一種臍血淋巴細胞dc-cik的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于免疫細胞體外培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別公開了一種臍血淋巴細胞DC?CIK的培養(yǎng)方法。本發(fā)明以臍血為處理對象，經(jīng)過臍血單個核細胞的分離、DC細胞的分離培養(yǎng)、CIK細胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)、DC和CIK的共培養(yǎng)制備DO?DIK細胞，并添加CTLA?4mAb和PD?1mAb，最后離心收集成熟的DC?DIK細胞，得到產(chǎn)品。本發(fā)明通過用CD3mAb包被培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)前期連續(xù)刺激，減少了細胞因子的使用，提高效應(yīng)細胞群活化效率和擴增效率，同時降低了培養(yǎng)成本。
【專利說明】
_種胳血淋巴細胞DG-GIK的培養(yǎng)方法 (一)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于免疫細胞體外培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種臍血淋巴細胞DC-CIK的培 養(yǎng)方法。 (二)
【背景技術(shù)】
[0002] 過繼性免疫療法是將致敏淋巴細胞(具有特異免疫力）或其產(chǎn)物輸給細胞免疫功 能低下者(如腫瘤病人），提高患者抗腫瘤免疫力，以達到治療和預(yù)防復(fù)發(fā)的目的。
[0003] 樹突狀細胞(Dendritic cel Is)是體內(nèi)功能最強的專職抗原遞呈細胞(Antigen presenting cell，APC)，成熟DC能有效激活初始型T細胞，處于啟動、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答 的中心環(huán)節(jié)，能夠?qū)⒖乖f呈給T淋巴細胞，從而發(fā)揮T淋巴細胞的殺傷作用。
[0004] 細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞(cytokine induced killer cells，CIK)是將人外周血 或者臍血單個核細胞在體外用多種細胞因子(如抗CD3單克隆抗體、IL-2和IFN-γ等)共同 培養(yǎng)一段時間后獲得的一群異質(zhì)細胞。由于該種細胞同時表達CD3+和CD56+兩種膜蛋白分 子，故又被稱為NK細胞樣T淋巴細胞，兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC限 制性殺瘤優(yōu)點。然而NKT細胞在正常的臍血中含量極低，僅為1 %左右。因此，在體外培養(yǎng)中， 提高CIK細胞的絕對數(shù)量和其中的NKT細胞的比例對提高臨床治療效果至關(guān)重要。
[0005] DC-CIK細胞是指將腫瘤抗原誘導(dǎo)成熟的DC細胞與CIK細胞共培養(yǎng)，既可以促進DC 細胞的成熟，又能增強CIK細胞的細胞毒T細胞的含量，從而發(fā)揮對腫瘤特異性的殺傷作用， 達到清除腫瘤微小病灶的目的。有研究表明，臍血來源的DC-CIK細胞和外周血來源的DC-CIK細胞相比，有更高的增殖倍數(shù)、更強的殺瘤活性和低的免疫原性。
[0006] 腫瘤組織的免疫逃逸性就是指腫瘤細胞通過多種機制逃避機體免疫系統(tǒng)識別和 攻擊，從而得以在體內(nèi)生存和增殖的現(xiàn)象。機體免疫系統(tǒng)具有免疫監(jiān)視功能，當體內(nèi)出現(xiàn) 惡變細胞時，免疫系統(tǒng)能夠識別并通過免疫機制特異地清除這些"非己"細胞，抵御腫瘤的 發(fā)生發(fā)展。然而，惡變細胞在某些情況下能通過多種機制逃避機體的免疫監(jiān)視，在體內(nèi)迅速 增殖，形成腫瘤。也就是說:一方面，機體可通過天然和獲得性免疫抵抗腫瘤的發(fā)生；另一方 面，腫瘤細胞可通過多種機制逃避機體免疫的識別和攻擊。其分子機理在于免疫T細胞包括 CIK細胞，在其細胞表面表達著一類受體，它們的作用是一旦與其相應(yīng)的配體結(jié)合，就能產(chǎn) 生一系列信號來抑制或削弱T細胞的活力。生物體通過這一機制來控制T細胞的殺傷作用， 以避免它們攻擊自身細胞，產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)。而CTLA4、H)-1分子就是這類受體。在免疫T 細胞被激活、擴增的各個步驟中，一旦遭遇到表達著輔助激活配體(B7-1、⑶80和⑶86)的樹 突細胞或腫瘤細胞時，激活的T細胞通過提高CTLA-4、PD-1分子的表達，其中CTLA-4分子使 之替代CD28與B7-1結(jié)合，而PD-1分子與PD-L分子接合，從而提高了 T調(diào)節(jié)細胞的負調(diào)節(jié)功 能，降低T細胞的殺傷功能。
