一種自發(fā)熒光納米凝膠及其制備方法與應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種自發(fā)熒光的納米凝膠及其制備方法與應用。本發(fā)明通過聯(lián)用反相納米沉淀法和光控“四唑?烯”點擊化學方法制備納米凝膠，使用的“四唑?烯”點擊化學交聯(lián)法具有專一性強、高效快速、無需催化劑等優(yōu)點，這能有效維持包載的藥物和蛋白質的生物活性，在藥物控制釋放載體等領域中具有很好的應用前景。本發(fā)明公開的納米凝膠的交聯(lián)方法具有很強的選擇性，與包載的藥物，尤其是蛋白質藥物和細胞不反應，能很好的保持藥物、蛋白質和細胞的功效，實現(xiàn)完全、可控的釋放，從而可作為蛋白質和藥物的優(yōu)良緩釋載體；到達病灶處，納米凝膠緩釋藥物，達到切實有效的治療效果，不會造成現(xiàn)有技術中藥物浪費的問題。
【專利說明】
一種自發(fā)熒光納米凝膠及其制備方法與應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種納米凝膠的制備方法及應用，具體涉及一種基于聚合物四唑衍生 物和含甲基丙烯酸酯基團交聯(lián)劑的納米凝膠制備方法，以及該納米凝膠在醫(yī)藥領域的應 用。
【背景技術】
[0002] 在過去幾十年，基于抗體、細胞因子、酶以及轉錄因子的蛋白質藥物已被廣泛地用 于糖尿病、心血管疾病和惡性腫瘤等疾病的高效治療(Vermonden T，Censi R，Hennink WE. Chem. Rev. 2012, 112, 2853-2888; Walsh G. Nat. Biotech. 2000, 18, 831-833)。與具有較高毒副作用的化療藥物相比，蛋白質藥物通常具有較高的特異性，較好的治 療效果和較低的毒副作用，在臨床上展現(xiàn)出了優(yōu)越的疾病治療功效。但這些臨床使用的蛋 白質藥物都是在細胞外起作用。雖然在細胞內(nèi)起作用的蛋白質藥物很多，但還沒有一個進 入臨床使用，這主要是因為這些蛋白藥物的血漿半衰期短、體內(nèi)降解快、細胞內(nèi)吞效率低、 胞內(nèi)運輸過程慢等原因所致(Lu Y, Sun W, Gu Z. J. Controlled Release 2014，194， 1-19)。納米凝膠通常指由親水性或兩親性高分子鏈通過物理或者化學交聯(lián)形成的三維網(wǎng) 狀結構的水凝膠微粒，具有高含水量、良好的生物相容性和多孔結構，納米凝膠可通過物理 交聯(lián)和化學交聯(lián)制備。物理交聯(lián)包括憎水作用、靜電作用、氫鍵作用等，物理凝膠制備通常 條件溫和，不會明顯損傷包載藥物的活性;但存在穩(wěn)定性較差、釋放包裹的藥物較快的缺 點?；瘜W交聯(lián)包括自由基聚合，邁克爾加成反應，酰胺化反應，酶催化反應，銅催化點擊化學 反應等。但這些化學交聯(lián)反應通常不具備專一性，這可能使藥物參與交聯(lián)反應，導致變性。 而且，盡管已有很多報道使用納米凝膠輸送藥物，但很少能夠實現(xiàn)治療藥物在體內(nèi)的靶向 高效輸送。所以需要開發(fā)專一性強、高效快速、無需催化的交聯(lián)反應方法，用于制備具有靶 向性的生物可降解納米凝膠載體，使其更好地應用于藥物控制釋放載體等領域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種專一性強、高效快速、無需催化的光控"四唑-烯"點擊化 學方法制備納米凝膠的方法，用該方法制備的納米凝膠在藥物控制釋放載體和組織工程支 架材料等領域中具有很好的應用前景。
