一種檢測肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素基因的引物、探針、方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種檢測肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素基因的引物、探針、方法及試劑盒，采用Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR法，分別針對(duì)phoE基因、KPC基因、內(nèi)標(biāo)基因(int)保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和熒光標(biāo)記探針。phoE、KPC基因探針5’端均標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3’端均標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，int基因5’端均標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)JOE，3’端均標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)BHQ1。引物、探針配成PCR檢測混合液后，加入酶與樣本核酸，選用熒光PCR儀上的FAM通道對(duì)phoE基因、KPC基因進(jìn)行擴(kuò)增，選用JOE通道對(duì)int基因進(jìn)行擴(kuò)增，通過熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)目的基因的檢測。本發(fā)明具有準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，能夠?qū)μ狄汉脱适米訕颖局械姆窝卓死撞蚄PC進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測。
【專利說明】
一種檢測肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素基因的引物、探 針、方法及試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類 抗生素基因的引物、探針、方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎克雷伯菌碳青霉稀酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemases，KPC)是近 來新發(fā)現(xiàn)的一類碳青霉烯酶，能夠水解包括碳青霉烯類抗生素等多種內(nèi)酰胺類抗菌藥 物，并且KPC基因位于可轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒上，使得KPC在菌株間傳播。KPC是酒精中毒者、糖尿病和 慢性阻塞性肺部疾病患者并發(fā)肺部感染的潛在危險(xiǎn)因素，可引起肺炎、尿路感染、腦膜炎、 全身敗血癥等。產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶菌的出現(xiàn)及擴(kuò)散，嚴(yán)重削弱了 β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物(包 括碳青霉烯類抗菌藥物)的臨床功效，使得臨床上抗感染治療面臨嚴(yán)峻考驗(yàn)。
[0003] 臨床上對(duì)產(chǎn)KPC酶細(xì)菌的檢測主要是常規(guī)的藥敏試驗(yàn)，如肉湯稀釋法、紙片擴(kuò)散法 以及濃度梯度法，這些方法對(duì)產(chǎn)KPC酶細(xì)菌的檢測較為困難，原因如下：產(chǎn)KPC酶細(xì)菌僅對(duì)碳 青霉烯類抗菌藥物敏感性降低，還達(dá)不到完全耐藥的水平;產(chǎn)KPC酶細(xì)菌應(yīng)用ESBLs確證試 驗(yàn)檢測為陽性，容易鑒定為ESBLs菌株;產(chǎn)KPC酶細(xì)菌接種效應(yīng)會(huì)影響亞胺培南的MIC，造成 錯(cuò)檢，而且無法了解抗性引起的分子生物學(xué)機(jī)制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種檢測肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素基因的引物、探針、方法 及試劑盒，解決現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)的藥敏試驗(yàn)檢測產(chǎn)KPC酶細(xì)菌容易錯(cuò)檢，而且無法了解抗性 引起的分子生物學(xué)機(jī)制的技術(shù)問題。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0006] -種檢測肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素基因的引物和探針，檢測肺炎克雷伯 菌外膜磷酸蛋白基因 phoE的引物核苷酸序列如SEQIDN0:2~3所示，檢測肺炎克雷伯菌外膜 磷酸蛋白基因 phoE的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0:4所示;檢測耐碳青霉稀類抗生 素基因 KPC的引物核苷酸序列如SEQIDN0:6~7所示，檢測耐碳青霉烯類抗生素基因 KPC的 Taqman探針的核甘酸序列如SEQIDN0 : 8所不；檢測內(nèi)標(biāo)基因 int的引物核甘酸序列如 SEQIDN0:10~11所示，檢測內(nèi)標(biāo)基因 int的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0:12所示。
