一種用于檢測hla-b*5801等位基因的引物組及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于檢測HLA?B*5801等位基因的PCR擴增引物組和Taqman探針,包含兩對根據(jù)HLA?B*5801特異性序列設計的引物及相應兩條探針，還包含一對用于篩除HLA?B*5801假陽性的引物及相應一條探針，還包含一對內(nèi)對照引物及相應一條探針。本發(fā)明具有如下技術(shù)效果：通過兩個反應管確定實驗樣本HLA?B*5801基因陽性與否，通過一個反應管排除HLA?B*5801基因的假陽性結(jié)果，通過每個反應孔添加的內(nèi)對照引物及探針排除樣本HLA?B*5801基因的假陰性結(jié)果。
【專利說明】
一種用于檢測HLA-B*5801等位基因的引物組及試劑盒
技術(shù)領域
[0001]本發(fā)明涉及用于檢測HLA-B*5801等位基因的方法和試劑盒，屬于生物醫(yī)學臨床分 子檢測領域。
【背景技術(shù)】
[0002] 藥物基因組學(pharmacogenomics)又稱為基因組藥物學或基因組藥理學，是藥理 學的一個分支，定義為在基因組學的基礎上，通過將基因表達或單核苷酸的多態(tài)性與藥物 的療效或毒性聯(lián)系起來，研究藥物如何由于遺傳變異而產(chǎn)生不同的作用。簡而言之，藥物基 因組學致力于研究個體基因結(jié)構(gòu)對藥物反應的影響，發(fā)現(xiàn)關(guān)聯(lián)基因及其作用機制和功能， 并應用于臨床疾病診斷和確定給藥劑量?；蜓芯抠Y料與臨床實踐結(jié)合可有助于更精確的 掌握病人概況，選擇最優(yōu)化治療方案，進一步幫助對易發(fā)生藥品不良反應(Adverse Drug Reacti〇nS，ADRS)病人的鑒別。大量基因?qū)W研究數(shù)據(jù)現(xiàn)已運用于藥物反應和疾病易感性的 預測，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)已公布百余種藥物與特異性基因的相關(guān)性資料，其中 一些基因檢測已在世界范圍內(nèi)應用于常規(guī)臨床診治。例如，美國FDA批準對擬采用易瑞沙 (Gefitinib)、特羅凱（Erlotinib)等表面生長因子受體（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)_酪氨酸激酶抑制劑(TKI)類腫瘤靶向治療藥物的患者，進行EGFR酪氨酸激 酶基因突變檢測;細胞色素 P450 2D6(CYP2D6)基因突變檢測也被包含在多種抗精神病藥物 的標簽上。
[0003] ADR是指在按規(guī)定劑量正常應用藥品的過程中產(chǎn)生的與治療無關(guān)的作用，而這種 作用一般是有害的，且與藥品應用有因果關(guān)系，可表現(xiàn)出多種臨床癥狀和體征，并可由多種 結(jié)構(gòu)不同的化合物引發(fā)。過敏反應由于其癥狀嚴重性、高入院率和高死亡率已成為國家醫(yī) 藥衛(wèi)生系統(tǒng)的負擔，并成為ADR中受主要關(guān)注的一種。藥物過敏反應可表現(xiàn)為輕型斑丘疹爆 發(fā)(Maculopapular Eruption，MPE)，也可表現(xiàn)為更加危險甚至致命的重癥皮膚不良反應 (Severe Cutaneous Adverse Reactions, SCAR)，包括史蒂芬瓊森癥候群（Stevens Johnson Syndrome，SJS)、毒性表皮壞死松懈癥（Toxic Epidermal Necrolysis，TEN)和過 敏反應綜合征(Hypersensitivity Syndrome，HSS) JPE主要表現(xiàn)為細小的粉色斑丘疹，并 可在停止用藥后1-2周消退。HSS表現(xiàn)為多器官綜合征，除發(fā)生皮疹外，伴有多系統(tǒng)損害，如 發(fā)熱、關(guān)節(jié)痛、嗜酸性粒細胞增多和淋巴結(jié)病變;SJS以發(fā)熱、乏力、迅速進展的泡狀斑疹和 粘膜病變?yōu)樘卣?TEN的癥狀與SJS相似，但更為嚴重，死亡率更高。雖然SJS/TEN的發(fā)病率極 低，每年大約有1，〇〇〇，〇〇〇分之〇. 4至6個個案，但其死亡率高達5-50 %，并且存活的SJS/TEN 患者約有30-70%患有嚴重后遺癥。SJS/TEN可由病毒感染、肺炎霉?jié){菌感染、遺傳等多種因 素引起，但最常見的起因為藥物治療，約占80 %。SCAR的發(fā)病機制尚不清楚，普遍認為是多 因素的，包括遺傳因素。同時，以往的研究證明免疫機制在多種ADR的進展中發(fā)揮著重要作 用。因此，基因變異在高度多態(tài)性的人類白細胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)系統(tǒng) 中的作用引起了研究者的高度關(guān)注。