[0004] 為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案是：一種自發(fā)熒光納米凝膠的制備 方法，包括以下步驟:將聚合物四唑衍生物和含甲基丙烯酸酯基團的交聯(lián)劑加入水或者緩 沖液中得到混合液;然后將混合液注射到有機溶劑中，得到懸浮液;然后進行光照反應得到 自發(fā)熒光納米凝膠； 所述聚合物四唑衍生物具有式I結構：
式I; 其中n彡2; R為 H、NH2、NMe2、OMe、NO2、C1、Br、Me、C02Me 或者 PhNHBo c; P為透明質酸、透明質酸賴氨酸化合物、透明質酸胱胺化合物、葡聚糖、殼聚糖、膠原蛋 白、聚乙二醇或者聚乙二醇-聚酯；所述聚乙二醇為線性或者多臂聚乙二醇，表示為?￡6^-OH，x=2,4,6或8;所述聚酯為聚丙交酯、聚(丙交酯-co-乙交酯）、聚己內(nèi)酯或者聚碳酸酯;所 述聚酯的聚合度為1~20; 所述含甲基丙烯酸酯基團的交聯(lián)劑具有式II結構： 式II;
其中m多2; CL為透明質酸、透明質酸胱胺化合物、透明質酸賴氨酸化合物、殼聚糖、葡聚糖、膠原蛋 白、聚乙二醇、聚乙二醇-聚酯、丁二胺、己二胺、胱胺、胱氨酸或者賴氨酸。
[0005] 上述技術方案中，所述聚乙二醇為線性或者多臂聚乙二醇，表示為PEG-X-OH，x=2， 4,6或8;所述聚酯為聚丙交酯、聚（丙交酯-co-乙交酯）、聚己內(nèi)酯或者聚碳酸酯;所述聚酯 的聚合度為1~20;所述聚乙二醇的分子量為2~100 kg/mol。
[0006] 上述技術方案中，甲基丙烯酸酯基團與四唑基團的摩爾比為1:1;混合液中，聚合 物四唑衍生物濃度為0.5~1 Omg/mL。
[0007] 上述技術方案中，所述光照反應為紫外光照反應;所述紫外光的波長為302-390 nm，強度為0 ? 8~100 mW/cm2,時間為90~180s〇
[0008] 上述技術方案中，所述緩沖液包括磷酸鹽(PB)緩沖液，4-(2_羥乙基)-1_哌嗪乙烷 磺酸半鈉鹽(ffiPES)緩沖溶液，三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖溶液，2-嗎啉乙磺酸(MES)緩 沖溶液等;優(yōu)選pH為7.4的PB緩沖液;所述有機溶劑包括丙酮、乙腈、乙醇等;優(yōu)選丙酮。
[0009] 本發(fā)明公開了根據(jù)上述方法制備得到的自發(fā)熒光納米凝膠;可以稱為光控"四唑-稀"點擊化學制備的自發(fā)熒光納米凝膠。
[0010] 本發(fā)明中，聚合物四唑衍生物以聚合物作為主鏈，四唑基團通過〇或者NH隨機接在 聚合物主鏈末端或側鏈上;式I結構中，P表示聚合物，n多2是指四唑基團接在聚合物主鏈 末端或側鏈上的數(shù)量為復數(shù)個，比如本發(fā)明實施例一中，聚合物為透明質酸賴氨酸化合物， 其重復單元上接有多個四唑基團。
[0011] 本發(fā)明中，含甲基丙烯酸酯基團的交聯(lián)劑可以為大分子也可以為小分子，m多2 是指交聯(lián)劑中甲基丙烯酸酯基團的數(shù)量為復數(shù)個;式II結構中，CL為小分子時，甲基丙烯酸 酯基團接在小分子兩端，如本發(fā)明實施例三的結構;CL為聚合物時，甲基丙烯酸酯基團通過 〇或者NH接在聚合物主鏈末端或側鏈上，如本發(fā)明實施例二的結構，聚合物為透明質酸胱胺 化合物，其重復單元上接有多個甲基丙烯酸酯基團。
[0012] 本發(fā)明中，聚合物四唑衍生物的制備方法為，先向四唑溶液中加入縮合劑與催化 劑，反應得到活化的四唑溶液;然后把聚合物水溶液滴加到活化的四唑溶液中，室溫反應得 到聚合物四唑衍生物;所述聚合物為透明質酸、透明質酸賴氨酸化合物、透明質酸胱胺化合 物、葡聚糖、殼聚糖、膠原蛋白、聚乙二醇或者聚乙二醇-聚酯。
[0013] 上述技術方案中，四唑溶液的溶劑優(yōu)選為二甲基亞砜、二甲基亞砜與水的混合溶 液、二氯甲烷或氯仿;聚合物為含有氨基或羥基的水溶性聚合物，優(yōu)選為透明質酸、透明質 酸賴氨酸化合物、透明質酸胱胺化合物、殼聚糖、葡聚糖、聚乙二醇或者聚乙二醇-寡聚酯； 其中所述聚乙二醇為線性或者多臂聚乙二醇；所述聚酯為聚丙交酯、聚（丙交酯-CO-乙交 酯）、聚己內(nèi)酯或者聚碳酸酯。
