一種重組抗病毒蛋白及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組抗病毒蛋白、一種編碼該重組抗病毒蛋白的核酸、一種包含該核酸的重組表達(dá)載體、一種包含該重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化體、一種制備該重組抗病毒蛋白的方法和該重組抗病毒蛋白在制備抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的藥物中的應(yīng)用。該重組抗病毒蛋白包括共價(jià)融合的位于N端的P9肽和位于C端的ISG20蛋白，P9肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明的重組抗病毒蛋白可以有效地抑制PRRSV的RNA的合成并阻斷PRRSV的復(fù)制，具有非常高的抗病毒能力和高度的靶標(biāo)特異性，同時(shí)對細(xì)胞的毒性非常低。
【專利說明】
一種重組抗病毒蛋白及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種重組抗病毒蛋白及其制備方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起，是家養(yǎng) 豬的常見病之一，通過損害家豬的免疫系統(tǒng)而使其致病。
[0003] 在之前，已經(jīng)獲得了15個(gè)可以抑制PRRSV聚合酶或解旋酶的肽段（Liu et al.， 2012)。在這些肽段中，P9多肽(氨基酸序列為:HRILMRIRQMMT)通過與病毒聚合酶結(jié)合而具 有強(qiáng)效抑制病毒的功能。P9是由12個(gè)氨基酸組成的肽段，半衰期很短，在臨床應(yīng)用中會被很 快地代謝降解掉。另一方面，P9雖然可以與PRRSV的聚合酶結(jié)合，但病毒的突變可大大降低 p9的抗病毒能力。
[0004] 現(xiàn)階段，商業(yè)化的針對PRRSV的疫苗的預(yù)防作用并不穩(wěn)定（Chand et al.，2012; Charerntantanakul ,2012)，特異性的抗PRRSV藥物還非常少，效果也達(dá)不到治療該病的目 的。在PRRSV的臨床治療中，急需要一種抗病毒效力高，穩(wěn)定有效且特異性高、細(xì)胞毒性小的 抗病毒試劑（Sun et al ?，2014;Wang and Zhang，2014;Wang et al ? ,2013)。因此，研發(fā)一 種新型的治療手段尤為關(guān)鍵（Sang et al.，2011;Wang and Christopher-Hennings,2012; Yun and Lee,2013)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在針對PRRSV的疫苗的預(yù)防效 果不穩(wěn)定，而化學(xué)抗病毒藥物特異性不高、且毒性較大的缺陷，提供了一種重組抗病毒蛋白 及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的重組抗病毒蛋白可以有效地抑制PRRSV的復(fù)制，具有非常 高的抗病毒能力和靶標(biāo)特異性，并且對宿主細(xì)胞的毒性非常低。
[0006] 本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究和反復(fù)的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)將特異性靶向PRRSV病毒聚合酶的 P9肽段和具有病毒核酸降解功能的ISG20蛋白融合，能夠?qū)烧叩目共《灸芰f(xié)同地結(jié)合 起來。已知ISG20蛋白的抗病毒PRRSV的能力是P9肽的1.37倍，與單獨(dú)使用ISG20相比，P9-ISG20的抗病毒PRRSV的能力提高了約1.9倍;具有特異性抗PRRSV病毒的優(yōu)異效果，從而完 成了本發(fā)明。
[0007] 因此，本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案之一:一種重組抗病毒蛋白，其包括共價(jià)融合的位于N端的P9肽 和位于C端的ISG20蛋白，所述P9肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。
[0009] 本發(fā)明中，所述P9肽的序列如序列表SEQ ID N0.1所示。所述ISG20蛋白為本領(lǐng)域 常規(guī)的IFN誘導(dǎo)基因編碼的蛋白，可以為本領(lǐng)域常規(guī)物種的ISG20蛋白，例如獼猴(Macaca mulatta)或豬(Sus scrofa)的ISG20蛋白。所述P9肽與所述ISG20蛋白可以通過本領(lǐng)域常規(guī) 的可折疊連接序列共價(jià)融合，例如地通過3 X GGGGS連接序列共價(jià)融合。
[0010] 本發(fā)明中，所述重組抗病毒蛋白還可以包括穿膜肽，所述穿膜肽可以共價(jià)融合于 所述重組抗病毒蛋白的N端。所述穿膜肽可以為本領(lǐng)域常規(guī)的穿膜肽，能夠不依賴胞吞作用 將大分子運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，包括天然的穿膜肽與人工合成的穿膜肽，例如HIV-1TAT穿膜肽、寡 聚精氨酸穿膜肽、plsl穿膜肽、Transportan穿膜肽和P-alpha穿膜肽，較佳地為HIV-1TAT穿 膜肽。所述HIV-1TAT穿膜肽的序列可以為本領(lǐng)域常規(guī)的序列，較佳地如序列表SEQ ID N0.6 所示。所述穿膜肽的拷貝數(shù)可以為一個(gè)到多個(gè)，較佳地為1個(gè)拷貝。
[0011] 本發(fā)明中，所述重組抗病毒蛋白還可以包括共價(jià)融合的蛋白標(biāo)簽，所述蛋白標(biāo)簽 可以為本領(lǐng)域常規(guī)的蛋白標(biāo)簽，如c-Myc、6 X Hi s、FLAG或EGFP。所述蛋白標(biāo)簽可以融合于所 述重組抗病毒蛋白的N端、C端或融合于所述重組抗病毒蛋白中的所述P9肽與所述ISG20蛋 白之間。所述蛋白標(biāo)簽與所述重組抗病毒蛋白之間可以通過本領(lǐng)域常規(guī)的可折疊連接序列 共價(jià)融合，例如通過3 XGGGGS連接序列共價(jià)融合。所述蛋白標(biāo)簽的拷貝數(shù)可以為一個(gè)到多 個(gè)，如1個(gè)拷貝。