[0007] -種檢測肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素基因的方法，包括：
[0008] 樣本核酸制備，以獲得核酸模板；
[0009] 分別針對(duì)肺炎克雷伯菌外膜磷酸蛋白基因 phoE、耐碳青霉烯類抗生素基因 KPC、內(nèi) 標(biāo)基因 int設(shè)計(jì)特異性引物和熒光標(biāo)記探針，其中，檢測肺炎克雷伯菌外膜磷酸蛋白基因 phoE的引物核苷酸序列如SEQIDN0:2~3所示，檢測肺炎克雷伯菌外膜磷酸蛋白基因 phoE的 Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0:4所示;檢測耐碳青霉烯類抗生素基因 KPC的引物核苷 酸序列如SEQIDN0:6~7所示，檢測耐碳青霉烯類抗生素基因 KPC的Taqman探針的核苷酸序 列如SEQIDNO: 8所示;檢測內(nèi)標(biāo)基因 int的引物核苷酸序列如SEQIDNO: 10~11所示，檢測內(nèi) 標(biāo)基因 int的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0:12所示；
[0010]取陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品置于離心管中，分別加入核酸抽提液充分混勻，并進(jìn)行 加熱和離心處理，取上清液用于熒光PCR檢測；
[0011 ] 配置酶試劑，其中，所述酶由水生棲熱菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿啼啶-N-糖基化酶 (UNG酶)混合組成；
[0012] 將phoE基因 PCR檢測混合液與酶試劑震蕩混勻，進(jìn)行離心處理;將KPC基因 PCR檢測 混合液與酶試劑震蕩混勻，進(jìn)行離心處理；
[0013] 分別取加酶混勻后的PCR檢測混合液置于熒光PCR管中，取樣本核酸抽提上清液、 陰性對(duì)照品核酸抽提上清液、陽性對(duì)照品核酸抽提上清液和內(nèi)標(biāo)加入已有PCR檢測混合液 的熒光PCR管中，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:37 °C X 2min，94 °C X 2min，循環(huán)1次;93 °C X 15s，60 °C X 60s，循環(huán)40次;單點(diǎn)熒光檢測在60°C，并在此采集熒光信號(hào)，所述內(nèi)標(biāo)為含有內(nèi) 標(biāo)int基因片段的質(zhì)粒；
[0014] 對(duì)于phoE基因和KPC基因，采用熒光PCR儀上的FAM通道進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)于int基因，采 用熒光PCR儀上的J0E通道進(jìn)行擴(kuò)增，通過熒光定量PCR儀所收集數(shù)據(jù)確定檢測位點(diǎn)的基因 型。
[0015] -種檢測肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素基因的試劑盒，包括核酸抽提液、第 一引物探針混合液、第二引物探針混合液、PCR反應(yīng)酶系、內(nèi)標(biāo)、陰性對(duì)照品、陽性對(duì)照品和 分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中，所述第一引物探針混合液由脫氧核糖核 苷三磷酸dN(U)TP、ph 〇E基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針、int基因的上、下游引物 及一條熒光標(biāo)記探針組成，所述第二引物探針混合液由脫氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、KPC 基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針、int基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針組 成；
[0016] 其中，檢測phoE基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO: 2~3所示，檢測phoE基因的 Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO: 4所示;檢測KPC基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO: 6 ~7所示，檢測KPC基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO: 8所示;檢測int基因的引物 核苷酸序列如SEQIDNO: 10~11所示，檢測int基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO: 12所示。