[0007] 目前現(xiàn)有的DC-CIK技術(shù)的不足：（1)一般的CIK制備方法是將分離的臍血單個核細 胞(PBMC)用IFN-γ處理24小時后，加入CD3mAb，IL-la和IL-2因子進行刺激誘導(dǎo)，最終獲得 一定數(shù)量的CIK細胞，但最終獲得的CIK細胞的增值倍數(shù)和有效細胞含量都不夠理想；（2)在 腫瘤的微環(huán)境中CIK細胞表面CTLA4和ro-1的表達量升高，與DC上的相應(yīng)配體接合，從而介 導(dǎo)免疫負調(diào)控機制，抑制CIK細胞的殺傷功能?，F(xiàn)有的DC-CIK技術(shù)沒有考慮到T調(diào)節(jié)細胞含 量對腫瘤免疫逃逸的影響。用CTLA-4和PD-1單克隆抗體來抑制T調(diào)節(jié)細胞在理論上和實驗 中均得到證實。 (三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明為了彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種步驟簡單、細胞殺傷活性大的臍血 淋巴細胞DC-CIK的培養(yǎng)方法。
[0009] 本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0010] -種臍血淋巴細胞DC-CIK的培養(yǎng)方法，以臍血為原始材料，包括如下步驟：
[0011] (1)從臍血中分離出臍血單個核細胞，重懸于GT-T551H3培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)；
[0012] (2)從步驟（1)中制得的培養(yǎng)液中吸出懸浮細胞；貼壁細胞加入含有rhGM-CSF和 rhIL-4的GT-T551H3培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng);第3天半量換GT-T551H3培養(yǎng)基，并補加 rhGM-CSF和 rhIL-4;第5天加入腫瘤特異性抗原刺激;第6天加入rhTNF-a，繼續(xù)培養(yǎng)到第7天，得到DC細 胞；
[0013] (3)吸出的懸浮細胞放入CD3mAb包被過的培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中補加 IFN- γ及經(jīng)滅活過的自體血漿;第2天補GT-T551H3培養(yǎng)基，同時添加 IL-2和經(jīng)滅活過的自 體血漿；第3天補GT-T551H3培養(yǎng)基，同時添加兒-2和％經(jīng)滅活過的自體血漿;第4天補GT-Τ551Η3培養(yǎng)基，同時添加 IL-2和經(jīng)滅活過的自體血漿，培養(yǎng)至第7天，得到CIK細胞；
[0014] (4)將DC細胞和CIK細胞混合，將混合后的細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)袋中，補GT-T551H3培養(yǎng) 基，同時添加 IL-2、經(jīng)滅活過的自體血漿、CTLA-4mAb和PD-lmAb，靜置培養(yǎng)5-7天，得到DC-CIK細胞；
[0015] (5)第14天將培養(yǎng)好的DC-CIK細胞離心收集，并用氯化鈉溶液洗滌，再向收集好的 細胞中加入人血清白蛋白，并用氯化鈉溶液定容，得到產(chǎn)品。
[0016] 本發(fā)明以臍血為處理對象，經(jīng)過臍血單個核細胞的分離、DC細胞的分離培養(yǎng)、CIK 細胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)、DC和CIK的共培養(yǎng)制備D0-DIK細胞，并添加 CTLA-4mAb和ro-lmAb，最后離 心收集成熟的DC-DIK細胞，得到產(chǎn)品。