[0012] 在本發(fā)明一較佳的實(shí)施方案中，所述重組抗病毒蛋白的P9肽和獼猴（Macaca mulatta)ISG20蛋白之間融合有1個(gè)拷貝的EGFP蛋白，所述EGFP蛋白通過3XGGGGS連接序列 共價(jià)融合。
[0013]在本實(shí)施方案中，所述重組抗病毒蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
[0014]在本發(fā)明一進(jìn)一步較佳的實(shí)施方案中，所述重組抗病毒蛋白的N端融合有1個(gè)拷貝 的HIV-1TAT穿膜肽，所述P9肽和所述獼猴(Macaca mulatta)ISG20蛋白之間融合有1個(gè)拷貝 的EGFP蛋白，所述HIV-1TAT穿膜肽與所述EGFP蛋白均通過3 XGGGGS連接序列共價(jià)融合。 [0015]在本實(shí)施方案中，所述重組抗病毒蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.3所示。
[0016] 本發(fā)明的技術(shù)方案之二:一種編碼如前所述重組抗病毒蛋白的核酸。
[0017] 本發(fā)明中，所述核酸的序列較佳地如序列表SEQ ID N0.4所示，其編碼序列如序列 表SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列，更佳地如序列表SEQ ID N0.5所示，其編碼序列如序列 表SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列。
[0018]本發(fā)明技術(shù)方案之三:一種包含前述核酸的重組載體。
[0019] 本發(fā)明中，所述重組載體可通過本領(lǐng)域常規(guī)的方法獲得，如將前述核酸分子連接 到各種載體上獲得。所述載體較佳地為表達(dá)載體，所述表達(dá)載體可以為本領(lǐng)域常規(guī)的各種 表達(dá)載體，如原核表達(dá)載體或真核表達(dá)載體，如pET28、pCDNA3.1或pIVEX-His Tag，較佳地 為PCDNA3.1或pIVEX-His Tag。
[0020] 本發(fā)明技術(shù)方案之四：一種包含前述重組載體的轉(zhuǎn)化體。
[0021] 本發(fā)明中，所述轉(zhuǎn)化體的制備方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，如將前述重組載體 導(dǎo)入宿主細(xì)胞中或轉(zhuǎn)化至宿主微生物中制得。所述宿主細(xì)胞可以為本領(lǐng)域常規(guī)的各種細(xì) 胞，如人細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞或豬細(xì)胞，只要能滿足使前述重組表達(dá)載體穩(wěn)定地自行 復(fù)制、使被編碼的所述抗病毒重組蛋白有效表達(dá)即可，較佳地為豬細(xì)胞MARC-145。所述導(dǎo)入 的方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的將載體導(dǎo)入到細(xì)胞中的方法，如用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染。所述宿主微 生物可以為本領(lǐng)域常規(guī)的各種宿主微生物，只要能滿足使前述重組表達(dá)載體穩(wěn)定地自行復(fù) 制、使被編碼的所述抗病毒重組蛋白有效表達(dá)即可，較佳地為大腸桿菌(E.coli)。所述轉(zhuǎn)化 的方法可以為本領(lǐng)域常規(guī)的將載體轉(zhuǎn)化到微生物中的方法，如電轉(zhuǎn)法或化學(xué)轉(zhuǎn)化法。
[0022] 本發(fā)明技術(shù)方案之五:一種制備前述重組抗病毒蛋白的方法，所述方法包括以下 步驟:將含有編碼如前所述重組抗病毒蛋白的核酸的表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)。
[0023] 本發(fā)明中，所述表達(dá)可以為本領(lǐng)域常規(guī)的表達(dá)，如在原核體系中表達(dá)、在真核體系 中表達(dá)、或在無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，較佳地為在無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。所述無細(xì)胞表達(dá) 系統(tǒng)可以為本領(lǐng)域常規(guī)的無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，較佳地為購自天根生化有限公司的無細(xì)胞表達(dá) 系統(tǒng)（RTS pIVEX Wheat Germ His6-tag Set)，其包括無細(xì)胞表達(dá)載體pIVEX-His Tag。
[0024] 本發(fā)明技術(shù)方案之六:前述重組抗病毒蛋白在制備抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的 藥物中的應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明中，所述抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的藥物包括前述重組抗病毒蛋白和藥 學(xué)可接受的載體。所述的藥學(xué)可接受的載體為本領(lǐng)域常規(guī)的載體，所述的載體可以為任意 合適的生理學(xué)或藥學(xué)上可接受的藥物輔料。所述的藥物輔料為本領(lǐng)域常規(guī)的藥物輔料，較 佳地包括藥學(xué)上可接受的賦形劑、填充劑或稀釋劑等。更佳地，所述的藥物組合物包括0.01 ~99.99 %的上述蛋白質(zhì)和0.01~99.99 %的藥用載體，所述百分比為占所述藥物組合物的 質(zhì)量百分比。