[0017] 本發(fā)明的有益效果：采用Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR法，分別針對(duì)phoE基因、KPC基 因、int基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和熒光標(biāo)記探針。ph 〇E、KPC基因探針5'端均標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán) FAM，3'端均標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，內(nèi)標(biāo)基因5'端均標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)J0E，3'端均標(biāo)記 熒光淬滅基團(tuán)BHQ1。引物、探針配成PCR檢測混合液后，加入酶與樣本核酸，選用熒光PCR儀 上的FAM通道對(duì)phoE基因、KPC基因進(jìn)行擴(kuò)增，選用J0E通道對(duì)int基因進(jìn)行擴(kuò)增，通過熒光信 號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)目的基因的檢測。本發(fā)明具有準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，能夠?qū)?痰液和咽拭子樣本中的肺炎克雷伯菌和KPC進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測。
【附圖說明】
[0018] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例中所 需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施 例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可根據(jù)這些附圖獲 得其他的附圖。
[0019] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例四的肺炎克雷伯菌感染樣本的熒光定量PCR曲線圖；
[0020] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例四的KPC感染樣本的熒光定量PCR曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖和具體實(shí) 施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0022] 實(shí)施例一
[0023]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種檢測肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素基因的引物和 探針，檢測肺炎克雷伯菌外膜磷酸蛋白基因 phoE的引物核苷酸序列如SEQIDN0:2~3所示， 檢測肺炎克雷伯菌外膜磷酸蛋白基因 phoE的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0:4所示； 檢測耐碳青霉烯類抗生素基因 KPC的引物核苷酸序列如SEQIDN0:6~7所示，檢測耐碳青霉 烯類抗生素基因 KPC的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0:8所示;檢測內(nèi)標(biāo)基因 int的引 物核苷酸序列如SEQIDN0:10~11所示，檢測內(nèi)標(biāo)基因 int的Taqman探針的核苷酸序列如 SEQIDN0:12所示；
[0024]其中，phoE基因設(shè)計(jì)的特異性引物的序列如下：
[0025] 上游引物 P-phoE-F: 5 ' -CGCGCCGTGACGGAAAGCTT-3 '
[0026] 下游引物P-phoE-R: 5 ' -GTCGTGTTTCCCTTTAGCCA-3 '
[0027] 針對(duì)phoE基因的TaqMan焚光標(biāo)記探針序列如下：
[0028] T-phoE:5 '-FAM-AAACTGACACTGGGCTCTGCACTGG-TAMRA-3，
[0029] 針對(duì)KPC基因設(shè)計(jì)的特異性引物的序列如下：
[0030] 上游引物 P-KPC-F: 5 ' -TATCAGTTCGACTTCGGTC-3 '
[0031] 下游引物P-KPC-R: 5 ' -CTTCGATATCCTTCCCTTT-3 '
[0032] 針對(duì)KPC基因的TaqMan熒光標(biāo)記探針序列如下：
[0033] T-KPC:5 '-FAM-TCCGTCCCTCGGCTATGTGCTGT-TAMRA-3 '
[0034] int基因設(shè)計(jì)的特異性引物的序列如下：