[0014] 上述技術方案中，水溶性聚合物中的羥基或者胺基與四唑的摩爾比優(yōu)選為1: 0.1 ~2;四唑與縮合劑、催化劑的摩爾比優(yōu)選為1:2:0.1。
[0015] 比如：先向四唑小分子(Tet)的DMS0溶液中加入縮合劑二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、 4_二甲氨基吡啶(DMAP)，反應過夜得到羧基活化的四唑溶液;然后把含有氨基或羥基的聚 合物水溶液逐滴滴加到上述活化的四唑溶液中，再在室溫下攪拌反應18~28小時，得到所 述的聚合物四唑衍生物(P_Tet n);具體反應過程如下：
其中 1?=11、(：1、8『、]^、順2、匪62、勵2或者016。
[0016] 本發(fā)明進一步公開了上述自發(fā)熒光納米凝膠在制備組織工程支架中的應用;上述 自發(fā)熒光納米凝膠在制備蛋白質藥物中的應用;上述自發(fā)熒光納米凝膠作為藥物緩釋載體 的應用。
[0017] 本發(fā)明還公開了一種抗腫瘤藥物，包括上述自發(fā)熒光納米凝膠以及蛋白質藥物。 本發(fā)明公開的納米凝膠與包載的藥物，尤其是蛋白質藥物和細胞不反應，能很好的保持藥 物、蛋白質和細胞的功效，實現(xiàn)完全、可控的釋放，從而可作為蛋白質等藥物的優(yōu)良緩釋載 體;到達病灶處，納米凝膠緩釋藥物，達到切實有效的治療效果，不會造成現(xiàn)有技術中藥物 浪費的問題。
[0018] 由于上述技術方案運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有下列優(yōu)點： 1.本發(fā)明公開的納米凝膠的制備方法具有"點擊化學"的強專一性、快速高效和反應 條件溫和的特點，同時無需銅鹽等毒性催化劑;特別的，本發(fā)明通過設計前驅體原料以及結 合注射、紫外反應，得到的納米凝膠穩(wěn)定性強，用于包載蛋白質時，與藥物結合穩(wěn)定，保證藥 物在體內(nèi)循環(huán)不受干擾。
[0019] 2.本發(fā)明公開的納米凝膠的交聯(lián)方法具有很強的選擇性，與包載的藥物，尤其是 蛋白質藥物和細胞不反應，能很好的保持藥物、蛋白質和細胞的功效，實現(xiàn)完全、可控的釋 放，從而可作為蛋白質等藥物的優(yōu)良緩釋載體;達到病灶處，納米凝膠緩釋藥物，到達切實 有效的治療效果，不會造成現(xiàn)有技術中藥物浪費的問題。
[0020] 3.本發(fā)明制備的納米凝膠具有自發(fā)熒光性能，可被用來觀察納米凝膠載體在體 外內(nèi)吞進入細胞和在體內(nèi)穿透病灶組織的行為，為藥物攝取監(jiān)控、輸送觀察提供有利的條 件，克服了現(xiàn)有技術還需要另加熒光劑監(jiān)視藥物輸送的缺陷。
[0021] 4.本發(fā)明公開的納米凝膠前驅體材料具有良好的生物相容性和生物降解性，而 且來源廣泛、制備簡單、成本較低;制備過程可控，無需催化劑，節(jié)約資源的同時使得產(chǎn)物更 純凈，是一種適用于工業(yè)化的制備方法。
【附圖說明】
[0022]圖1是實施例一中透明質酸賴氨酸四唑衍生物的氫核磁譜圖； 圖2是實施例二中透明質酸胱胺甲基丙烯酸酯衍生物的氫核磁譜圖； 圖3是實施例三中胱氨酸甲基丙烯酸酯衍生物的氫核磁譜圖； 圖4是實施例四中納米凝膠的基本性質表征； 圖5是實施例六中含自發(fā)熒光納米凝膠的雜化水凝膠的制備； 圖6是實施例七中納米凝膠體外控制釋放蛋白質藥物的行為，以及釋放出的蛋白質藥 物的生物活性表征圖； 圖7是實施例八中納米凝膠和載蛋白質藥物的納米凝膠的細胞實驗表征圖； 圖8是實施例九中載蛋白納米凝膠對小鼠皮下人乳腺癌移植瘤的治療表征圖； 圖9是實施例十中載蛋白納米凝膠對小鼠原位肺癌移植瘤的治療表征圖； 圖10是實施例十中載蛋白納米凝膠治療小鼠原位肺癌移植瘤的組織學分析圖。