[0026] 本發(fā)明中，所述藥物的給藥途徑較佳地為腸胃外施用、注射給藥或口服給藥。所述 注射給藥較佳地包括靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮內(nèi)注射或皮下注射等途徑。所述的 藥物組合物為本領(lǐng)域常規(guī)的各種劑型，較佳地為固體、半固體或液體的形式，即可以為水 溶液、非水溶液或混懸液，更佳地為片劑、膠囊、顆粒劑、注射劑或輸注劑等。更佳地為經(jīng)由 血管內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)施用。較佳地，所述藥物組合物還可以作為氣霧劑或粗噴霧劑 施用，即經(jīng)鼻施用;或者，鞘內(nèi)、髓內(nèi)或心室內(nèi)施用。更佳地，所述的藥物組合物還可以透皮、 經(jīng)皮、局部、腸內(nèi)、陰道內(nèi)、舌下或經(jīng)直腸施用。
[0027] 本發(fā)明中，所述藥物的給藥劑量水平可以根據(jù)達(dá)到所需診斷或治療結(jié)果的組合物 量而調(diào)整。施用方案也可以為單次注射或多次注射，或進(jìn)行調(diào)整。所選擇的劑量水平和方案 依賴于包括所述藥物的活性和穩(wěn)定性（即，半衰期）、制劑、施用途徑、與其他藥物或治療的 組合、待檢測和/或治療的疾病或病癥、以及待治療的受試者的健康狀況和先前醫(yī)療史等各 種因素而進(jìn)行合理地調(diào)整。
[0028] 本發(fā)明的所述藥物的治療有效劑量可以最初在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)或動物模型例如嚙 齒類動物、兔、犬、豬和/或靈長類動物中進(jìn)行估計(jì)。動物模型也可以用于測定合適的施用濃 度范圍和途徑。一般地，施用有效量或劑量的確定和調(diào)整以及何時(shí)和如何進(jìn)行此類調(diào)整的 評估為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。
[0029] 在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0030] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0031] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:本發(fā)明的重組抗病毒蛋白可以有效地抑制PRRSV的 RNA的合成并阻斷PRRSV的復(fù)制，具有非常高的抗病毒能力，在2pmol的用量水平下即呈現(xiàn)出 非常高的抗PRRSV的效果，并且具有高度的靶標(biāo)特異性，同時(shí)對細(xì)胞的毒性非常低。
【附圖說明】
[0032] 以下結(jié)合【附圖說明】本發(fā)明的特征和有益效果。
[0033] 圖1為重組抗病毒蛋白P9-ISG20克隆的設(shè)計(jì)圖。P9與ISG20之間加入EGFP以及兩個(gè) 3 X (GGGGS)連接序列，構(gòu)成P9-ISG20的融合表達(dá)框。
[0034] 圖2為重組抗病毒蛋白pcDNA-P9-EGFP-ISG20表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0035] 圖3為重組抗病毒蛋白TAT-P9-EGFP-ISG20克隆的設(shè)計(jì)圖。P9與ISG20之間加入 EGFP以及兩個(gè)3 X (GGGGS)連接序列，在端加上HIV-1TAT穿膜肽，構(gòu)成TAT-P9-EGFP-ISG20的融合表達(dá)框。
[0036] 圖4為重組抗病毒蛋白TAT-P9-EGFP-ISG20表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0037] 圖5 (圖5A~圖5E)為重組抗病毒蛋白P9-EGFP-ISG20抑制PRRSV感染的結(jié)果圖。
[0038] 圖6為重組抗病毒蛋白P9-EGFP-ISG20和PRRSV聚合酶的免疫熒光共定位圖。
[0039] 圖7為雙分子熒光互補(bǔ)檢測重組抗病毒蛋白P9-EGFP-ISG20與PRRSV聚合酶相互作 用結(jié)果圖。
[0040] 圖8為重組抗病毒蛋白P9-ISG20抑制PRRSV正鏈RNA與負(fù)鏈RNA合成的結(jié)果圖。
[00411圖9為重組抗病毒蛋白TAT-P9-ISG20抑制PRRSV復(fù)制及其自身進(jìn)入細(xì)胞能力的檢 測結(jié)果圖。
[0042] 圖10為重組抗病毒蛋白P9-ISG20和重組抗病毒蛋白TAT-P9-ISG20的細(xì)胞毒性MTT 檢測結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí) 施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0044] 本發(fā)明所用到的細(xì)胞和試劑來源如下：
[0045] MARC-145細(xì)胞購自美國ATCC
[0046] 胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司
[0047] P9肽、EGFP和獼猴(Macaca mulatta)ISG20基因由南京金斯瑞公司合成；
[0048] PrimeScript ? reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒與SYBR Premix Ex Taq?貝勾自TaKaRa 公司；
[0049] 退火緩沖液:購自碧云天(Beyotime)公司；
[0050]無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng):購自天根生化。
[0051]若無特別說明，實(shí)施例中的百分比的含義為體積百分比。
[0052]實(shí)施例1重組抗病毒蛋白P9-ISG20表達(dá)載體的構(gòu)建
[0053] 本實(shí)施例構(gòu)建一個(gè)新的克隆 P9-Linker-EGFP-Linker-ISG20(P9-ISG20)，該克隆 將P9與ISG20相融合，構(gòu)建于p⑶NA3.1( + )真核表達(dá)載體上。為了熒光檢測實(shí)驗(yàn)，EGFP基因與 ISG20的N端末尾通過兩個(gè)連接序列3 X (GGGGS)相連接，具體的克隆的設(shè)計(jì)圖如圖1所示。構(gòu) 建方法如下：
[0054] 1)構(gòu)建pcDNA-P9質(zhì)粒載體
[0055] 將P9正向和反向引物利用退火結(jié)合的方法構(gòu)建出P9基因，P9正向引物和反向引物 如下所示(其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.7~8所示）：
