一種禽流感h9n2亞型病毒ha蛋白線性抗原表位多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種禽流感H9N2亞型病毒HA蛋白線性抗原表位多肽，所述抗原表位多肽具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本發(fā)明抗原表位多肽用于制備檢測禽流感病毒的制品。本發(fā)明的禽流感病毒HA蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽的鑒定為進一步建立高效檢測禽流感的方法提供了依據(jù)，同時也為研究HA蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種禽流感H9N2亞型病毒HA蛋白線性抗原表位多肽
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于動物醫(yī)學(xué)分子免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種禽流感病毒H9N2亞型HA 蛋白線性抗原表位多肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感H9N2亞型病毒(AIV)屬甲型流感病毒，是由A型流感病毒引起禽類的一種從 呼吸系統(tǒng)到嚴(yán)重全身敗血癥等多種癥狀的傳染病，國際獸疫局將其定為甲類傳染病。1966 年HoMee從患溫和呼吸道病的火雞中分離到第一株H9N2亞型禽流感病毒，之后H9N2亞型禽 流感在世界范圍內(nèi)迅速流行，尤其是1994~1999年在世界范圍內(nèi)造成了巨大的經(jīng)濟損失。 1994年，我國首次報道從雞群中分離到H9N2亞型禽流感，隨后陸續(xù)出現(xiàn)相關(guān)報道。1998年秋 H9N2亞型禽流感在我國發(fā)生，短短2個月內(nèi)即席卷了大多數(shù)省份，因其毒力較弱，死亡率沒 有H5N1、H7N1高，而沒有引起足夠的重視。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)H9N2亞型在中國大陸形成了一個穩(wěn)定 的亞系，這不僅對養(yǎng)禽業(yè)有巨大危害，而且嚴(yán)重威脅人類健康。并且研究表明，H9N2亞型部 分流行株的致病力明顯變異，尤其對肉仔雞，死亡率可達(dá)到30%以上；對產(chǎn)蛋高峰期的蛋 雞，其產(chǎn)蛋下降幅度大，恢復(fù)困難。
[0003] 病原學(xué)研究表明，H9N2亞型禽流感病毒屬于正粘病毒科的A型流感病毒，其基因組 為單股負(fù)鏈RNA，病毒粒子具有多形性，典型的A型流感病毒呈球型，直徑為80-120nm。病毒 粒子大約由0.8-1.1 % RNA、0-75 %蛋白質(zhì)、20-24 %脂質(zhì)和5-8 %碳水化合物組成。H9N2基因 組由8個RNA節(jié)段構(gòu)成（？81、？82、？六、骱、即、嫩1、奶），分別編碼10個基因產(chǎn)物，包括?81、 ?82、卩厶、骱、陬、財、]?1、]\12和似、奶2蛋白，其中？81、？82、？厶、骱、陬、嫩、]\11為結(jié)構(gòu)蛋白，]\12和 HA、NS2為非結(jié)構(gòu)蛋白。依病毒的外膜血凝素抗原HA和神經(jīng)氨酸酶抗原NA的不同，禽流感病 毒目前有16種HA亞型(H1-H16)和9種NA亞型(N1-N9)，不同的HA和NA之間可形成多種血清型 禽流感病毒，例如:H9N2、H5N1、H3N2等，一種亞型的抗體只能中和同型的病毒抗原，不同亞 型的抗原無交叉保護力。
[0004] 全球抗原表位組學(xué)近年來發(fā)展速度越來越快，大量的抗原表位被分析和簽訂出 來，為診斷醫(yī)學(xué)、表位組學(xué)、抗體組學(xué)和功能性抗體開發(fā)提供極其重要的研究基礎(chǔ)。目前，已 經(jīng)鑒定的流感病毒抗原表位多數(shù)來源于H1N1、H3N2和H5N1等病毒株，而對H9N2亞型禽流感 的抗原表位研究基本處在空白之中，因此本發(fā)明人開展了HA抗原表位的鑒定工作，以期能 夠為進一步建立高效的檢測禽流感的方法提供理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供禽流感病毒HA蛋白細(xì)胞抗原表位多肽，從而彌 補現(xiàn)有技術(shù)的不足
[0006] 本發(fā)明的禽流感病毒HA蛋白抗原表位多肽，其特征在于，所述抗原表位多肽具有 如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
[0007] 進一步的，本發(fā)明還提供了編碼所述的抗原表位多肽的核苷酸序列。
[0008] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009] 含有所述的核苷酸序列的表達(dá)載體以及含有所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞也應(yīng)屬于 本發(fā)明所要求保護的范圍。
[0010] 本發(fā)明抗原表位多肽用于制備檢測禽流感病毒的制品。