[0035] 上游引物 P-int-F: 5 ' -GCGATACCACGAGCTAAATC-3 '
[0036] 下游引物 P-int-R: 5 ' -GCATTTCGCTACGTTCTTCAT-3 '
[0037] 針對(duì)int基因的TaqMan熒光標(biāo)記探針序列如下：
[0038] T-int:5 '-FAM-ACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTC-TAMRA-3 '
[0039] phoE、KPC基因探針的核苷酸序列5 '端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，3 '端標(biāo)記的淬 滅基團(tuán)為TAMRA; int基因探針的核苷酸序列5 '端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為J0E，3 '端標(biāo)記的淬 滅基團(tuán)為BHQ1。
[0040] 實(shí)施例二
[0041] 本發(fā)明實(shí)施例中又提供了一種檢測肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素基因的方 法，包括：
[0042] 步驟101、樣本核酸制備，以獲得核酸模板；
[0043]步驟102、分別針對(duì)肺炎克雷伯菌外膜磷酸蛋白基因 phoE、耐碳青霉烯類抗生素基 因 KPC、內(nèi)標(biāo)基因 int設(shè)計(jì)特異性引物和熒光標(biāo)記探針；
[0044]其中，檢測肺炎克雷伯菌外膜磷酸蛋白基因 phoE的引物核苷酸序列如SEQIDN0:2 ~3所示，檢測肺炎克雷伯菌外膜磷酸蛋白基因 phoE的Taqman探針的核苷酸序列如 SEQIDN0:4所示;檢測耐碳青霉烯類抗生素基因 KPC的引物核苷酸序列如SEQIDN0:6~7所 示，檢測耐碳青霉烯類抗生素基因 KPC的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0:8所示;檢測 內(nèi)標(biāo)基因 int的引物核甘酸序列如SEQIDN0:10~11所不，檢測內(nèi)標(biāo)基因 int的Taqman探針的 核苷酸序列如SEQIDN0:12所示；
[0045] 本發(fā)明實(shí)施例中的內(nèi)標(biāo)基因 （internal amplification control，int)，是鑒別儀 器故障、試劑因素、聚合酶活性因素或樣本中存在抑制物等造成的結(jié)果不理想的原因。水稻 核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS1基因與目的基因同源性極低，可以選取該基因片段作為內(nèi)標(biāo)。 對(duì)ph 〇E、KPC、int基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，選取保守片段分別設(shè)計(jì)針對(duì)這3個(gè)基因的特異 性引物和熒光標(biāo)記探針。
[0046] 步驟103、取陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品置于離心管中，分別加入核酸抽提液充分混 勻，并進(jìn)行加熱和離心處理，取上清液用于熒光PCR檢測；
[0047] 步驟104、配置酶試劑；
[0048] 其中，所述酶由水生棲熱菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)混合 組成；
[0049] 步驟105、將phoE基因 PCR檢測混合液與酶試劑震蕩混勻，進(jìn)行離心處理;將KPC基 因 PCR檢測混合液與酶試劑震蕩混勻，進(jìn)行離心處理；
[0050]步驟106、分別取加酶混勻后的PCR檢測混合液置于熒光PCR管中，取樣本核酸抽提 上清液、陰性對(duì)照品核酸抽提上清液、陽性對(duì)照品核酸抽提上清液和內(nèi)標(biāo)加入已有PCR檢測 混合液的熒光PCR管中，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增；
[0051 ]其中，反應(yīng)條件為：37°C X 2min，94°C X 2min，循環(huán) 1 次；93 °C X 15s，60°C X 60s，循 環(huán)40次;單點(diǎn)熒光檢測在60°C，并在此采集熒光信號(hào)，所述內(nèi)標(biāo)為含有內(nèi)標(biāo)int基因片段的 質(zhì)粒；
[0052] 步驟107、對(duì)于phoE基因和KPC基因，采用熒光PCR儀上的FAM通道進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)于 int基因，采用熒光PCR儀上的J0E通道進(jìn)行擴(kuò)增，通過熒光定量PCR儀所收集數(shù)據(jù)確定檢測 位點(diǎn)的基因型。
[0053]其中，檢測結(jié)果根據(jù)CT值進(jìn)行判定，儀器FAM通道CT欄顯示Undet.同時(shí)J0E通道C T值 <35,表示檢測樣品低于檢測限，報(bào)告為陰性;待檢樣品在FAM通道、J0E通道CT值均<35,檢 測結(jié)果報(bào)告為陽性;待檢樣品FAM通道C T顯示在35~40之間，J0E通道CT值<35,需重復(fù)測定， FAM通道CT顯示仍在35~40之間，且擴(kuò)增曲線呈S型，則判斷為陽性;若擴(kuò)增結(jié)果為一直線， 則判斷為陰性。