[0056] P9正向引物：
[0057] 5，-AGCTTCACATCAGGCTGACATTGAGCAGAAATAAGAACACCG-3，
[0058] P9反向引物：
[0059] 5 '-AATTCGGTGTTCTTATTTCTGCTCAATGTCAGCCTGATGTGA-3 '
[0060]使用退火緩沖液根據(jù)碧云天退火緩沖液操作說明書進(jìn)行退火操作，獲得P9基因后 通過酶切位點(diǎn)Hindlll與EcoRI將其克隆至載體pCDNA3.1 ( + )即得。
[0061 ] 2)構(gòu)建 pCDNA-P9-EGFP-ISG20 表達(dá)載體
[0062] 用ISG20正向引物與反向引物通過PrimeSTAR PCR根據(jù)寶生物公司PrimeSTAR高保 真酶說明書擴(kuò)增出ISG20基因，ISG20正向引物和反向引物如下所示（其核苷酸序列如序列 表SEQ ID吣.9~10所示）：
[0063] ISG20正向引物：5 ' -AAGCTTATGGCTGGGAGCCGTGAGGT-3 '
[0064] ISG20反向引物：5 ' -GAATTCTCAGTCTGACACAGCCAGGC-3 '
[0065] 根據(jù)艾思進(jìn)生物公司膠回收試劑盒說明書純化回收目的基因片段，根據(jù)同源重 組試劑盒說明書以同源重組方法將目的片段克隆至前述質(zhì)粒PCDNA-P9中，同源重組時(shí)不需 要酶切位點(diǎn)參與，連接后P9-ISG20基因兩端酶切位點(diǎn)仍為Hindlll-EcoRI;形成質(zhì)粒名稱為 PCDNA-P9-EGFP-ISG20。
[0066] 3)構(gòu)建 pcDNA-P9-EGFP-ISG20 表達(dá)載體
[0067]用引物F2與R2退火擴(kuò)增得到片段f2,用F3與R3以pEGFP-Nl為模板擴(kuò)增得到片段 f3，用F4與R4退火擴(kuò)增得到片段f 4，用F5與R1以MonkeyCDNA為模板擴(kuò)增得到片段f 5，將片段 f2、f3、f4與f5混合，根據(jù)同源重組試劑盒說明書以同源重組方法進(jìn)行重組，用F1和R1進(jìn)行 擴(kuò)增，同源部分相連得到目的片段。引物？1、1?^2、1?2、？3、1?3、？4、1?4和？5的序列如下所示 (其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 11~19所示）：
[0077]目的片段通過Hindlll與EcoRI位點(diǎn)使用同源重組試劑盒通過同源重組被克隆到 pCDNA3.1 ( + )上，得表達(dá)載體pcDNA-P9-EGFP-ISG20，其結(jié)構(gòu)如圖2所示。
[0078] 實(shí)施例2重組抗病毒蛋白TAT-P9-ISG20表達(dá)載體的構(gòu)建
[0079]以實(shí)施例1構(gòu)建的pcDNA-P9-EGFP-ISG20質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)含有TAT基因序列的引 物，使用同源重組試劑盒通過同源重組方法將TAT連接進(jìn)入P9-EGFP-ISG20基因 N端，擴(kuò)增引 物如下(其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 20~21所示）：
[0080] 上游引物：
[0081 ] 5 '-AAGCTTTATGGCAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGACACATCA-3，
[0082]下游引物：
[0083] 5 '-GAATTCTCAGTCTGACACAGCCAGGCGGGGCAGCCCTCGGCGG-3，
[0084] 純化回收擴(kuò)增的TAT-P9-EGFP-ISG20基因，以實(shí)施例1中同源重組方法將目的基因 TAT-P9-EGFP-ISG20基因克隆至無細(xì)胞表達(dá)載體pIVEX-HisTag，得到表達(dá)載體pIVEX TAT-P9-EGFP-ISG2(LpIVEX-HiS Tag為本發(fā)明實(shí)施例所用到的無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中所附帶的表達(dá) 質(zhì)粒。
[0085]重組抗病毒蛋白TAT-P9-ISG20表達(dá)載體的克隆的設(shè)計(jì)圖如圖3所示；重組抗病毒 蛋白TAT-P9-EGFP-ISG20表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖如圖4所示。
[0086] 實(shí)施例3重組抗病毒蛋白P9-ISG20對PRRSV病毒感染的抑制
[0087] (1)培養(yǎng)MARC-145細(xì)胞，鋪細(xì)胞至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞生長至70%時(shí)待用；
[0088] (2)轉(zhuǎn)染實(shí)施例1構(gòu)建的重組抗病毒蛋白P9-ISG20表達(dá)載體、作為對照的P9和 ISG20表達(dá)載體及空載;具體步驟如下：將50微升1640RIPM無血清培養(yǎng)基與2微升轉(zhuǎn)染試劑 (脂質(zhì)體2000)混合均勻。將50微升1640RIPM無血清培養(yǎng)基與0.5微克表達(dá)質(zhì)粒載體混合均 勻。將轉(zhuǎn)染試劑和表達(dá)質(zhì)粒載體混合均勻，室溫放置5分鐘，然后直接加入細(xì)胞孔中，37 °C培 養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；
[0089] (3)轉(zhuǎn)染后24小時(shí)后，棄去細(xì)胞孔內(nèi)液體，用1640RIPM無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次。 向細(xì)胞孔內(nèi)加入PRRSV病毒(病毒計(jì)量MOI 0.1)，37°C培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)，孵育完成后棄去 病毒液，用1640RIPM無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次，然后每孔中加入500微升含2 %胎牛血清 的1640RIPM培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，收集細(xì)胞樣品檢測；