[0017] 本發(fā)明的更優(yōu)技術(shù)方案為：
[0018] 步驟（1)中，GT-T551H3培養(yǎng)基中，臍血單個核細胞的細胞濃度為（1-2) X 106個/ mL，靜置培養(yǎng)2小時。
[0019] 步驟（2)中，貼壁細胞加入含有rhGM-CSF 1000U/mL、rhIL-4 500U/mL的GT-T551H3 培養(yǎng)基15mL，靜置培養(yǎng);第3天半量換GT-T551H3培養(yǎng)基，并補加 rhGM-CSF 1000U/mL、rhIL-4 500U/mL;第5天加入腫瘤特異性抗原50ug/mL刺激;第6天加入rhTNF-a 500U/mL，繼續(xù)培養(yǎng) 到第7天。
[0020] 步驟(3)中，懸浮細胞放入5ug/ml的⑶3mAb包被過的培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)，并在培養(yǎng) 基中補加 IFN- γ 1000U/ml及1 %經(jīng)過56°滅活過的自體血漿；第2天補GT-T551H3培養(yǎng)基 20ml，同時添加 IL-2 1000U/mL和1 %經(jīng)過56°滅活過的自體血漿;第3天補GT-T551H3培養(yǎng)基 20ml，同時添加 IL-2 1000U/mL和1 %經(jīng)過56°滅活過的自體血漿;第4天補GT-T551H3培養(yǎng)基 至240ml，同時添加 IL-2 1000U/mL和1 %經(jīng)過56°滅活過的自體血漿，培養(yǎng)至第7天。
[0021]步驟(4)中，將DC細胞和CIK細胞混合，將混合后的細胞轉(zhuǎn)移至1.8L培養(yǎng)袋中，補 GT-T551H3培養(yǎng)基至1000ml，同時添加 IL-2 500U/mL，1 %經(jīng)過56°滅活過的自體血漿，CTLA-4mAb lOOng/mLJD-lmAb 100ng/mL，靜置培養(yǎng)5-7天。
[0022] 步驟(5)中，用0.9wt%氯化鈉溶液洗滌收集的DC-CIK細胞2次，然后向DC-CIK細胞 中加入體積百分比為20 %的人血清白蛋白5mL，并用0.9wt %氯化鈉溶液定容至1 OOmL。
[0023] 所述靜置培養(yǎng)的條件為在溫度為37°C、C02體積百分比為含量為5%、相對飽和濕 度為100%的C0 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0024] 本發(fā)明中一些常用的術(shù)語說明如下：
[0025] IL-2:白細胞介素2;
[0026] IFN- γ :干擾素 γ ;
[0027] CD3mAb:細胞表面分子3單克隆抗體；
[0028] GM-CSF:重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子；
[0029] rhTNF-a:轉(zhuǎn)化生長因子a;
[0030] IL-4:白細胞介素4;
[0031 ] CTLA-4mAb: CTLA-4 單克隆抗體；
[0032] PD-lmAb:PD-l 單克隆抗體。
[0033] 與常規(guī)的培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明的有益效果表現(xiàn)在以下幾方面：
[0034] (1)本發(fā)明所述用于單個核細胞的分離來源于臍血，臍血單個核幾乎沒有受到細 菌、病毒等有害因素的影響，細胞更純，安全性更高。和外周血來源的DC-CIK細胞相比，臍血 DC-CIK細胞有更高的增殖倍數(shù)、更強的殺瘤活性和低的免疫原性；
[0035] (2)本發(fā)明所述用于擴增CIK的方法采用了 5ug/ml⑶3單抗培養(yǎng)瓶包被技術(shù);試驗 表明，附著的單抗比游離的單抗對細胞的促有絲分裂作用更強，從而有助于提高了細胞的 擴增水平；
[0036] (3)本發(fā)明所述用于擴增CIK的方法采用了培養(yǎng)前4天小劑量，連續(xù)刺激的方法，能 夠有效地提高細胞的增殖倍數(shù)；
[0037] (4)本發(fā)明在DC和CIK的共培養(yǎng)過程中添加了 CTLA-4mAb 100ng/mL、PD-lmAb 100ng/mL可以有效抑制DC-CIK細胞中的抑制性T調(diào)節(jié)細胞的含量，提高DC-CIK細胞的殺傷 活性。
