一種共表達(dá)分子伴侶蛋白提高重組大腸桿菌1,2,4-丁三醇產(chǎn)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種共表達(dá)分子伴侶蛋白提高重組大腸桿菌中1,2,4?丁三醇產(chǎn)量的方法，屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明是以重組大腸桿菌E.coli(pEtac?mdlC?tac?xdh)作為出發(fā)菌株，通過共表達(dá)分子伴侶蛋白，輔助1,2,4?丁三醇合成途徑中關(guān)鍵酶的折疊，增強(qiáng)關(guān)鍵酶活性，從而提高1,2,4?丁三醇產(chǎn)量的方法。最后優(yōu)選分子伴侶Trigger factor，使重組大腸桿菌1,2,4?丁三醇產(chǎn)量提高了1.4倍。
【專利說明】
一種共表達(dá)分子伴侶蛋白提高重組大腸桿菌1 ,2,4-丁三醇產(chǎn) 量白勺方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種共表達(dá)分子伴侶蛋白提高重組大腸桿菌中1，2,4_ 丁三醇的方法， 屬于遺傳工程領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 1，2,4_ 丁三醇是一種四碳多元醇，無色，無臭，無味，性質(zhì)與甘油類似，主要應(yīng)用于 軍工、醫(yī)藥、化妝品、化工等領(lǐng)域。目前，1，2,4_丁三醇主要通過化學(xué)法生產(chǎn)，但化學(xué)法存在 著反應(yīng)條件嚴(yán)苛，所用催化劑昂貴，易造成環(huán)境污染、副產(chǎn)物較多，不利于分離純化的弊端， 故近年來，研究的焦點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)向生物合成法。
[0003] 迄今為止，尚未在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)1，2，4-丁三醇，故生物法合成丁三醇是通過引進(jìn) 外源蛋白，構(gòu)建合成路徑。目前已在大腸桿菌中構(gòu)建成功且研究較多的合成途徑為:從木糖 出發(fā)，在木糖脫氫酶作用下，生成木糖酸，木糖酸經(jīng)木糖酸脫水酶，苯甲酰甲酸脫羧酶及醇 脫氫酶的作用，生成1，2,4_ 丁三醇。但該方法產(chǎn)量仍未達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)的要求，主要是由于關(guān) 鍵代謝酶催化活性低下。因此，提高關(guān)鍵代謝酶活性是提高1，2，4-丁三醇產(chǎn)量的關(guān)鍵。
[0004] 分子伴侶蛋白（chaperone)是一類蛋白，他們可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確裝配，但并不 作為蛋白的組成部分。目前常見于大腸桿菌中的分子伴侶蛋白有三種:G r〇ES-Gr〇EL、DnaK-DnaJ-GrpE和Trigger factor。其中，GroEL屬于Hsp60伴侶家族，GroES為其輔助分子伴侶， 兩者在ATP的共同作用下可以與未折疊或部分折疊的多肽結(jié)合，釋放未折疊的多肽進(jìn)入折 疊池，以及對折疊好的蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)重排。DnaK、DnaJ均屬于Hsp70家族，主要功能包括輔助 體內(nèi)蛋白質(zhì)折疊以及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、降解以及調(diào)節(jié)異常蛋白質(zhì)。GrpE作為二者的輔助因子，可以 輔助正確折疊蛋白的釋放。Trigger factor是一個(gè)三亞基蛋白，可以與新生肽鏈結(jié)合，輔助 蛋白折疊。另外，不同的伴侶蛋白間也存在協(xié)同作用。在大腸桿菌中共表達(dá)分子伴侶蛋白可 以輔助外源蛋白的折疊，提高目的蛋白酶活水平，如trigger factor的引入促進(jìn)小鼠內(nèi)皮 抑制素、人體氧調(diào)節(jié)蛋白的溶解程度。在本研究中，引入分子伴侶蛋白，可能提高代謝酶活 性，從而提升1，2，4-丁三醇產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明首先提供五種共表達(dá)分子伴侶蛋白的重組大腸桿菌，是以E.c〇li(pEtac-mdlC-tac-xdh)為出發(fā)菌株，分別轉(zhuǎn)入含有分子伴侶蛋白基因的質(zhì)粒pG-KJE8、pGr 〇7、 pTf!6、pKJE7、pG_Tf2,構(gòu)建而成的重組大腸桿菌 Ε· coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)/pG_KJE8， E·coli(pEtac-mdlC-tac_xdh)/pGro7，E·coli(pEtac-mdlC-tac_xdh)/pTfl6，E·coli (pEtac-mdlC-tac_xdh)/pKJE7，E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)/pG_Tf2〇
[0006] 其中，所述E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)，是以E.coli W3100為宿主，以啟動(dòng)子 Ptac調(diào)控Xdh、MdlC表達(dá)，具體構(gòu)建方法參見文獻(xiàn)(孫文龍，陸信曜，宗紅，等.代謝工程改造 大腸桿菌合成D-1，2，4-丁三醇[J].微生物學(xué)通報(bào)，2014，41 (10))。
[0007] 本發(fā)明所述質(zhì)粒PG-KJE8、pGr〇7、ρΤΠ 6、pKJE7、pG-Tf 2含有不同分子伴侶蛋白基 因，其中，PG-KJE8 含有 DnaK-DnaJ-GrpE 及 GroES-GroEL 編碼基因，pG-Tf2 攜帶 Trigger factor及GroES-GroEL，而質(zhì)粒pGro7、pTf 16、pKJE7則分別帶有GroES-GroEL、Trigger factor、DnaK_DnaJ-GrpE 蛋白。
[0008] 所述DnaK編碼基因如NCBI-Gene ID:944750所示，DnaJ編碼基因如NCBI-Gene ID: 944753所示，GrpE基因如NCBI-Gene ID:947097所示。所述GroES編碼基因如NCBI-Gene ID: 948655所示，GroEL編碼基因如NCBI-Gene ID:948665所示，tig基因如NCBI-Gene ID: 945081 所示。