【具體實施方式】
[0023]下面結合附圖以及實施例對本發(fā)明作進一步描述： 實施例一透明質酸賴氨酸四唑衍生物(HA-Lys-Tet)的合成 在氮氣保護條件下，50 mL兩頸瓶中加入四唑(608 mg)，二甲亞砜10mL，DCC (120 mg) 攪拌24小時，HA-Lys-NH2(#n=35 K，0.4 g)溶于30 mL甲酰胺中，溶解后加入四唑溶液中， 攪拌10 min，加入DMAP (80 mg，），反應48小時，過濾，濾液用水和二甲亞砜混合溶劑透析后 換成純水透析，冷凍干燥后得產(chǎn)品HA-Lys-Tet(產(chǎn)率69 %) ;HA-LyS-Tet核磁表征見附圖1， 4 NMR (D2〇/DMS〇-d6): HA: S 1.82， 2.70-3.68， and 4.23-4.38; Lys: S 0.92， 1.06， 1.52, 2.97, 3.61 and 3.95; Tet: 8 7.91,7.92 and 6.79, 6.80〇 [0024] 四臂聚乙二醇四唑衍生物(PEG_Tet4)、殼聚糖四唑衍生物(Chit-Tet)可更換聚合 物制備得到，結構式如下：
[0025]實施例二透明質酸胱胺甲基丙烯酸酯衍生物(HA-Cy-MA)的合成 HA-Cy-MA分兩步合成，首先胱胺的甲基丙烯酸衍生物(MA-Cy-NH2)由Boc-Cy-NH2和甲 基丙烯酰氯反應后脫Boc保護獲得，然后，在氮氣保護條件下，將MA-Cy-NH2 (14.5 mg，66 Miol)的溶液加入到HA (50 mg, 1.43 wnol)被EDC (75.9 mg, 0.396 mmol)和NHS (22.8 mg，0.198 mmol)活化的5 mL二次水中，置于40°C油浴中避光反應24小時，然后用 水透析，冷凍干燥，產(chǎn)率92 %;HA-Cy-MA核磁表征見附圖2/H NMR (D20): HA: S 2.00， 2.86-3.88, and 4.44-4.52; Cys: 8 2.70, 3.11-3.15 and 3.56; MA: 8 1.92, 5.45 and 5.69。
[0026] 實施例三胱胺酸甲基丙烯酰胺衍生物(MA-Cys-MA)的合成 在冰水浴條件下，將胱氨酸（1.2 g，5.0 mmol)的Na0H(1.5 M，10 mL)溶液滴加到甲基 丙烯酰氯(2.0 mL，20.6 mmol)的DCM(10 mL)中，在冰水浴條件下反應4 h，反應期間用NaOH 溶液調(diào)控pH為9.0。反應結束后，用分液漏斗分出水層，再向其逐滴加入約3 mL HC1(2 M)， 過濾，真空干燥，得到白色粉末1.72 g，產(chǎn)率9^MA-Cys-MA核磁表征見附圖3，咕NMR(400 MHz，DMS〇-d6):MA (S 5.72,5.39和1.85)，Cys (S 12.92,8.24,4.53,3.18 和3.03)。
[0027] 實施例四大分子交聯(lián)制備透明質酸納米凝膠 用大分子交聯(lián)劑綜合利用反相納米沉淀法和光控"四唑-稀"交聯(lián)法制備透明質酸納米 凝膠，制備如下：將實施例一和實施例二制備的HA-Lys-Tet和HA-Cy-MA以摩爾比1:1溶于 的ro(pH 7.4，10 mM)中，制備得到濃度為1.25 mg/mL的聚合物溶液，然后混合溶液注射到 100mL丙酮中，用紫外光(波長320-390 nm，光強60 mW/cm2)福射3 min，旋蒸除去丙酮后用 PB透析，冷凍干燥得到納米凝膠。