[0011] 禽流感病毒HA蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽的鑒定為進一步建立高效檢測禽流感的方 法提供了依據(jù)，同時也為研究HA蛋白的結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0012] 圖1:為合成的禽流感病毒H9N2和蛋白B細(xì)胞抗原表位多肽與SPF對照雞、禽流感免 疫雞和禽流感感染雞血清結(jié)合ELISA反應(yīng)結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0013] 本發(fā)明用PEG沉淀超速離心濃縮純化的禽流感H9N2亞型病毒免疫BALB/c小鼠，用 表達(dá)好的重組HA蛋白、純化流感病毒和HI實驗進行篩選，共制備3株能穩(wěn)定分泌抗HA特異性 抗體的雜交瘤細(xì)胞株。同時進一步Western blot鑒定和IFA的方法鑒定了能與真核表達(dá)系 統(tǒng)瞬時表達(dá)的HA蛋白特異性結(jié)合的3株MAb s，驗證了 MAb s的特異性，分別命名為HA Mab 3A4D6、1A2B7和2B6D9。利用噬菌體展示肽庫技術(shù)篩HI效價最高的選抗HA Mab 3A4D6的克 隆，最終獲得10個陽性克隆，測序后得到8個多肽序列，
[0014]下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本其共有序列為ERSKIEFVK，與所用毒株的 HA蛋白編碼氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)其與aa507~aa515有7個氨基酸位點完全匹配，提示 5〇7ERQKIEGVK 515為HA抗原的一個線性表位。發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該 理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進行修改 或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0015] 實施例1禽流感H9N2亞型病毒線性抗原表位的鑒定
[0016] 1材料和方法
[0017] 1.1主要實驗材料和實驗動物：SP2/0細(xì)胞由
【申請人】所在實驗室保存；表達(dá)AIV (H9N2)的HA的重組質(zhì)粒Pet28a-HA由本實驗室構(gòu)建;AIV(H9N2)病毒由本實驗室保存;SPF雞 胚購自梅里亞;6~8周齡SPF BALB/c雌性小鼠購北京醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。
[0018] 1.2主要試劑:PEG6000(Merck)、蔗糖(上海國藥）、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐 劑（510]\^)、1^1313；^&111：；[1]1〇1186-111^(316]\^)、1^1313；^&111：；[1]1〇1186-卩11'〇(316]\^)、卩策菌體展 示肽庫試劑盒(NEB)
[0019] 1.3純化的病毒和鑒定:將保存的禽流感病毒用生理鹽水1:10000倍稀釋后接種 于10齡雞胚，每個雞胚注射0.2ml，（ 35+1) °C、60 %濕度培養(yǎng)三天后將雞胚置于4 °C過夜，收 其尿囊液測定其血凝活性。反復(fù)凍融三次后離心取上清，緩慢攪拌加入NaCl至0.5mo 1/L，再 攪拌加入等體積的10 %的PEG6000，4°C過夜。8000rpm離心30min取沉淀，加入原體積10 %的 PBS混懸后4°C過夜。8000rpm離心取上清用20%、40%、60%的蔗糖18000印111密度梯度離心 211，40%-60%間收集病毒層，加入1^3適量后18000印111離心211取沉淀1^3混懸。測定血凝價 和蛋白濃度，分裝后-20°C保存?zhèn)溆?。同時SPF雞胚尿囊液同上操作留存陰性對照品。
[0020] 1.4動物免疫:純化后的病毒與佐劑等體積混合免疫雌鼠，免疫采用肌肉注射的 方式，劑量為50yg/只，每隔2周免疫一次，免疫3次。3免后7d斷尾采血，利用HA重組蛋白包被 的ELISA板測血清效價。在融合前3d選擇血清效價最高的小鼠腹腔注射100ug加強免疫。
[0021] 1.5 HA間接ELISA方法的建立:按常規(guī)間接ELISA操作，利用方陣法確定MAb的篩選 條件。純化后的HA重組蛋白濃度為lmg/ml，用包被液對其進行1:10、1: 50、1:100、1: 200、1: 500倍稀釋，用PBS對陽性血清進行1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000倍稀釋。以陽性孔 0D值最接近于1，P/N值大于2的蛋白和血清濃度作為最佳工作濃度。
[0022] 1.6 AIV病毒蛋白間接ELISA方法的建立:按常規(guī)間接ELISA操作，利用方陣法確定 MAb的篩選條件。純化后的HA重組蛋白濃度為lmg/ml，用包被液對其進行1:10、1:50、1:100、 1:200、1:500倍稀釋，用PBS 對陽性血清進行 1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000倍稀釋。 以陽性孔0D值最接近1，P/N值大于2的蛋白和血清濃度作為最佳工作濃度。