[0090] (4)熒光定量PCR法檢測抗病毒能力：Trizol法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，用PrimeScript ? reagent Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，GAPDH作為內(nèi)參。反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA樣品加入SYBR Premix Ex Taq ?，利用一步法反應(yīng)，用于實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)檢測。反應(yīng)結(jié)果的熒光相對變化用2_aact 方法進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的形式體現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次。用于熒光實(shí)時(shí)定 量PCR的引物如表1所示(其核苷酸序列依次如序列表SEQ ID No.22~31所示）；
[0091]表1用于熒光實(shí)時(shí)定量PCR的引物
[0092]
[0093] (5)通過TCID50法對細(xì)胞內(nèi)病毒的含量進(jìn)行定量比較，具體為：取96孔細(xì)胞培養(yǎng) 板，每個(gè)孔大約傳8000~10000個(gè)細(xì)胞。每個(gè)孔的細(xì)胞長至大約60%即可開始測定實(shí)驗(yàn)。在 ep管中用無血清的培養(yǎng)基1〇倍倍比稀釋病毒原液，如等，根據(jù)病毒大致的 滴度確定稀釋的倍數(shù)。首次滴定可以多稀釋幾個(gè)滴度。根據(jù)接種的孔數(shù)稀釋病毒，每個(gè)稀釋 度接種8孔。取細(xì)胞培養(yǎng)板，用多道加樣器(排槍)吸去96孔板中的培養(yǎng)液，吸取孵育液加在 每孔中再輕輕吹打一次。將稀釋好的病毒液加到96孔板上，每孔100微升，37°C培養(yǎng)箱中孵 育2小時(shí)，取出細(xì)胞板吸去病毒液，加入含2%胎牛血清培養(yǎng)基200微升，繼續(xù)在37°(：、0) 2培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天后，取出培養(yǎng)板，顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，記錄病變孔，用Reed-Muench公 式計(jì)算TCID50值。
[0094] 結(jié)果如圖5A和圖5B所示，圖5A和圖5B表明重組抗病毒蛋白P9-ISG20對PRRSV具有 非常顯著抗病毒能力，與P9和ISG20相比抗病毒效果均有顯著提高。
[0095]實(shí)施例4重組抗病毒蛋白P9-ISG20對PRRSV的時(shí)間依賴效應(yīng)和劑量依賴效應(yīng)
[0096] 針對時(shí)間依賴效應(yīng)，按實(shí)施例3中的方法進(jìn)行表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染，然后接種病毒。 接毒后的24小時(shí)和48小時(shí)分別收樣，然后實(shí)時(shí)定量檢測。針對劑量依賴效應(yīng)，轉(zhuǎn)染時(shí)加入每 孔中的表達(dá)質(zhì)粒載體量分為不同劑量，分別是0.1、0.5、1.0、2.0、3.0微克/孔，接毒和培養(yǎng) 方法同前述，接毒后24小時(shí)收集細(xì)胞樣品檢測，檢測方法同實(shí)施例3。
[0097] 結(jié)果如圖5D和圖5E所示，圖?表明P9-ISG20在24小時(shí)和48小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)內(nèi)均能夠 有效抑制PRRSV病毒的復(fù)制，圖5E表明重組抗病毒蛋白P9-ISG20對PRRSV的抑制呈現(xiàn)劑量依 賴性，2pmol的劑量下呈現(xiàn)出非常高的抗病毒能力，但進(jìn)一步提高濃度卻并不能提升抗病毒 效果。
[0098]實(shí)施例5免疫熒光法間接檢測重組抗病毒蛋白P9-ISG20對PRRSV的抑制 [0099]鋪2 X 106個(gè)細(xì)胞至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長至匯合度為60%開始轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染 步驟為：混合8微升脂質(zhì)體2000和2.0微克pcDNA-P9-EGFP-ISG20表達(dá)載體，直接加入細(xì)胞 中，繼續(xù)在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。然后將細(xì)胞接種病毒(MOI 0.1)，37°C培養(yǎng)箱中孵育2 小時(shí)后棄去病毒液，加入含2 %胎牛血清的1640RIPM培養(yǎng)基2毫升，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí);取出細(xì) 胞培養(yǎng)板，去掉細(xì)胞上清，PBS洗滌1次，4% (v/v)多聚甲醛固定細(xì)胞1小時(shí)。在細(xì)胞中加入 PRRSV N蛋白抗體孵育2小時(shí)，PBS洗滌細(xì)胞3次，加入紅色熒光二抗孵育2小時(shí)，PBS洗滌細(xì)胞 3次，加入DAPI細(xì)胞核染料孵育15分鐘，PBS洗滌細(xì)胞5次，顯微鏡觀察細(xì)胞熒光。
[0100] 結(jié)果如圖5C所示。圖5C表明在重組抗病毒蛋白P9-ISG20沒有表達(dá)的細(xì)胞中，病毒N 蛋白的表達(dá)量很高;而在重組抗病毒蛋白P9-ISG20過表達(dá)的細(xì)胞中幾乎檢測不到任何病毒 N蛋白的表達(dá)，說明在重組抗病毒蛋白P9-ISG20過表達(dá)的細(xì)胞中，PRRSV的復(fù)制可以得到抑 制。