[0038] 本發(fā)明通過用CD3mAb包被培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)前期連續(xù)刺激，減少了細胞因子的使用，提 高效應(yīng)細胞群活化效率和擴增效率，同時降低了培養(yǎng)成本;特別是體外加載CTLA4抗體、PD-1抗體以覆蓋所有CIK細胞表面的CTLA4JD-1分子，使其不能和DC上相應(yīng)受體結(jié)合，有效的 降低了 T調(diào)節(jié)細胞的含量，進一步提高CIK細胞對腫瘤的殺傷作用。 (四）【附圖說明】
[0039]圖1為培養(yǎng)第0天CIK細胞⑶3+⑶56+細胞流式細胞儀檢測結(jié)果；
[0040]圖2為培養(yǎng)第0天CIK細胞⑶3+⑶8+細胞流式細胞儀檢測結(jié)果；
[00411圖3為培養(yǎng)第0天CIK細胞⑶4+⑶25+細胞流式細胞儀檢測結(jié)果；
[0042]圖4為培養(yǎng)第7天CIK細胞⑶3+⑶56+細胞流式細胞儀檢測結(jié)果；
[0043]圖5為培養(yǎng)第7天CIK細胞⑶3+⑶8+細胞流式細胞儀檢測結(jié)果；
[0044]圖6為培養(yǎng)第7天CIK細胞⑶4+⑶25+細胞流式細胞儀檢測結(jié)果；
[0045]圖7為培養(yǎng)第7天DC細胞⑶11C+HLA-DR+細胞流式細胞儀檢測結(jié)果；
[0046]圖8為培養(yǎng)第7天DC細胞⑶11 c+⑶83+細胞流式細胞儀檢測結(jié)果；
[0047]圖9為培養(yǎng)第7天DC細胞⑶11 c+⑶86+細胞流式細胞儀檢測結(jié)果；
[0048]圖10為培養(yǎng)第7天DC細胞⑶llc+⑶80+細胞流式細胞儀檢測結(jié)果；
[0049]圖11為培養(yǎng)第14天DC-CIK細胞⑶3+⑶56+細胞流式細胞儀檢測結(jié)果；
[0050]圖12為培養(yǎng)第14天DC-CIK細胞CD3+CD8+細胞流式細胞儀檢測結(jié)果；
[00511圖13為培養(yǎng)第14天DC-CIK細胞CD4+CD25+細胞流式細胞儀檢測結(jié)果。 圖14為DC-CIK細胞增殖曲線圖。 (五)【具體實施方式】 [0052] 實施例：
[0053]本實施例所用試劑如下：
[0054] 臍血，購自山東省齊魯干細胞工程有限公司
[0055] Ficoll，購自 GE 公司；
[0056] IL-2,購自北京同立海源生物科技有限公司；
[0057] ⑶3mAb，購自北京同立海源生物科技有限公司；
[0058] GM-CSF，購自北京同立海源生物科技有限公司；
[0059] IL-4,購自北京同立海源生物科技有限公司；
[0060] rhTNF-a，購自北京同立海源生物科技有限公司；
[0061] IFN-γ，購自北京同立海源生物科技有限公司；
[0062] CTLA-4,購自北京同立海源生物科技有限公司；
[0063] PD-1，購自北京同立海源生物科技有限公司；
[0064] GT-T551H3 培養(yǎng)基，購自 TAKARA公司。
[0065]本實施例所采用的用于擴增DC-CIK的方法：
[0066] 1.臍血單個核的分離和培養(yǎng)
[0067] (1)將血樣平均分裝到50ml離心管中，每管分裝體積不要超過45ml，2000rpm(升速 6、降速4)離心1〇111；[11;
[0068] (2)離心后，吸取離心管內(nèi)上層血漿置于50ml離心管（離心管中血漿56°C滅活 30min;滅活后于4°C存放20min析出蛋白；3000rpm(升速9、降速9)離心10min;離心后吸取上 清置于注明血樣信息及操作日期50ml離心管;4°C保存），吸至距分界面0.5cm處為止，若剩 余血細胞多于15ml，則取上層15ml血細胞置于新離心管，棄去底部剩余；
[0069] (3)用生理鹽水按1:1的比例稀釋血細胞；
[0070] (4)分裝人淋巴細胞分離液至50ml離心管，每支分裝15ml;
[0071] (5)傾斜裝有Ficoll的離心管，緩慢地將上一步稀釋的血樣加到Ficoll液面上， 使其呈清晰界面，血樣與Ficoll比例不超過2:l，1600rpm(升速6、降速4)離心20min;
[0072] (6)離心后，吸棄上清，緩慢吸取白膜層細胞至新的50ml離心管中，加生理鹽水至 45ml，混勾，1500rpm(升速9、降速9)離心10min;
[0073] (7)離心后，棄去上清，沉淀先用5ml生理鹽水重懸，再加生理鹽水至45ml，混勻，取 lml樣本于EP管中，用于計算細胞總量，1300rpm(升速9、降速9)離心10min;
