析，利用Kosambi作圖函數將 交換率轉換為遺傳距離(CM)。
[0040] (8)采用基于復合區(qū)間作圖法軟件Windows QTL Cartographer V2.5檢測稻粒黑 粉病的抗性QTL，L0D值的閾值定為2.7，按P = 0.005概率值檢測抗性QTL的數目及其在染色 體上的位置。在1號染色體上檢測到1個稻粒黑粉病抗性QTL，L0D值為3.88,貢獻率為 17.9%，命名為qRBSDV16，位于第l號染色體分子標記RM6092:SEQIDN0.1/SEQIDN0.2與 分子標記RM5501:SEQ ID N0.3/SEQ ID N0.4之間（如圖1)。
[0041 ] (9)用第1號染色體分子標記RM6092引物：SEQ ID N0.1/SEQ ID勵.2，或者用第1 號染色體分子標記RM3133:SEQIDN0.3/SEQIDN0.4擴增稻粒黑粉病鑒定材料。如果用分 子標記RM6092引物：SEQ ID N0.1/SEQ ID勵.2能夠擴增出14仙？的擴增片段，或用分子標 記RM5501:SEQ ID N0.3/SEQ ID勵.4能夠擴增出135匕？的擴增片段，則標志著水稻材料內 存在抗稻粒黑粉病位點qRBSDV16(如圖2)，通過檢測第1號染色體上該兩個引物標記的帶型 數據，評估該植株對稻粒黑粉病的抗性。
【主權項】
1. 一種稻粒黑粉病抗性檢測方法，其特征在于:其步驟如下： (1) 雜交種Fl的獲得：以稻粒黑粉病抗源中優(yōu)781為母本，稻粒黑粉病高感品種揚稻6號 為父本，二者正季播種，于實驗秧田，單株移栽，株行距為30 X 30cm; -般大田肥水和病蟲草 害管理，至植株正常生長到揚花期，將中優(yōu)781植株的稻穗浸入39~46°C的溫水中，浸泡6~ 10分鐘后取出，自然冷卻30分鐘，剪去1/3穎殼及未開穎的小花，用紙袋將中優(yōu)781植株的稻 穗套好并作標記，待用；當揚稻6號植株進入開花期時，將揚稻6號植株上稻穗的花藥均勻落 到紙袋中中優(yōu)781植株稻穗的柱頭上，人工授粉完成后將紙袋繼續(xù)套好，等待雜交稻穗的籽 粒成熟，即獲得雜交種Fl; (2) 雜交種Fl的花藥愈傷誘導：雜交種Fl正季播種，稻穗中部花藥位置占穎殼的1/2為 標準取穗，取穗后用70 %乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整個稻穗，保持稻穗濕潤放入 冰箱中，在4°C下低溫預處理3天;剪去1/3穎殼及未開穎的小花，在85%的酒精中消毒處理2 ~10分鐘，晾干后用剪開花藥上部，將花藥置于第一培養(yǎng)基中，進行誘導培養(yǎng)，在22~28°C 下暗培養(yǎng)2~3天后，轉移至第二培養(yǎng)基中，于25~29 °C、光周期16h7500Ix光照8h黑暗下進 行繼代培養(yǎng)，50天后將獲得的雜交種Fl的花藥愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)出花培苗、育苗、移植到 大田，等待稻穗籽粒成熟，通過篩選即獲得稻粒黑粉病抗性品種； (3) 預處理:取新鮮水稻葉片加入液氮研磨成細粉，加入體積百分比2%的β-巰基乙醇， 震蕩，加入50mM的三(羥甲基)氨基甲烷Tr i s-HCl、30mM的乙二胺四乙酸EDTA、質量體積百分 比為2 %的聚乙烯吡咯烷酮PVP以及質量體積百分比為5 %的十六烷基三甲基溴化銨CTAB， 混合均勻，將混合物加熱到50~60 °C并保持該溫度，在水浴搖床上搖擺50~80min，將混合 物離心分散15~30min，提取上清液，在-20°C環(huán)境中沉淀120~480min，離心分散后棄上清 液得到DNA沉淀物； 所述水稻葉片與巰基乙醇、Tris-HCl、PVP、CTAB的質量體積比mgAiLAiLAiLAiL為1:1 ~5:1~5:3~8:8~12; 所述兩次離心分散的速率為800~1600rpm; (4) SSR引物：用實驗室已有的大體平均分布于水稻12條染色體的296對SSR引物，所述 296對SSR引物含54對自行合成引物； (5) PCR反應:PCR反應體系為：總體積為IOyL，0.5yL15mM的脫氧核糖核苷三磷酸dNTP， 1 · 2yL10 X PCR buffer，上下游引物各 1 · 5yL，5U/yL的Taq酶0 · 2yL，補水至IOyL; PCR擴增程 序為:94°C預變性5min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共35個循環(huán)；最后得到 的PCR擴增產物4°C保存Ih; (6) 染色：向PCR擴增產物加入2yL上樣緩沖液，混合均勻后加入10%的聚丙烯酰胺PAGE 的點樣孔，恒壓180V電泳2~3h，PAGE在硝酸銀溶液和蒸餾水中銀染15min，在顯影液作用下 染色； (7) 檢測：根據定位群體各單株分子標記多態(tài)性檢測結果，并結合其抗性表型參數，進 行基因和分子標記位點的遺傳連鎖分析;檢測稻粒黑粉病的抗性數量性狀基因座QTL，LOD 值的閾值定為2.5~3.0，按P = 0.00 5的概率值檢測抗性QTL的數目及其在染色體上的位置。2. 根據權利要求1所述的一種稻粒黑粉病抗性檢測方法，其特征在于:步驟(2)所述第 一培養(yǎng)基的成分為:N6基礎培養(yǎng)基1900mg/L、甘氨酸2. Omg/L，煙酸0.5mg/L，瓊脂7.5g/L;激 動素 KT2 · Omg/L，山梨醇25g/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺500mg/L，丙氨酸0 · 6mg/L，葉酸0 · 5mg/ L，秋水仙堿O · 3mg/L; pH值為6 · O。3. 根據權利要求1所述的一種稻粒黑粉病抗性檢測方法，其特征在于:步驟(2)所述第 二培養(yǎng)基的成分為：MS基本培養(yǎng)基1900mg/L、肌醇100mg/L，甘氨酸2 . Omg/L，維生素 BlO · 4mg/L，維生素 B60 · 5mg/L，蔗糖25g/L，萘乙酸NAAO · 5mg/L，生物素0 · lmg/L，甲基亞硝基 脲0.8mg/L，調環(huán)酸鈣0.4mg/L，水解蛋白1.0 g/L;以及濃度20 %的稻粒黑粉病菌粗毒素提取 液，pH值為6.0。4. 根據權利要求3所述的一種稻粒黑粉病抗性檢測方法，其特征在于:步驟(2)所述稻 粒黑粉病菌粗毒素提取液的制備方法為:將感染稻粒黑粉病水稻的穗頸部剪下，清潔表面 后置于濕潤培養(yǎng)皿中，在30°C條件下暗培養(yǎng)，在菌絲產生后加入營養(yǎng)瓊脂繼續(xù)培養(yǎng)，得到菌 株;將菌株接種到液體培養(yǎng)基中30 °C下?lián)u床培養(yǎng)30天，超聲振蕩15~60分鐘、過濾、以500~ 1500rpm的速度離心5~10分鐘，得到的上清液即水稻細菌性基腐病菌粗毒素。5. 根據權利要求1所述的一種稻粒黑粉病抗性檢測方法，其特征在于:步驟(3)所述水 稻葉片與β-巰基乙醇、Tris-HCl、PVP、CTAB的質量體積比mgAiLAiLAiLAiL為1:3:3:5:10; 所述兩次離心分散的速率為900rpm。
【文檔編號】A01H4/00GK105950763SQ201610495877
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月29日
【發(fā)明人】許建中, 孟劍華, 安劍石
【申請人】無錫南理工科技發(fā)展有限公司