參見附圖4,納米凝膠的粒徑可用動態(tài)光散射(DLS)測量， 通過此種方法獲得的納米凝膠粒徑可控（150-343 nm)，PDI很小(0.10-0.17)(圖4a)，同時 納米凝膠的形貌可以用透射電鏡(TEM)觀察得到，該法制備的納米凝膠為球形（圖4a);另 外，制備得到的納米凝膠在405nm的UV激發(fā)光輻射下，在450 nm處有較強的綠色熒光（圖 4b);利用納米凝膠的自發(fā)熒光性能來觀察納米凝膠的細胞內(nèi)吞和在體內(nèi)分布情況，該納米 凝膠還表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性，放置在ro(pH 7.4，10 mM)和10% FBS模擬體內(nèi)血液環(huán)境均能 保持粒徑穩(wěn)定（圖4c);但是把納米凝膠放置在10 mM GSH的PB (pH 7.4，10 mM)中4小時 就可以觀察到顯著的粒徑變化，隨時間增加，粒徑開始快速變大，表明此種納米凝膠有快速 的還原響應性質（圖4d)。這可以被用來實現(xiàn)藥物在細胞內(nèi)的響應性快速釋放，大大增加包 載藥物的治療效果。
[0028]實施例五小分子交聯(lián)制備透明質酸納米凝膠 用小分子交聯(lián)劑綜合利用反相納米沉淀法和光控"四唑-稀"交聯(lián)法制備透明質酸納米 凝膠，將1 mL HA-〇EG-Tet(l mg/mL)和MA-Cys-MA的PB(pH 8.5，10 mM)溶液（Tet和MA基團 的摩爾比控制在1: 1)注射到20 mL乙腈中，然后將該溶液置于紫外暗箱(320-390 nm，37.5 mW/cm2)光照90 s。旋轉蒸發(fā)除去丙酮，用PB(pH 7.4，10 mM)透析12 h(MWC0 7000 Da)，得 到納米凝膠。動態(tài)光散射(DLS)結果表明該法制備的納米凝膠的平均粒徑165 nm，且呈現(xiàn)單 峰分布。TEM圖片說明該納米凝膠具有球形結構，并且大部分的納米粒子尺寸約為100 nm， TEM圖片中的納米凝膠的粒徑比DLS測出的粒徑小，可能因為TEM制樣過程中，納米凝膠中水 分蒸發(fā)，納米凝膠皺縮，而使拍出來的粒徑要小。
[0029]實施例六光控"四唑-烯"點擊化學納米凝膠用于生長因子的包載和復合水凝膠的 制備 以包載血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)為例，首先將VEGF、HA-〇EG-Tet和HA-Cy-MA溶解到PB (pH 7.4，10 mM)緩沖溶液中，使聚合物總濃度為1.25 mg/mL。然后將該溶液注射到丙酮中， 再用功率極低的手提式紫外分析儀(302 nm，0.88 mW/cm2)光照180秒。最后旋轉蒸發(fā)除去 丙酮，用水透析12 h，得到包載VEGF的納米凝膠(VEGF-NGs)溶液。DLS結果顯示包載VEGF的 納米凝膠(VEGF-NGs)呈現(xiàn)單峰分布，且其平均粒徑為173 nnuTEM觀察顯示VEGF-NGs具有球 形結構，并且納米凝膠的直徑約為100腹。該包載VEGF的納米凝膠具有較好的注射性，可直 接注射使用或者與水凝膠結合制備水凝膠復合物。
[0030] 水凝膠復合物的制備是先將巰基功能化的膠原蛋白（Col-SH)和低聚碳酸酯-聚乙 二醇-低聚碳酸酯(0AC-PEG-0AC)分別溶于100 yL的PB(pH 7.4，100 mM)中，待完全溶解后， 把兩種溶液和VEGF-NGs溶液在室溫下混合均勻，再置于37°C搖床反應形成復合水凝膠。該 復合水凝膠的從溶液狀態(tài)變成水凝膠的形成過程見圖5a。同時，復合水凝膠的儲能模量(G ')和損耗模量(G'')隨時間的變化可用流變儀測定。結果表明該復合水凝膠的模量可達 2000 Pa，凝膠時間約為3分鐘（圖5b)。該包載VEGF生長因子的復合水凝膠作為組織工程支 架在缺血心肌修復中有廣泛的應用前景。