[0054] 本發(fā)明采用Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR方法。NCB1 blast同源性比對(duì)肺炎克雷伯菌 外膜磷酸蛋白基因 phoE、耐碳青霉稀類抗生素基因 KPC、內(nèi)標(biāo)int基因，選取phoE、KPC、int基 因保守片段設(shè)計(jì)引物和熒光標(biāo)記探針。ph〇E、KPC基因探針5'端標(biāo)記FAM熒光素為熒光報(bào)告 基團(tuán)（用R表示），3 '端標(biāo)記TAMRA熒光素為熒光淬滅基團(tuán)（用Q表示）；int基因設(shè)計(jì)的探針5 ' 端標(biāo)記J0E焚光素為焚光報(bào)告基團(tuán)（用R表不），3'端標(biāo)記BHQ1焚光素為焚光淬滅基團(tuán)（用Q表 示)Q基團(tuán)能在近距離吸收R基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)。PCR反應(yīng)進(jìn)入退火階段時(shí)，探針先與模板 結(jié)合，隨后引物模板結(jié)合，此時(shí)探針上R基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被Q基團(tuán)吸收，儀器檢測不到熒 光信號(hào)；當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到延伸階段時(shí)，Taq DNA聚合酶5'-3'外切酶將探針降解，探針上的R基 團(tuán)游離出來，Q基團(tuán)無法吸收R基團(tuán)發(fā)出的的熒光信號(hào)，檢測器能檢測到熒光信號(hào)。隨著PCR 反應(yīng)的進(jìn)行，PCR產(chǎn)物的增加與熒光信號(hào)的增長呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)關(guān)系。通過熒光信號(hào)增長曲線，實(shí) 現(xiàn)目的基因的檢測。
[0055] 實(shí)施例三
[0056]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種檢測肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素基因的試劑盒， 包括核酸抽提液、第一引物探針混合液、第二引物探針混合液、PCR反應(yīng)酶系、內(nèi)標(biāo)、陰性對(duì) 照品、陽性對(duì)照品和分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中，所述第一引物探針混 合液由脫氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、ph 〇E基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針、int基 因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針組成，所述第二引物探針混合液由脫氧核糖核苷三 磷酸dN(U)TP、KPC基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針、int基因的上、下游引物及一條 熒光標(biāo)記探針組成；
[0057] 其中，檢測phoE基因的引物核苷酸序列如SEQIDN0:2~3所示，檢測phoE基因的 Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0:4所示;檢測KPC基因的引物核苷酸序列如SEQIDN0:6 ~7所示，檢測KPC基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0:8所示;檢測int基因的引物 核苷酸序列如SEQIDN0:10~11所示，檢測int基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0: 12所示。
[0058]所述核酸抽提液由 2%(M/V)Chelex-100、l%(V/V)Tris-HCl，lM，pH9.0 組成。
[0059] 所述第一引物探針混合液和所述第二引物探針混合液分別由2yL10XPCR Buffer、2yL 25mmol/LMgC12、1.6yL 2.5mmol/L dN(U)TP、0.6yL 10ymol/L目的基因引物、 0.2yL lOymol/L目的基因探針、0.6yL lOymol/L內(nèi)標(biāo)引物及0.2yL lOymol/L內(nèi)標(biāo)探針和7μ L滅菌純化水組成。
[0060] PCR反應(yīng)酶系由5U/yL Taq DNA聚合酶和2U/yL UNG酶按體積比3:1比例混合組成。
[0061] PCR擴(kuò)增的條件為：37°C X2min，94°C X2min，循環(huán) 1 次；93°C X 15s，60°C X60s，循 環(huán)40次;單點(diǎn)熒光檢測在60°C，對(duì)于phoE基因和KPC基因，采用熒光PCR儀上的FAM通道進(jìn)行 擴(kuò)增，對(duì)于int基因，采用熒光PCR儀上的J0E通道進(jìn)行擴(kuò)增。