[0101] 實(shí)施例6重組抗病毒蛋白P9-ISG20與PRRSV聚合酶的共定位
[0102] 鋪2X106個(gè)細(xì)胞至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長至匯合度為70%開始轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
[0103] 轉(zhuǎn)染步驟為：混合8微升脂質(zhì)體2000和2.0微克pcDNA-P9-EGFP-ISG20表達(dá)載體及 2.0微克pFlag-PRRSV polymerase-mCherry表達(dá)質(zhì)粒，直接加入上述細(xì)胞中，繼續(xù)在37°C培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時(shí)。PBS洗滌細(xì)胞三次，向細(xì)胞加入DAPI染色液，染色10分鐘，PBS洗滌細(xì)胞 五次，焚光顯微鏡觀察。
[0104] 結(jié)果如圖6中A所示，帶EGFP標(biāo)簽的重組抗病毒蛋白P9-ISG20在細(xì)胞中發(fā)綠色熒光 (上圖），帶mCherry標(biāo)簽的PRRSV聚合酶在細(xì)胞中法紅色熒光表達(dá)（中圖），疊加圖顯示兩者 在細(xì)胞質(zhì)中的熒光呈共定位表達(dá)，呈黃色熒光（下圖），說明重組抗病毒蛋白P9-ISG20與 PRRSV聚合酶在細(xì)胞質(zhì)中共定位，兩者之間有相互作用。
[0105] 實(shí)施例7重組抗病毒蛋白P9-ISG20、PRRSV聚合酶與PRRSV病毒RNA的共定位 [0106]鋪2 X 106細(xì)胞至6T細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長至匯合度為60 %開始轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟為： 混合8微升脂質(zhì)體2000和2.0微克表達(dá)質(zhì)粒載體，直接加入細(xì)胞中，繼續(xù)在37°C培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)24小時(shí)。將細(xì)胞接種病毒(M0I 0.1)，37°C培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)，然后棄去病毒液，加入含 2% (w/w)胎牛血清的1640RIPM培養(yǎng)基2毫升，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；取出細(xì)胞培養(yǎng)板，去掉細(xì)胞 上清，PBS洗滌1次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞1小時(shí)。在細(xì)胞中加入帶藍(lán)色熒光的PRRSV GP7基 因探針孵育2小時(shí)，PBS洗滌細(xì)胞5次，顯微鏡觀察細(xì)胞熒光。
[0107] 結(jié)果如圖6中B所示，帶EGFP標(biāo)簽的重組抗病毒蛋白P9-ISG20在細(xì)胞中發(fā)綠色熒 光，帶mCherry標(biāo)簽的PRRSV聚合酶在細(xì)胞中發(fā)紅色熒光表達(dá)，病毒GP7核酸被探針檢測到后 發(fā)藍(lán)色熒光，疊加圖顯示兩者在細(xì)胞質(zhì)中的熒光呈共定位表達(dá)，呈白色熒光，說明PRRSV聚 合酶在催化病毒核酸復(fù)制的時(shí)候，P9-ISG20能夠結(jié)合到PRRSV聚合酶與核酸發(fā)生反應(yīng)的位 置。
[0108] 實(shí)施例8雙分子熒光互補(bǔ)檢測重組抗病毒蛋白P9-ISG20與PRRSV聚合酶的特異性 相互作用
[0109] 雙分子焚光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)（BiFC)實(shí)驗(yàn)步驟如Shimozono，S.，Miyawaki，A.， 2008.Engineering FRET constructs using CFP and YFP.Methods Cell Biol.85,381-393.-文中所述，綠色熒光蛋白Venus被分為N端氨基酸序列（1-173，VN)與C端氨基酸序列 (174-239，￥〇，￥1〇^1?1?￥的聚合酶與螺旋酶相融合，￥(：與重組抗病毒蛋白？9-13620與？9-ISG20的陰性對照Scramble P9-ISG20融合，如圖7中A的示意圖所示。將MARC-145細(xì)胞在六 孔板里培養(yǎng)至60%密度時(shí)，將VN、VC與上述融合蛋白的表達(dá)載體按圖7中B的組合方式用 lipofectamine 2000轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染14小時(shí)后將細(xì)胞用roS洗滌細(xì)胞1次，4%多聚甲醛固 定細(xì)胞1小時(shí)，然后在熒光顯微鏡下進(jìn)行鏡檢。
[0110] 結(jié)果如圖7中B所示，VN和VC蛋白在沒有連接其他蛋白時(shí)，不會發(fā)生結(jié)合，因此沒有 出現(xiàn)綠色熒光。在VN連接病毒的解螺旋酶蛋白和VC連接P9-ISG20蛋白時(shí)，以及VN連接病毒 聚合酶蛋白和VC連接無序P9-ISG20蛋白時(shí)，都沒有出現(xiàn)結(jié)合而產(chǎn)生綠色熒光。當(dāng)VN連接病 毒聚合酶和VC連接P9-ISG20蛋白共同表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)時(shí)，由于P9-ISG20與病毒聚合酶的親和 力使VN和VC蛋白發(fā)生結(jié)合，從而組成完整的EGFP蛋白發(fā)出綠色熒光。
[0111] 實(shí)施例9重組抗病毒蛋白P9-ISG20抑制PRRSV正鏈與負(fù)鏈RNA的合成
[0112] 本實(shí)施例的操作步驟與實(shí)施例3的步驟(4)一致，所使用的引物也請見于表1。
[0113] 結(jié)果如圖8所示，過表達(dá)重組抗病毒蛋白P9-ISG20后PRRSV的正鏈RNA與負(fù)鏈RNA的 水平均有顯著下降，說明重組抗病毒蛋白P9-ISG20能夠有效抑制PRRSV的正鏈RNA與負(fù)鏈 RNA的合成。