[0004] HLA位于人類6號染色體短臂的21.31區(qū)，約含360萬個堿基對，是目前已知的人類 染色體中基因密度最高、多態(tài)性最豐富的區(qū)域，分為HLA-I、Π 和m類基因。經(jīng)典的HLA-I類 基因包括HLA-A、HLA-B和HLA-C三類，經(jīng)典的Π 類基因一般指DR、DP和DQ，HLA-ΙΠ 類基因與前 兩類不同，除包含腫瘤壞死因子（Tumour Necrosis Factor，TNF)基因、淋巴毒素 α (lymphotoxin alpha，LTA)基因、熱休克蛋白基因等具有免疫相關(guān)功能的基因外，還包括許 多非免疫相關(guān)基因。其中，HLA-B是人類基因組中最具多態(tài)性的區(qū)域，包含超過1600個等位 基因。研究報道，HLA與多種疾病密切相關(guān)，如強直性脊柱炎、貝賽特氏癥、乳糜瀉等。近年 來，HLA在藥物基因組學研究中的重要作用引起廣泛關(guān)注，國內(nèi)外多個課題組通過對臨床病 例的基因檢測，發(fā)現(xiàn)特定的HLA等位基因與多種藥物過敏反應高度相關(guān)。其中，最典型的應 用為美國FDA明確建議亞裔病人在服用卡馬西平(carbamazepine)前進行HLA*B5801基因檢 測。此外，阿巴卡韋(abacavir)、別噪呤醇(allopurinol)等引起的SCAR與特異性HLA等位基 因的密切關(guān)系也得到明確報道。
[0005] 別嘌呤醇是一種黃嘌呤氧化酶抑制劑，自1963年以來，被廣泛應用于痛風、高尿酸 血癥及其并發(fā)癥的治療，其價格便宜，方便給藥，既可治療尿酸鹽產(chǎn)生過剩，又可治療尿酸 鹽排泄下降，成為臨床治療的首選藥物。然而，別嘌呤醇也是引起cADRs的最常見因素之一， 占 SCAR病例的5%。別噪呤醇所致cADRs范圍廣泛，嚴重程度從MPE到SCAR不一，SCAR雖然罕 見，但死亡率高達26 %。在臺灣、香港和上海進行的研究發(fā)現(xiàn)，HLA*B5801基因陽性的漢族人 群服用別嘌呤醇可導致SJS/TEN，對HLA*B5801的基因?qū)W檢測將具有重要前瞻性意義，可能 降低別嘌呤醇所致SCAR的發(fā)病率。此外，在泰國、日本、馬來西亞等亞洲人群中均確認了 HLA*B5801與別嘌呤醇所致SJS/TEN間的高度相關(guān)性。
[0006] 由此可見，快速而準確地檢測HLA*B5801等位基因?qū)εR床個體化治療、醫(yī)學研究及 新藥開發(fā)和評價具有重要意義。目前國內(nèi)市場上常用的上述基因檢測方法主要有PCR-SSP 法、PCR-SS0P法、SYBR Green I及Taqman熒光定量PCR法等。PCR_SSP(sequence specific primer)即序列特異引物引導的PCR反應，是目前被廣泛采用的檢測方法，其基本方法是設 計一系列等位基因型特異性引物，通過特定PCR反應體系擴增各等位基因型特異性DNA片 段，產(chǎn)生相對應的特異性擴增產(chǎn)物條帶，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，此方法成本低， 但操作復雜，無法自動獲取結(jié)果，準確度也有待提高。PCR-SS0P即多聚酶鏈反應寡聚核苷酸 探針雜交，先采用位點特異性引物對HLA-B位點進行擴增，擴增產(chǎn)物包括HLA-B位點的所有 等位基因序列，再根據(jù)堿基互補原則，將PCR產(chǎn)物經(jīng)化學變性解鏈后，單鏈與固化在2條尼龍 膜上的序列特異寡核苷酸探針在特定條件下雜交，經(jīng)洗膜，加入標記有堿性磷酸鹽的抗生 物蛋白鏈菌素與生物素及底物反應，對擴增片段進行分析鑒定。