[0031] 實施例七光控"四唑-烯"點擊化學納米凝膠用于蛋白質藥物的包載和體外控制釋 放 以包載細胞色素 C(CC)為例，將一定量的CC(理論載藥量為10%)加入到聚合物總濃度為 1.25 mg/mL的HA-〇EG-Tet和HA-Cy-MA的PB(pH 7.4，10 mM)溶液中，然后將該溶液注射到丙 酮中，再用紫外（320-390 nm，50 mW/cm2)光照90秒。最后旋轉蒸發(fā)除去丙酮，用水透析12 h，得到包載CC的納米凝膠(CC-NGs)溶液。用類似的方法可以實現(xiàn)對治療蛋白果粒酶B(GrB) 的高效包裹，得到包載GrB的納米凝膠(GrB-NGs)。蛋白質CC的釋放實驗于37°C在兩種不同 的釋放介質中進行，即PB(pH 7.4，10 mM)和10 mM GSH的PB(pH 7.4，10 mM)溶液。取1 mL 包載CC-NGs樣品于蛋白釋放袋(MWC0 350 K)中，并置于25 mL相應的PB釋放介質中。在每個 取樣時間點，取出5 mL釋放介質，并補充相應的新鮮介質。將各時間點取出的樣品凍干，復 溶，用紫外(CC紫外吸收波長是410 nm)測定。每組釋放試驗平行進行三次，最終顯示結果為 實驗所得平均值±標準方差。圖6是上述納米凝膠體外控制釋放蛋白質藥物的行為，以及釋 放出的蛋白質藥物的生物活性表征圖；蛋白質的體外釋放實驗表明在生理條件下(pH 7.4， 37°C)CC能很好地被包裹在HA-NGs中，經(jīng)48 h后，釋放量約30%(圖6a)。相反，在含有10 mM GSH的還原條件下，10 h后從納米凝膠中釋放出了超過80%的CC。這說明CC-NGs在細胞質的 還原環(huán)境下能快速釋放出包裹的蛋白質藥物。
[0032]蛋白質的電子轉移活性的測試是通過檢測其對ABTS轉變?yōu)锳BTS+的催化效率得到 的。首先釋放出的CC用PBS溶液稀釋至濃度為0.004 mg/mL。同時配置相同濃度的、未經(jīng)任何 處理的CC，取相同量兩種溶液放入石英樣品池中，向兩種溶液中加入相同量的含有10 yL的 0.045 M的過氧化氫溶液和100 yL的1 mg/mL的ABTS的roS溶液。倒置使之混合好并馬上用 UV分光光度計讀在410 nm處的吸收值，并以此為零點，每個15秒測一次。每個時間點對應的 紫外吸收值減去第一個點的吸收值從而得到吸收值的變化（A A)，以A A對時間作圖表示其 活性變化隨時間的變化。附圖6b為上述釋放出的蛋白活性檢測圖，結果顯示從納米凝膠里 釋放出來的CC仍然能較快地催化ABTS的氧化，催化速率和未經(jīng)任何處理的CC的接近，證實 了從納米凝膠中釋放出的蛋白質仍能較好地保持活性。
[0033] 實施例八空納米凝膠和包載有蛋白質藥物的納米凝膠的細胞實驗 以實施例四中的制備的納米凝膠為例，測試空納米凝膠的細胞相容性。將成纖維細胞 (L929)、乳腺癌細胞(MCF-7)、腦膠質瘤細胞(U87)和肺癌細胞(A549)分別鋪在96孔細胞培 養(yǎng)板上，每個孔大約5000個細胞，再加入含有10 %小牛血清、1%谷氨酸鹽、抗生素青霉素 (100 IU/mL)和鏈霉素（100 yg/mL)的DMEM培養(yǎng)基，再置于37°C，5%二氧化碳條件下培養(yǎng)12 h。然后，加20此納米凝膠的PB(10 mM，pH 7.4)溶液（最終納米凝膠的濃度為0.2,0.4， 0.6,0.8和1.〇11^/1]11〇到每孔中，再在37°〇，5%二氧化碳條件下培養(yǎng)48 11。隨后，向每孔加入 3-(4,5_二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)的PBS溶液（15 yL，5 mg/mL)，并放入 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。4 h后，移除含有MTT的培養(yǎng)液，再加入150 yL DMS0用于溶解活細胞與 MTT生成的紫色結晶甲饋，并用酶標儀(Bio Tek)測定每個孔在492 nm處的紫外吸收。細胞 相對存活率通過與只有空白細胞的對照孔在492 nm處的吸收相比得到，每組實驗平均進行 4次。圖7是上述納米凝膠和載蛋白質藥物的納米凝膠的細胞實驗表征圖。