[0062] 所述陽性對(duì)照品為含有滅活的E-phoE菌和E-KPC菌的混合液，菌濃度105CFU/mL; 陰性對(duì)照品為含有滅活的大腸桿菌溶液，菌濃度105CFU/mL，E-ph〇E菌為合有phoE基因片段 的工程菌，E-KPC菌為含有KPC基因片段的工程菌。
[0063]本試劑盒具有準(zhǔn)確率高，臨床試驗(yàn)結(jié)果與DNA測序結(jié)果總符合率99%以上;特異性 強(qiáng)，與痰液和咽拭子中常見致病菌大腸埃希菌、糞腸球菌、屎腸球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠 假單胞菌、變形桿菌、奇異變形桿菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、洋蔥伯克 霍爾德菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、白喉?xiàng)U菌、鼠傷寒沙門氏菌、流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌均無交 叉反應(yīng);靈敏度高，按照質(zhì)粒拷貝數(shù)確定的最低檢測限為10 3C〇pieS/mL，按照菌培養(yǎng)法確定 的最低檢測限為103CFU/mL。本發(fā)明用于體外定性檢測人痰液和咽拭子樣本中肺炎克雷伯 菌外膜磷酸蛋白phoE基因和KPC基因。為臨床確定肺炎克雷伯菌和KPC感染提供輔助診斷方 法，為臨床醫(yī)生用藥提供參考。
[0064] 實(shí)施例四
[0065]本實(shí)施例結(jié)合具體檢測案例說明本發(fā)明的具體應(yīng)用方式，首先收集人痰液和咽拭 子樣本，采用發(fā)明實(shí)施例三中提供的試劑盒進(jìn)行檢測，統(tǒng)計(jì)結(jié)果符合率。
[0066] 1、樣本核酸制備
[0067] (1)痰液:取痰液加入2倍體積的4%NaOH(自備），搖勻，室溫下放置30min液化，12， OOOrpm 5min。沉淀加無菌生理鹽水lmL打勾，12，000rpm5min;去盡上清，沉淀中直接加入50 此核酸抽提液，充分混勾，98°C lOmin(誤差不超過lmin)。12，OOOrpm 5min，取上清2yL做 PCR反應(yīng)。
[0068] (2)咽拭子:取lmL樣本，12，OOOrpm 2min;棄去上清，沉淀中直接加入50yL核酸抽 提液，充分混勻，98°C lOmin(誤差不超過lmin)。12，OOOrpm 5min，取上清2yL做PCR反應(yīng)。 [0069] 2、對(duì)照品準(zhǔn)備
[0070] 取陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品各50yL分別置于1.5mL(或0.5mL)離心管中（凍存試劑 融化后振蕩混勻lOsec)，分別加入核酸抽提液50yL充分混勻，98°C10min，然后12,000rpm 5min，取上清2yL做PCR反應(yīng)。
[0071] 3、酶試劑配制
[0072] 取η X 16yL肺炎克雷伯菌外膜磷酸蛋白（phoE)基因 PCR檢測混合液與η X 0.2yL酶 (水生棲熱菌DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心混勻數(shù)秒； 取η X 16yL肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)基因 PCR檢測混合液與η XO. 2yL酶(水生棲熱菌 DNA聚合酶+尿嘧啶-N-糖基化酶)混合，振蕩混勻數(shù)秒，3000rpm離心混勻數(shù)秒。
[0073] 4、加樣
[0074]分別取上述混合液16yL置于PCR管中，然后將樣本、陰性對(duì)照品、陽性對(duì)照品的處 理上清液各2yL分別加入各個(gè)已有混合液的PCR管中，同時(shí)分別向樣本、陰性對(duì)照品、陽性對(duì) 照品PCR管中加入2yL內(nèi)標(biāo)，蓋好管蓋，立即進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
[0075] 5、PCR 擴(kuò)增
[0076] 反應(yīng)管置于熒光PCR儀上，推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
[0077] 37°C X2min，94°C X2min，循環(huán) 1 次；93°C X15sec，60°C X60s，循環(huán)40次；單點(diǎn)熒光 檢測在60°C，反應(yīng)體系為20yL。
[0078] 熒光通道檢測選擇:phoE、KPC基因選用FAM通道，內(nèi)標(biāo)基因選用JOE通道。
[0079] 6、結(jié)果判定
[0080] 檢測結(jié)束后，基線調(diào)整取6-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超 過陰性對(duì)照品檢測熒光曲線的最高點(diǎn)。儀器FAM通道C T欄顯示Undet.同時(shí)J0E通道CT值彡35， 表示檢測樣品低于檢測限，報(bào)告為陰性;待檢樣品在FAM通道、J0E通道C T值均<35,檢測結(jié) 果報(bào)告為陽性;待檢樣品FAM通道CT顯示在35~40之間，J0E通道C T值<35，需重復(fù)測定，F(xiàn)AM 通道CT顯示仍在35~40之間，且擴(kuò)增曲線呈S型，則判斷為陽性;若擴(kuò)增結(jié)果為一直線，則判 斷為陰性。