SS0P反向雜交法操作繁瑣， 耗時長，需嚴格控制實驗條件，否則會導致錯配，影響結(jié)果準確性。熒光定量PCR的基本原理 是在反應體系中加入熒光分子，通過熒光信號的按比例增加來反應DNA量的增加，從而對 PCR產(chǎn)物進行實時檢測。SYBR GreenI是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色 激發(fā)波長的染料，其與DNA的結(jié)合是非特異性的，此方法雖然操作簡便、快速，但缺乏特異 性，準確性差。Taqman熒光定量PCR法克服了以上不足，操作簡便、快速，特異性高，并可實現(xiàn) 高通量檢測。一般來講，Taqman熒光定量PCR法通過設計一對或多對HLA_B*5801特異性引物 及相應探針，進行PCR擴增，考慮到HLA多態(tài)性非常高，結(jié)果易出現(xiàn)假陽性，從而影響其準確 性。因此，本領域急需一種操作簡便、快速，且準確度高的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種用于檢測HLA-B*5801等位基 因的方法和試劑盒。
[0008] 本發(fā)明的用于檢測HLA-B*5801等位基因的PCR擴增引物組和Taqman探針，包含兩 對根據(jù)HLA-B*5801特異性序列設計的引物及相應兩條探針，序列如下：
[0010] 所述的PCR擴增引物組和Taqman探針還包含一對用于篩除HLA_B*5801假陽性的引 物及相應一條探針，序列如下：
[0012] 所述的PCR擴增引物組和Taqman探針還包含一對內(nèi)對照引物及相應一條探針，用 于監(jiān)控儀器故障、試劑因素、聚合酶活性或樣本中的抑制物等因素造成的假陰性結(jié)果，序列 如下：
[0014] 所述的Taqman探針5'端的報告基團為FAM、HEX或VIC，3'端的淬滅基團為BHQ-1。 [0015] 本發(fā)明提供了上述PCR擴增引物組和Taqman探針在制備檢測HLA_B*5801等位基因 的試劑盒中的應用。
[0016] 本發(fā)明提供了含有上述PCR擴增引物組和Taqman探針的試劑盒，所述的試劑盒中 還包括PCR反應試劑。
[0017] 所述的PCR反應試劑包括PCR反應混合液和Taq酶。
[0018] 所述的PCR反應混合液包括:0.18mM脫氧核苷酸（dNTP)、1.8mM氯化鎂(MgC12)、 60.3mM氯化鉀(KC1)，18.9mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、甘油（glycerol)0.6% (v/v)，二甲基亞砜(DMS0)5%(v/v)和甲酰胺2·5%(v/v)，其中DMS0和甲酰胺同時作為PCR 反應增強劑及穩(wěn)定劑。
[0019] 本發(fā)明具有如下技術(shù)效果:通過兩個反應管確定實驗樣本HLA-B*5801基因陽性與 否，通過一個反應管排除HLA-B*5801基因的假陽性結(jié)果，通過每個反應孔添加的內(nèi)對照引 物及探針排除樣本HLA-B*5801基因的假陰性結(jié)果。
【附圖說明】
[0020] 圖1為樣本檢測示意圖。
[0021] 圖2-la為HLA-B*5801等位基因陽性樣本--Sample 1VIC(內(nèi)對照基因的報告熒 光)的擴增曲線。
[0022] 圖2-lb為HLA-B*5801等位基因陽性樣本--Sample 1FAM(檢測5801的報告熒光） 的擴增曲線。
[0023] 圖2-2a為HLA-B*5801等位基因陽性樣本--Sample 2VIC(內(nèi)對照基因的報告熒 光)的擴增曲線。
[0024] 圖2-2b為HLA-B*5801等位基因陽性樣本--Sample 2FAM(檢測5801的報告熒光） 的擴增曲線。
[0025] 圖2-3a為HLA-B*5801等位基因陽性樣本--Sample 3VIC(內(nèi)對照基因的報告熒 光)的擴增曲線。
[0026] 圖2-3b為HLA-B*5801等位基因陽性樣本--Sample 3FAM(檢測5801的報告熒光） 的擴增曲線。
[0027] 圖2_4a為HLA_B*5801等位基因陽性樣本--Sample 4VIC(內(nèi)對照基因的報告熒 光)的擴增曲線。