[0034] 附圖7a為細胞存活率圖，可以看出，48小時后加入納米凝膠細胞的存活率均達到 90 %以上，說明透明質酸納米凝膠沒有毒性。
[0035] CC-NGs和GrB-NGs的細胞毒性也是通過MTT法測定。將包載蛋白藥物的納米凝膠加 入乳腺癌細胞(MCF-7,⑶44受體高表達），肺癌細胞(A549,⑶44受體高表達)和腦膠質瘤細 胞(U87，CD44受體低表達）中，并培育4 h。然后將載蛋白的納米凝膠的培養(yǎng)基吸走，再加入 新鮮培養(yǎng)基于37°C，5%二氧化碳條件下繼續(xù)培養(yǎng)92 h。培養(yǎng)結束后向每孔中加入10 yL MTT 的PBS溶液(5 mg/mL)并放入培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h使MTT與活細胞充分作用。隨后移除含 有MTT的培養(yǎng)液，并加入150 yL DMS0用于溶解活細胞與MTT生成的紫色結晶甲瓚，并用酶標 儀(Bio Tek)測定每個孔在492 nm處的紫外吸收。細胞相對存活率計算方法如上。封閉實驗 是先用HA(5 mg/mL)與MCF-7細胞孵育4 h，然后再加入包載包載蛋白質的納米凝膠。結果表 明CC-NGs對MCF-7細胞有較高的抗腫瘤活性，其細胞的半抑制濃度（IC50)為0.52 yM(圖 7b)。相反，自由CC即便在濃度高達6.2 yM時仍無明顯的細胞毒性，這主要是因為CC內(nèi)吞進 入細胞的能力很差。另外，CC-NGs對CD44受體低表達的U87細胞表現(xiàn)出明顯減小的凋亡活 性，而且CC-NGs對預先封閉⑶44受體的MCF-7細胞的抗腫瘤活性明顯降低，這些結果說明 CC-NGs是通過CD44受體介導內(nèi)吞機理進入細胞。同時，GrB-NGs對CD44受體高表達的MCF-7 和A549細胞都表現(xiàn)出了較高的體外抗腫瘤活性，其分別為3.0 nM和8.1 nM(圖7c)。
[0036]實施例九載蛋白納米凝膠對小鼠皮下人乳腺癌移植瘤的治療 首先使用皮下注射MCF-7細胞（1 X 107)的PBS溶液(50 yL)到裸鼠的右后側建立了人 乳腺癌皮下腫瘤模型。當腫瘤的體積達到30 mm3后，裸鼠被隨機分成4組，每組5只。然后，通 過靜脈注射方法分別向每組荷瘤老鼠注射GrB-NGs (25 yg GrB equiv./kg)、GrB-NGs (100 yg GrB equiv./kg)、空納米凝膠和PBS緩沖溶液，每三天給藥一次，總共給藥四次。月中 瘤體積以及裸鼠體重每隔一天測量一次。腫瘤體積的計算公式:體積=y 2*a*b*c，a是腫瘤 最長邊，b是腫瘤最寬邊，c是腫瘤的高度。附圖8為皮下乳腺癌的治療，可以發(fā)現(xiàn)PBS組和空 納米凝膠組的腫瘤體積生長快速。而GrB-NGs在劑量為25 yg GrB equiv./kg和100 yg GrB equiv./kg時都能有效地抑制腫瘤的生長，且劑量越高對腫瘤生長的抑制效果越明顯。同 時，GrB-NGs組與roS組相似，都沒有導致動物體重降低，說明GrB-NGs沒有明顯的毒副作用 (參見圖8)。
[0037]實施例十載蛋白納米凝膠對小鼠原位人肺癌移植瘤的治療 首先通過注射帶luciferase的A549細胞（1 X 107)的roS溶液(50 yL)到裸鼠的肺部 建立了人肺癌原位腫瘤模型。當腫瘤細胞的熒光值達到20000 p/s/cm2/sr時，裸鼠被隨機 分成3組，每組6只。然后，每三天通過尾靜脈注射分別向每組荷瘤老鼠注射GrB-NGs(150 yg GrB equiv. /kg GrB)、空白納米凝膠和roS，總共給藥四次。腫瘤出的熒光和裸鼠體重每三 天記錄一次，圖9是載蛋白納米凝膠對小鼠原位肺癌移植瘤的治療表征圖。