[0114] 實(shí)施例10重組抗病毒蛋白TAT-P9-EGFP-ISG20對PRRSV病毒感染的抑制
[0115] (1)將MARC-145細(xì)胞鋪至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，長至匯合度為70 %左右，感染PRRSV病 毒(M0I 0.1)，37°C培養(yǎng)箱孵育2小時(shí)，換2% (w/w) 1640RIPM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；
[0116] (2)利用無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)根據(jù)說明書利用實(shí)施例2所構(gòu)建的無細(xì)胞表達(dá)載體 口1￥￡父-丁厶1'-?9-￡6卩?-1562〇41￥￡父-丁厶1'、口1￥￡父-?9-￡6卩卩-15620、體外表達(dá)不同的目的蛋白， BCA法測定目的蛋白濃度；
[0117] (3)向接毒后的細(xì)胞加入不同濃度的上述不同目的蛋白（各目的蛋白的濃度分別 為：10、25、50、100或250μg/ml)，加入蛋白后24小時(shí)收集細(xì)胞樣品，實(shí)時(shí)定量檢測；
[0118] (4)熒光定量PCR法檢測抗病毒能力：Trizol法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，用PrimeScript ? reagent Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，GAPDH作為內(nèi)參。反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA樣品加入SYBR Premix Ex Taq ?，利用一步法反應(yīng)，用于實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)檢測。反應(yīng)結(jié)果的熒光相對變化用2_aact 方法進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的形式體現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次。用于熒光實(shí)時(shí)定 量PCR的引物也參見表1。
[0119] 結(jié)果如圖9中A所示，對照的TAT蛋白對病毒的復(fù)制沒有產(chǎn)生顯著影響，P9-EGFP-ISG20蛋白在沒有TAT轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白幫助時(shí)，其抗病毒能力低于TAT-P9-EGFP-ISG20蛋白，TAT-P9-ISG20的抗病毒能力顯著高于其他2個(gè)對照蛋白，與P9-EGFP-ISG20蛋白相比，帶有TAT轉(zhuǎn) 導(dǎo)序列的TAT-P9-EGFP-ISG20抗病毒能力提高了約1 ? 52倍。
[0120] 實(shí)施例11重組抗病毒蛋白TAT-P9-EGFP-ISG20對PRRSV的時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)
[0121] (1)將MARC-145細(xì)胞鋪至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，長至匯合度為70 %左右，感染PRRSV病 毒(M0I 0.1)，37°C培養(yǎng)箱孵育2小時(shí)，換2% (w/w) 1640RIPM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)；
[0122] (2)利用無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)TAT-P9-EGFP-ISG20蛋白和TAT對照蛋白，BCA法 測定目的蛋白濃度，收獲目的蛋白溶液放_80°C保存；
[0123] (3)向接毒后的細(xì)胞加入不同濃度的TAT-P9-EGFP-ISG20目的蛋白和TAT對照蛋 白，加入蛋白后24小時(shí)和48小時(shí)分別收集細(xì)胞樣品，實(shí)時(shí)定量檢測；
[0124] (4)熒光定量PCR法檢測抗病毒能力：Trizol法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，用PrimeScript ? reagent Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，GAPDH作為內(nèi)參。反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA樣品加入SYBR Premix Ex Taq ?，利用一步法反應(yīng)，用于實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)檢測。反應(yīng)結(jié)果的熒光相對變化用2_aact 方法進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的形式體現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次。用于熒光實(shí)時(shí)定 量PCR的引物如表1所示。
[0125] 結(jié)果如圖9中B和圖9中C所示，圖9中B表明TAT-P9-EGFP-ISG20蛋白具有長效的抗 病毒的能力，抑制病毒的能力在24小時(shí)和48小時(shí)均能產(chǎn)生作用；圖9中C表明重組抗病毒蛋 白TAT-P9-EGFP-ISG20對PRRSV的抑制呈現(xiàn)劑量依賴性，100μg/ml的劑量下呈現(xiàn)出非常高的 抗病毒能力，但進(jìn)一步提高濃度卻并不能提升抗病毒效果。
[0126] 實(shí)施例12免疫熒光法檢測重組抗病毒蛋白TAT-P9-EGPF-ISG20細(xì)胞進(jìn)入能力
[0127] (1)利用無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)體外表達(dá)TAT-P9-EGFP-ISG20蛋白和P9-EGFP-ISG20蛋 白，BCA法測定目的蛋白濃度，收獲目的蛋白溶液放-80°C保存；