[0028] 圖2-4b為HLA-B*5801等位基因陽性樣本--Sample 4FAM(檢測5801的報告熒光） 的擴增曲線。
[0029] 圖2-5a為HLA-B*5801等位基因陽性樣本--Sample 5VIC(內(nèi)對照基因的報告熒 光)的擴增曲線。
[0030] 圖2-5b為HLA-B*5801等位基因陽性樣本--Sample 5FAM(檢測5801的報告熒光） 的擴增曲線。
[0031] 圖 3-1 為 Sample 1 測序圖。
[0032] 圖3-2為Sample 2測序圖。
[0033] 圖3-3為Sample 3測序圖。
[0034] 圖3-4為Sample 4測序圖。
[0035] 圖3-5為Sample 5測序圖。
【具體實施方式】
[0036] 實施例1
[0037] 1.原料和設備：
[0038] 1.1試劑盒內(nèi)含物：
[0039] 1)熒光定量PCR反應8連管，每條8連管可進行2個樣本檢測，每個檢測需3管(MIX1、 MIX2 和 MIX3):
[0040] 8連管上標記紅色依次為1以1，]?^2，]\0乂3，同排空一管后依次為1以1，]\1^2，]\0父3， 如圖3所示。
[0041] 2)3對特異性上下游擴增引物及相應探針，按特定排列凍干在PCR反應8連管底部， 每個PCR反應8連管底部還添加有一對內(nèi)對照引物及相應探針;所有引物和探針均凍干在 PCR反應管底部。
[0042] 3對特異性擴增引物及相應探針在PCR反應8連管中的分布如下：
[0044] 每個反應管中還添加一對內(nèi)對照引物及相應探針，內(nèi)對照引物序列如下：
[0046] 3)PCR反應試劑
[0047] DNA聚合酶:為熱啟動Taq聚合酶；
[0048] PCR反應混合液，成分如下:包括0.18mM脫氧核苷酸(dNTP)、1.8mM氯化鎂(MgC12)、 60.3mM氯化鉀(KC1)，18.9mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、甘油（glycerol)0.6% (v/v)，二甲基亞砜(DMS0)5%(v/v)和甲酰胺2·5%(v/v)，其中DMS0和甲酰胺同時作為PCR 反應增強劑及穩(wěn)定劑。
[0049] 1.2樣本的來源
[0050] 1)血液樣本采集
[0051 ] 血液樣本可以用含抗凝血劑梓檬酸鈉 （Sodium citrate)及乙二胺四乙酸(EDTA) 的采血管進行采集，以新鮮或冷凍保存未經(jīng)反復凍融的全血樣本作為實驗樣本。
[0052] 2)核酸樣本萃取
[0053]可由全血或白血球?qū)拥群泻思毎臉颖?，以沉淀法、管柱法或磁珠法進行核酸 萃取，取得足量且質(zhì)量合格的核酸以進行聚合酶鏈式反應。
[0054] 3)核酸樣本定量
[0055] 萃取的核酸樣本必須溶解于滅菌水或其它適當?shù)娜芤海ㄈ鏣E Buffer)之中，且濃 度應介于15-30ng/yl，不可將核酸樣本溶解于含有超過0.5mM螯化物如乙二胺四乙酸 (EDTA)的溶液。
[0056] 4)核酸樣本質(zhì)量規(guī)范
[0057] 核酸樣本的A260/A280比值應介于1.65到1.8之間。
[0058] 1.3所需實驗設備
[0059] 熒光定量PCR儀、不同量程的移液器、小型臺式離心機(含8連管水平頭）。
[0060] 2.基因分型過程
[0061] 2.1反應體系的配置:以一次進行4個樣本的檢測為例，反應體系如表1所示：
[0062] 表1:PCR反應體系
[0064] 每個PCR反應8連管中預先凍存有0.6μ1 ΙΟμΜ內(nèi)對照引物和0.4μ1 ΙΟμΜ內(nèi)對照探 針，3對特異性引物及相應探針在PCR反應8連管中的分布和用量如下：
[0066]取16μ1的上述混合液至各反應管中；每個反應管加入2μ1核酸樣本，確認樣本與上 述混合液充分混合均勻;將反應管蓋上蓋子，短暫離心后，放入熒光定量PCR儀中。
[0067] 2.2 PCR反應程序:如表2所示：
[0068] 表2:PCR反應程序
[0071]請依各型號的自動循環(huán)控溫儀操作手冊進行程序設定，熒光信號采集點設定在65 °C ;熒光信號采集波長設定FAM(520nm)和VIC(560nm)，其中VIC為內(nèi)對照基因報告熒光。 [0072] 2.3實驗結(jié)果分析:在上述PCR反應體系中，觀察樣本中FAM(檢測5801的報告熒光） 和VIC(內(nèi)對照基因的報告熒光）的擴增曲線及Ct值。三管反應的內(nèi)對照(VIC)Ct值均<35， 提示聚合酶鏈式反應正常進行;樣本具備如下條件，且擴增曲線呈典型S型曲線，判為陽性：