[0081 ] 7、檢測結(jié)果檢驗(yàn)
[0082]本發(fā)明的檢測結(jié)果與細(xì)菌培養(yǎng)鑒定與藥敏試驗(yàn)結(jié)果一致，熒光PCR檢測結(jié)果如圖1 和圖2所示，圖1為肺炎克雷伯菌感染樣本的熒光定量PCR曲線圖，可見隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行， phoE基因?qū)?yīng)的PCR產(chǎn)物與熒光信號(hào)的增長呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)關(guān)系，可判斷phoE基因?yàn)殛栃?，KPC基 因?yàn)殛幮浴D2為KPC感染樣本的熒光定量PCR曲線圖，可判斷phoE基因和KPC基因均為陽性。
[0083]以上對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)本發(fā)明的原理及實(shí)施方 式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時(shí)，對(duì) 于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在【具體實(shí)施方式】及應(yīng)用范圍上均會(huì)有改變 之處，綜上所述，本說明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素基因的引物和探針，其特征在于，檢測 肺炎克雷伯菌外膜磷酸蛋白基因 PhoE的引物核苷酸序列如SEQIDNO: 2~3所示，檢測肺炎克 雷伯菌外膜磷酸蛋白基因 phoE的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0:4所示;檢測耐碳青 霉烯類抗生素基因 KPC的引物核苷酸序列如SEQIDN0:6~7所示，檢測耐碳青霉烯類抗生素 基因 KPC的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO: 8所示;檢測內(nèi)標(biāo)基因 int的引物核苷酸序 列如SEQIDNO: 10~11所示，檢測內(nèi)標(biāo)基因 int的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO: 12所 不。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素基因的引物和探針， 其特征在于，ph〇E、KPC基因探針的核苷酸序列5 '端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，3 '端標(biāo)記的 淬滅基團(tuán)為TAMRA; int基因探針的核苷酸序列5 '端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為JOE，3 '端標(biāo)記的 淬滅基團(tuán)為BHQl。3. -種檢測肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素基因的方法，其特征在于，包括： 樣本核酸制備，以獲得核酸模板； 分別針對(duì)肺炎克雷伯菌外膜磷酸蛋白基因 phoE、耐碳青霉烯類抗生素基因 KPC、內(nèi)標(biāo)基 因 int設(shè)計(jì)特異性引物和熒光標(biāo)記探針，其中，檢測肺炎克雷伯菌外膜磷酸蛋白基因 phoE的 引物核苷酸序列如SEQIDNO: 2~3所示，檢測肺炎克雷伯菌外膜磷酸蛋白基因 phoE的Taqman 探針的核苷酸序列如SEQIDN0:4所示;檢測耐碳青霉烯類抗生素基因 KPC的引物核苷酸序列 如SEQIDNO: 6~7所示，檢測耐碳青霉烯類抗生素基因 KPC的Taqman探針的核苷酸序列如 SEQIDNO: 8所示;檢測內(nèi)標(biāo)基因 int的引物核苷酸序列如SEQIDNO: 10~11所示，檢測內(nèi)標(biāo)基 因 int的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDNO: 12所示； 取陽性對(duì)照品、陰性對(duì)照品置于離心管中，分別加入核酸抽提液充分混勻，并進(jìn)行加熱 和離心處理，取上清液用于熒光PCR檢測； 配置酶試劑，其中，所述酶由水生棲熱菌DNA聚合酶(Taq酶)和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG 酶)混合組成； 將phoE基因 PCR檢測混合液與酶試劑震蕩混勻，進(jìn)行離心處理;將KPC基因 PCR檢測混合 液與酶試劑震蕩混勻，進(jìn)行離心處理； 分別取加酶混勻后的PCR檢測混合液置于熒光PCR管中，取樣本核酸抽提上清液、陰性 對(duì)照品核酸抽提上清液、陽性對(duì)照品核酸抽提上清液和內(nèi)標(biāo)加入已有PCR檢測混合液的熒 光PCR管中，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:37°C X 2min，94°C X 2min，循環(huán)1次;93°C X 15s， 60°CX60s，循環(huán)40次；單點(diǎn)熒光檢測在60°C，并在此采集熒光信號(hào)，所述內(nèi)標(biāo)為含有內(nèi)標(biāo) int基因片段的質(zhì)粒； 對(duì)于phoE基因和KPC基因，采用熒光PCR儀上的FAM通道進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)于int基因，采用熒 光PCR儀上的JOE通道進(jìn)行擴(kuò)增，通過熒光定量PCR儀所收集數(shù)據(jù)確定檢測位點(diǎn)的基因型。