[0128] (2)將Marc-145細(xì)胞鋪至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，長至匯合度為70%，向細(xì)胞內(nèi)加入100y g/ml或250μg/ml終濃度的表達(dá)蛋白，37°C培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1小時(shí)后取出細(xì)胞，PBS洗滌3次以 去除細(xì)胞上清中殘留蛋白。
[0129] (3)使用帶熒光檢測功能的檢測儀器檢測細(xì)胞內(nèi)EGFP的熒光值，每孔讀值3次，計(jì) 算平均值。
[0130]結(jié)果如圖9中D所示，隨著重組抗病毒蛋白的劑量的升高，胞內(nèi)EGFP熒光值也有顯 著地上升，表明重組抗病毒蛋白TAT-P9-EGFP-ISG20進(jìn)入細(xì)胞的量隨著蛋白劑量的加大而 升高。HIV-1TAT穿膜肽將重組抗病毒蛋白P9-ISG20進(jìn)入細(xì)胞的能力提高了約1.57倍。
[0131] 實(shí)施例13重組抗病毒蛋白TAT-P9-EGFP-ISG20和P9-EGFP-ISG20的細(xì)胞毒性檢測
[0132] 本實(shí)施例的細(xì)胞毒性檢測方法按照常規(guī)的MTT法進(jìn)行(Chen et al. ,2008)。按照 前述方法，利用無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)TAT-P9-EGFP-ISG20和P9-EGFP-ISG20蛋白，用肌^口-(4，5-dimethylthiazol_2-yl )_2，5-diphenyltetrazolium bromide]的方法檢測CC50，即 將MARC-145細(xì)胞用200ylDMEM培養(yǎng)基在96孔板中培養(yǎng)，接下來將培養(yǎng)基吸掉換成MTT溶液 (PBS中5mg/ml)。處理四個(gè)小時(shí)之后甲瓚形成，將MTT溶液移除。接下來每個(gè)孔中加入DMS0溶 解細(xì)胞表面的甲瓚。含有甲瓚的樣品用酶標(biāo)儀測量其在590nm波長的吸光值。
[0133] 結(jié)果如圖10所示，重組抗病毒蛋白TAT-P9-ISG20的CC5Q = 462.7μg/ml，重組抗病毒 蛋白P9-EGFP-ISG20的CC5〇 = 648.8μg/ml，兩者對細(xì)胞的毒性都非常低，且重組抗病毒蛋白 TAT-P9-EGFP-ISG20對細(xì)胞的毒性比P9-EGFP-ISG20對細(xì)胞的毒性更低，說明重組抗病毒蛋 白TAT-P9-EGFP-ISG20可以作為潛在低細(xì)胞毒性藥物加以應(yīng)用。
[0134] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對 本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組抗病毒蛋白，其特征在于，其包括共價(jià)融合的位于N端的P9肽和位于C端的 ISG20蛋白，所述P9肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。2. 如權(quán)利要求1所述重組抗病毒蛋白，其特征在于，所述ISG20蛋白為獼猴(Macaca mulatta)或豬(Sus scrofa)的ISG20蛋白；和/或，所述P9肽與所述ISG20通過3 )(GGGGS連接 序列共價(jià)融合。3. 如權(quán)利要求1所述重組抗病毒蛋白，其特征在于，所述重組抗病毒蛋白還包括穿膜 肽，所述穿膜肽共價(jià)融合于所述重組抗病毒蛋白的N端，所述穿膜肽的序列較佳地如SEQ ID NO.6所示，所述穿膜肽的拷貝數(shù)較佳地為1個(gè)拷貝。4. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述重組抗病毒蛋白，其特征在于，所述重組抗病毒蛋白還 包括共價(jià)融合的蛋白標(biāo)簽，所述蛋白標(biāo)簽較佳地為6 X His或EGFP，所述蛋白標(biāo)簽較佳地融 合于所述重組抗病毒蛋白的N端、C端或融合于所述重組抗病毒蛋白中的所述P9肽與所述 ISG20蛋白之間。5. 如權(quán)利要求4所述重組抗病毒蛋白，其特征在于，所述重組抗病毒蛋白的氨基酸序列 如序列表SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。6. -種編碼如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述重組抗病毒蛋白的核酸。7. 如權(quán)利要求6所述核酸，其特征在于，所述核酸的序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5 所示。8. -種包含如權(quán)利要求6或7所述核酸的重組載體。9. 一種包含如權(quán)利要求8所述重組載體的轉(zhuǎn)化體。10. -種制備如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述重組抗病毒蛋白的方法，其特征在于，所述 方法包括以下步驟:將如權(quán)利要求6或7所述核酸的表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)。11. 如權(quán)利要求10所述方法，其特征在于，所述表達(dá)為在無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。12. 如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述重組抗病毒蛋白在制備抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒 的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K19/00GK105968211SQ201610340303
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月23日
【發(fā)明人】馬志永, 劉珂, 侯鳳香, 邵東華, 魏建超, 李蓓蓓, 邱亞峰, 史子學(xué), 繆德年, 馬改妮, 郇貝麗, 王飛飛
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所