附圖9a_c為肺癌 原位治療圖，PBS組和空納米凝膠組的腫瘤處熒光強度隨時間明顯增強，表明腫瘤在快速生 長。而GrB-NGs治療中的腫瘤熒光強度較弱，這說明GrB-NGs能有效地抑制裸鼠肺癌的生長。 同時，GrB-NGs組的小鼠體重變化并不顯著（圖9d)，這一方面表明GrB-NGs無明細的毒副作 用，另一方面也說明GrB-NGs能有效地抑制小鼠原位肺癌的生長，使小鼠生長狀況良好。相 反，PBS和空白納米凝膠對照組的小鼠體重均顯著降低，這是因為小鼠隨著原位肺癌的快速 生長，身體狀況急劇下降。小鼠的生存實驗也表明GrB-NGs治療組的小鼠在整個觀察期間 (40天），沒有死亡發(fā)生；而PBS和空白納米凝膠對照組的小鼠在治療觀察結束后，全部死亡 (圖geXH&E染色可以發(fā)現(xiàn)GrB-NGs對體內(nèi)主要臟器(心臟、肝臟、腎等)沒有副作用（圖10)， 這進一步表明了 GrB-NGs不會引起明顯的毒副作用。
【主權項】
1. 一種自發(fā)巧光納米凝膠的制備方法，其特征在于，包括W下步驟:將聚合物四挫衍生 物和含甲基丙締酸醋基團的交聯(lián)劑加入水或者緩沖液中得到混合液;然后將混合液注射到 有機溶劑中，得到懸浮液;然后進行光照反應得到自發(fā)巧光納米凝膠； 所述聚合物四挫衍生物具有式I結構： 式I;其中η > 2; R為山畑2、醒02、〇16、備2、(：1、化、]^、〇)2]^或者化畑8〇。； Ρ為透明質酸、透明質酸賴氨酸化合物、透明質酸脫胺化合物、葡聚糖、殼聚糖、膠原蛋 白、聚乙二醇或者聚乙二醇-聚醋； 所述含甲基丙締酸醋基團的交聯(lián)劑具有式II結構：式II; 其中m > 2; 化為透明質酸、透明質酸脫胺化合物、透明質酸賴氨酸化合物、殼聚糖、葡聚糖、膠原蛋 白、聚乙二醇、聚乙二醇-聚醋、下二胺、己二胺、脫胺、脫氨酸或者賴氨酸。2. 根據(jù)權利要求1所述自發(fā)巧光納米凝膠的制備方法，其特征在于：甲基丙締酸醋基團 與四挫基團的摩爾比為1:1;混合液中，聚合物四挫衍生物濃度為0.5~10 mg/mL。3. 根據(jù)權利要求1所述自發(fā)巧光納米凝膠的制備方法，其特征在于:所述緩沖液包括憐 酸鹽緩沖液、4-(2-?乙基)-1-贓嗦乙燒橫酸半鋼鹽緩沖溶液、Ξ徑甲基氨基甲燒緩沖溶液 或者2-嗎嘟乙橫酸緩沖溶液;所述有機溶劑包括丙酬、乙臘或者乙醇。4. 根據(jù)權利要求1所述自發(fā)巧光納米凝膠的制備方法，其特征在于:所述光照反應為紫 外光照反應;所述紫外光的波長為302~390皿，強度為0.8~100 mW/cm2,反應時間為90~ 180s。5. 根據(jù)權利要求1所述自發(fā)巧光納米凝膠的制備方法，其特征在于:所述聚乙二醇為線 性聚乙二醇或者多臂聚乙二醇;所述聚醋為聚丙交醋、聚(丙交醋-CO-乙交醋）、聚己內(nèi)醋或 者聚碳酸醋。6. 根據(jù)權利要求1所述自發(fā)巧光納米凝膠的制備方法，其特征在于:聚合物四挫衍生物 的制備方法為，先向四挫溶液中加入縮合劑與催化劑，反應得到活化的四挫溶液;然后把聚 合物水溶液滴加到活化的四挫溶液中，室溫反應得到聚合物四挫衍生物;所述聚合物為透 明質酸、透明質酸賴氨酸化合物、透明質酸脫胺化合物、葡聚糖、殼聚糖、膠原蛋白、聚乙二 醇或者聚乙二醇-聚醋。7. 根據(jù)權利要求1~6所述任意一種制備方法制備的自發(fā)巧光納米凝膠。8. -種抗腫瘤藥物，包括權利要求7所述自發(fā)巧光納米凝膠W及蛋白質藥物。9. 權利要求7所述自發(fā)巧光納米凝膠在制備蛋白質藥物或組織工程支架中的應用。10. 權利要求7所述自發(fā)巧光納米凝膠作為藥物緩釋載體的應用。
【文檔編號】A61L27/24GK105968372SQ201610536475
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月8日
【發(fā)明人】鄧超, 陳景, 孟鳳華, 鐘志遠
【申請人】蘇州大學