4. 一種檢測肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素基因的試劑盒，其特征在于，包括核酸 抽提液、第一引物探針混合液、第二引物探針混合液、PCR反應(yīng)酶系、內(nèi)標(biāo)、陰性對(duì)照品、陽性 對(duì)照品和分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中，所述第一引物探針混合液由脫 氧核糖核苷三磷酸dN(U)TP、ph 〇E基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針、int基因的上、 下游引物及一條熒光標(biāo)記探針組成，所述第二引物探針混合液由脫氧核糖核苷三磷酸dN (U)TP、KPC基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo)記探針、int基因的上、下游引物及一條熒光標(biāo) 記探針組成，所述內(nèi)標(biāo)為含有int基因片段的質(zhì)粒組成； 其中，檢測PhoE基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO:2~3所示，檢測phoE基因的Taqman 探針的核苷酸序列如SEQIDNO: 4所示；檢測KPC基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO: 6~7所 示，檢測KPC基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDN0:8所示;檢測int基因的引物核苷酸 序列如SEQIDMM0~11所示，檢測int基因的Taqman探針的核苷酸序列如SEQIDMM2所示。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素基因的試劑盒，其特 征在于，所述核酸抽提液由2%(M/V)Chelex-100、l%(V/V)Tris-HCl，lM，pH9.0 組成。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素基因的試劑盒，其特 征在于，所述第一引物探針混合液和所述第二引物探針混合液分別由2yL IOXPCR Buffer、2yL25mmol/LMgCl2、1.6yL 2.5mmol/L dN(U)TP、0.6yL lOymol/L目的基因引物、 0.2yL lOymol/L目的基因探針、0.6yL lOymol/L內(nèi)標(biāo)引物及0.2yL lOymol/L內(nèi)標(biāo)探針和7μ L滅菌純化水組成。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素基因的試劑盒，其特 征在于，PCR反應(yīng)酶系由5U/yL Taq DNA聚合酶和2U/yL尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)按體積 比3:1比例混合組成。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素基因的試劑盒，其特 征在于，PCR擴(kuò)增的條件為:37°C X 2min，94°C X 2min，循環(huán) 1次;93°C X 15s，60°C X 60s，循環(huán) 40次;單點(diǎn)熒光檢測在60°C，對(duì)于phoE基因和KPC基因，采用熒光PCR儀上的FAM通道進(jìn)行擴(kuò) 增，對(duì)于int基因，采用熒光PCR儀上的JOE通道進(jìn)行擴(kuò)增。9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類抗生素基因的試劑盒，其特 征在于，所述陽性對(duì)照品為含有滅活的E-phoE菌和E-KPC菌的混合液，菌濃度IO 5CFUAiL;陰 性對(duì)照品為含有滅活的大腸桿菌溶液，菌濃度I O5CFlVmL，E-phoE菌為含有phoE基因片段的 工程菌，E-KPC菌為含有KPC基因片段的工程菌。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105950772SQ201610539447
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年7月11日
【發(fā)明人】王偉建, 倪劍鋒, 孫小燕, 翁毅
【申請(qǐng)人】寧波基內(nèi)生物技術(shù)有限公司, 王偉建