[0009] 分子伴侶蛋白氨基酸序列如下：

[0022] 本發(fā)明還提供了應(yīng)用所述重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)1，2,4-丁三醇的方法，將37°C、 200rpm下培養(yǎng)12h的重組大腸桿菌以1%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，同時(shí)根據(jù)需要加入2mg/ mL阿拉伯糖，10ng/mL四環(huán)素，0.5mmol/L IPTG，在37°C、200rpm下培養(yǎng)50h。
[0023] 重組大腸桿菌種子培養(yǎng)及發(fā)酵：
[0024]種子培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5，NaCl 10。
[0025]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5，NaCl 10,木糖20。
[0026] 培養(yǎng)條件:將37°C、200rpm下培養(yǎng)12h的種子以1%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 °C、200rpm條件下培養(yǎng)50h。
[0027] 本發(fā)明是以重組大腸桿菌E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)作為出發(fā)菌株，通過共表 達(dá)分子伴侶蛋白提高關(guān)鍵代謝酶的折疊效率，進(jìn)而提高關(guān)鍵酶催化活性，從而提高1，2,4_ 丁三醇的產(chǎn)量。在搖瓶發(fā)酵過程中，含有質(zhì)粒ΡΤΠ 6的重組大腸桿菌1，2,4_丁三醇產(chǎn)量達(dá)到 1.0 lg/L，提高1.4倍。本發(fā)明為進(jìn)一步代謝工程改造大腸桿菌生產(chǎn)1，2，4-丁三醇奠定了基 礎(chǔ)。本發(fā)明提供的重組大腸桿菌構(gòu)建方法簡單，便于使用，具有很好地應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 實(shí)例 1
[0029] 將E · coli (pEtac-mdlC-tac-xdh)菌體培養(yǎng)到0D6Q()等于0 · 4-0 · 6時(shí)，從搖床取出，冰 浴30min后離心。用O.lmol/L的CaCl2洗滌菌體，培養(yǎng)lh后涂布相應(yīng)抗性平板，待其長出后挑 取正確轉(zhuǎn)化子，得到含有相應(yīng)質(zhì)粒的重組大腸桿菌E.coli(pEtac-mdlC-tac-χdh)/pG-KJE8,E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)/pGro7,E.coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)/pTf16,E.coli (pEtac-mdlC-tac_xdh)/pKJE7，Ε·coli(pEtac-mdlC-tac-xdh)/pG_Tf2〇
[0030] 實(shí)例2
[0031] 從平板上挑取不同重組菌的單菌落，過夜培養(yǎng)后作為種子液，以1%的接種量接種 于45mL LB中，同時(shí)加入2mg/ml阿拉伯糖或10ng/ml四環(huán)素誘導(dǎo)分子伴侶蛋白表達(dá)。待培養(yǎng) 至0D6q() = 0 · 6時(shí)加入IPTG和木糖母液，至IPTG、木糖終濃度分別為0 · 5mmol/L和20g/L，在37 °C、200rpm下培養(yǎng)50h，取發(fā)酵上清液進(jìn)行高效液相色譜檢測。
[0032] 實(shí)例3
[0033]首先將發(fā)酵液12 OOOrpm離心除去細(xì)胞，上清液用0.22μπι混合纖維素酯微孔膜過 濾即可用于HPLC檢測。檢測條件：Agilent 1260，RID檢測器，色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87 column(300mmX7.8mm)，柱溫60°C，流動(dòng)相為5mmol/L H2SO4,流速0.6mL/min。結(jié)果 如表 1所示，其中E · coli (pEtac-mdlC-tac_xdh)/pTf 16的1，2，4-丁 三醇產(chǎn)量達(dá)到 1 · Olg/1。 [0034]表1含有不同分子伴侶蛋白的重組大腸桿菌的1，2,4_ 丁三醇產(chǎn)量
[0036]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù) 的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍 應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高產(chǎn)1，2,4-丁三醇的重組大腸桿菌，其特征在于，以重組大腸桿菌E.coli (pEtac-mdlC-tac-xdh)為出發(fā)菌株，導(dǎo)入含有分子伴侶蛋白的質(zhì)粒pG-KJE8、pGro7、pTf 16、 pKJE7和pG-Tf2。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，以重組大腸桿菌E. coli (pEtac-mdlC-tac-xdh)，是以E.coli W3100為宿主，以啟動(dòng)子Ptac調(diào)控Xdh、MdlC表達(dá)。3. 應(yīng)用權(quán)利要求1或2所述重組大腸發(fā)酵生產(chǎn)1，2，4-丁三醇的方法，其特征在于，將37 °C、200rpm條件下培養(yǎng)12h的重組大腸桿菌以1%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，同時(shí)根據(jù)需要 加入2mg/mL阿拉伯糖，10ng/mL四環(huán)素，0.5mmol/L IPTG，在37°C、200rpm下培養(yǎng)50h。4. 應(yīng)用權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有:蛋白胨10g/L、酵母 粉5g/L、氯化鈉1 Og/L、木糖20g/L。
【文檔編號】C12R1/19GK105969712SQ201610316953
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】諸葛斌, 何姝穎, 陸信曜, 宗紅, 陳雯
【申請人】江南大學(xué)