[0023] 1.7雜交瘤細(xì)胞的制備：將小鼠脾細(xì)胞和SP2/0融合后的細(xì)胞用HA間接ELISA和 AIV病毒蛋白間接ELISA平行檢測，取雙陽性的克隆用有限稀釋法進行克隆培養(yǎng)，克隆3~4 次后獲得穩(wěn)定分泌特異性MAb的雜交瘤細(xì)胞。將取得的陽性細(xì)胞株上清用HI實驗做篩選，取 有HI效價的克隆進行建株。
[0024] 1.8 MAb腹水的制備：按常規(guī)方法，取6-8周齡的雌性Blab/C小鼠腹腔注射液體石 蠟0.5ml/只，1周后注射1*106個細(xì)胞/只，所得腹水5000rpm離心取上清，-20°C分裝保存。分 別檢測HI效價、間接ELISA效價和亞類鑒定。
[0025] 1.9 Western blot鑒定：按常規(guī)SDS-PAGE方法:6%濃縮膠，15%分離膠進行電泳 后，PVDF膜，15V轉(zhuǎn)印0.5h，將轉(zhuǎn)印后的PVDF膜封閉過夜后，PBST洗滌后將腹水1:200稀釋后 37°C孵育lOOmin，洗滌后加二抗37°C孵育60min，洗滌后DAB避光顯色15-30min至條帶清晰。 蒸餾水洗滌后拍照記錄。
[0026] 1.10 IFA鑒定:將雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)經(jīng)過0.5%胰酶消化，加入24孔細(xì)胞培養(yǎng) 板，37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;將病毒按照1:100/1:1000/1:10000稀釋后感染CEF，36h后出現(xiàn) 明顯的細(xì)胞病變，CEF變圓，出現(xiàn)空斑，進行細(xì)胞固定，加預(yù)冷的丙酮lml /孔，室溫靜置 10min，PBS洗滌一遍，加1:100稀釋的腹水稀釋液200ul/孔，37°C水浴鍋中放置30min，PBS洗 滌三遍，加熒光二抗l〇〇ul/孔，洗滌后熒光顯微鏡下觀察。
[0027] 1.11 MAb識別抗原表位的初步鑒定:按照NEB公司的噬菌體展示肽說明書對MAb對 應(yīng)的抗原表位進行鑒定。用lOOygAU MAb包板（150yl/孔），4°C過夜。0.1 %TBST洗板封閉 后，每孔加入4 XIOlOpfu的噬菌體，孵育lh后洗脫結(jié)合噬菌體并擴增。測定擴增前后噬菌體 的滴度，以備下輪篩選用。第二、三輪淘選時，MAb的包板濃度分別降至75ygAU、50ygAil， TBST濃度分別增至0.3%、0.5 %，第三輪淘選產(chǎn)物測完滴度后隨機挑取噬菌體克隆進行擴 增。用lOOyg/yl MAb包板（150yl/孔），擴增后噬菌體作為一抗進行噬菌體ELISA反應(yīng)。對于 反應(yīng)呈陽性者進行測序。
[0028] 表1、陽性噬菌體測序結(jié)果分析和H9N2HA序列比對表
[0031] #-R-為差異氨基酸序列
[0032] 對比顯示其一致序列為ERSKIEFVK，與所用毒株的HA蛋白編碼氨基酸序 [0033]列比對發(fā)現(xiàn)其與aa507~aa515有7個氨基酸位點完全匹配，提示 [0034] 5Q7ERQKIEGVK515為HA抗原的一個線性表位。
[0035]實施例2本發(fā)明的禽流感H9N2亞型病毒HA蛋白線性抗原表位多肽在禽流感間接 ELISA法檢測流感病毒中的應(yīng)用：
[0036] 將合成多肽ERQKIEGVK稀釋成0. lyg/yl，按照100yl/孔包被ELISA板，以SPF雞血清 作為對照、禽流感疫苗免疫雞血清和禽流感病毒感染雞血清作為一抗，兔抗雞HRP-IgG作為 二抗，進行間接ELI SA驗證，(PD顯色后，于酶標(biāo)儀中讀取490nm處0D值，結(jié)果顯示合成多肽與 感染雞血清反應(yīng)后其0D值明顯高于對照組和免疫組。說明該合成多肽與感染雞血清有結(jié)合 特性，能夠用于禽流感病毒的診斷和檢測。
【主權(quán)項】
1. 一種禽流感病毒抗原表位多肽，其特征在于，所述抗原表位多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO:1〇2. -種核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸編碼權(quán)利要求1所述的抗原表位多肽。3. 如權(quán)利要求2所述的核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸的序列為SEQ ID NO:2。4. 一種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的重組表達(dá)載體攜帶有權(quán)利要求2所述的核苷 酸。5. -種重組宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的重組宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染有權(quán)利要求4所述 的重組表達(dá)載體。6. 權(quán)利要求1所述的抗原表位多肽在制備檢測禽流感病毒的制品中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/68GK105968174SQ201610321844
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】趙明, 凌紅麗, 劉曉婧, 薄中義, 楊光烈, 李明舉, 由佳
【申請人】青島蔚藍(lán)生物制品有限公司