[0074] 即待測樣本中，MIX1和MIX2的特異性熒光信號FAM都形成對數(shù)擴增S型曲線Ct值均 <32，MIX3無擴增Ct值>35，則該樣本判為HLA-B*5801等位基因陽性。
[0075] 圖2-la-圖2-5b為5個HLA-B*5801 等位基因陽性樣本--Sample l、Sample2、 Sample 3、Sample 4和Sample 5使用本方法和試劑盒檢測圖。圖中，各樣本三管反應的內(nèi)對 照(VIC)Ct值均彡35,提示聚合酶鏈式反應正常進行;MIX1和MIX2的FAM擴增曲線呈典型S型 曲線，Ct值彡32; MIX3的FAM無擴增，Ct值>35。樣本判為HLA-B*5801等位基因陽性。
[0076] 圖3-1-圖3-5為這5個HLA-B*5801等位基因陽性樣本測序圖。測序結(jié)果顯示樣本 均為HLA-B*5801等位基因陽性。本發(fā)明的試劑盒檢測結(jié)果與測序結(jié)果一致。
[0077] 結(jié)論:整個實驗流程僅需約1個小時，實驗結(jié)果準確，通過本發(fā)明的試劑盒可以準 確判斷實驗樣本的HLA-B*5801等位基因陰陽性。
[0078] 上述實施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人 士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡根據(jù)本發(fā)明 精神所做的等效修飾或變化，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種用于檢測HLA-B*5801等位基因的PCR擴增引物組和Taqman探針，其特征在于，所 述的PCR擴增引物組和Taqman探針包含兩對根據(jù)HLA_B*5801特異性序列設計的引物及相應 兩條探針，序列如下：所述的PCR擴增引物組和Taqman探針還包含一對用于篩除HLA_B*5801假陽性的引物及 相應一條探針，序列如下:_所述的PCR擴增引物組和Taqman探針還包含一對內(nèi)對照引物及相應一條探針，用于監(jiān) 控儀器故障、試劑因素、聚合酶活性或樣本中的抑制物等因素造成的假陰性結(jié)果，序列如 下：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR擴增引物組和Taqman探針，其特征在于，所述的Taqman探 針5'端的報告基團為FAM、HEX或VIC，3'端的淬滅基團為BHQ-1。3. 如權(quán)利要求1或2所述PCR擴增引物組和Taqman探針在制備檢測HLA_B*5801等位基因 的試劑盒中的應用。4. 含有如權(quán)利要求1或2所述用于檢測HLA_B*5801等位基因的PCR擴增引物組和Taqman 探針的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包括PCR反應試劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的PCR反應試劑包括PCR反應混合液 和Taq酶。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述的PCR反應混合液包括:0.18mM脫氧 核苷酸(dNTP)、1.8mM氯化鎂(MgCl2)、60.3mM氯化鉀(KC1)，18.9mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸 鹽（Tris-HCl)、甘油（glycerol)O · 6% (v/v)，二甲基亞砜(DMSO)5% (v/v)和甲酰胺2 · 5% (v/v)，其中DMS0和甲酰胺同時作為PCR反應增強劑及穩(wěn)定劑。
【文檔編號】C12Q1/68GK105950766SQ201610512514
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月30日
【發(fā)明人】陳炤源, 王浩, 張金濤, 章婷婷
【申請人】江蘇偉禾生物科技有限公司