[0074] (8)離心后，棄去上清，沉淀即所需單個核細胞。
[0075] 2. DC細胞的培養(yǎng)
[0076] (1)將分離得到的單個核細胞，用GT-T551H3培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為1*106個/mL接 種到T75培養(yǎng)瓶中，貼壁培養(yǎng)2小時，分離懸浮細胞至T175培養(yǎng)瓶中；
[0077] (2)向貼壁細胞中加入GT-T551H3培養(yǎng)基15mL，并加入rhGM-CSF1000U/mL和rhIL-4 500U/mL，37 °C，7.5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0078] (3)第3天半量換GT-T551H3培養(yǎng)基，補加 rhGM-CSF和rhIL-4使其濃度保持不變； [0079] (4)第5天加入人腎癌細胞系A(chǔ)CHN提取的腫瘤抗原蛋白50ug/mL，第6天加入rhTNF-a500U/mL，繼續(xù)培養(yǎng)到第7天。
[0080] 3.CIK細胞的培養(yǎng)
[00811 (1)用DPBS稀釋的濃度為5μg/ml的CD3單抗10ml包被175cm2培養(yǎng)瓶，4°C包被瓶子 過夜備用；
[0082] (2)使用前⑶3單抗包被培養(yǎng)瓶各洗滌3次，其中PBS 20ml洗2次，培養(yǎng)基20m洗1次， 避免干燥；
[0083] (3)從步驟2中所述的吸出的懸浮細胞放入5ug/ml的⑶3mAb包被過的培養(yǎng)瓶放入 37 °C、5 %二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)中靜置培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中補加 IFN- γ 1000U/ml及1 %經(jīng)過 56°滅活過的自體血漿；
[0084] (4)第2天補GT-T551H3培養(yǎng)基20ml，同時添加 IL-2 1000U/mL和1 %經(jīng)過56°滅活過 的自體血漿；
[0085] (5)第3天補GT-T551H3培養(yǎng)基20ml，同時添加 IL-2 1000U/mL和1 %經(jīng)過56°滅活過 的自體血漿；
[0086] (6)第4天補GT-T551H3培養(yǎng)基至240ml，同時添加 IL-2 1000U/mL和1%經(jīng)過56°滅 活過的自體血漿，培養(yǎng)至第7天。
[0087] 4.DC-CIK細胞的制備
[0088] (1)將培養(yǎng)至第7天的DC與CIK細胞混合，補加 GT-T551H3培養(yǎng)基至1000mL，并添加 CTLA-4mAb 100ng/mL、ro-lmAb 100ng/mL，補加 IL-2 使其濃度保持不變，37°C5%C〇2 培養(yǎng)靜 置培養(yǎng)；
[0089] (2)繼續(xù)培養(yǎng)7天后，離心收集成熟的DC-CIK細胞，并用生理鹽水溶液洗滌2次，將 收集好的細胞加入體積百分比為20%的人血清白蛋白5mL，并用生理鹽水溶液定容至 100mL〇
[0090] 5.結(jié)果測試
[0091] 在第0、7及14天收集由本實施例所述擴增DC-CIK的方法所培養(yǎng)的細胞用于各項測 試。
[0092] (1)細胞增殖倍數(shù)的測定
[0093]將取得的DC-CIK細胞用臺盼藍染色后再用血細胞計數(shù)器進行計數(shù)，將當前的細胞 總數(shù)除以培養(yǎng)前的單個核細胞數(shù)，數(shù)值即為細胞的擴增倍數(shù)。用此方法可以動態(tài)觀察細胞 的增殖狀況，具體情況見下表。

[0095] DC-CIK細胞增殖曲線圖14結(jié)果顯示:細胞經(jīng)過14天的培養(yǎng)增殖了 1720倍。經(jīng)過⑶3 單克隆抗體包被的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)CIK細胞，并通過小劑量連續(xù)刺激的方法，能夠有效提高細胞 的增殖倍數(shù)。
[0096]
[0097]
[0098] (2)細胞表型分析
[0099]分別在第0取單個核細胞、7取DC及CIK細胞，第14天取DC-CIK細胞，制成細胞懸液， 洗滌后調(diào)整細胞濃度為1 X 105u/ml，加入標記的單克隆抗體，于室溫暗處孵育15分鐘，洗去 多余抗體，用上流式細胞儀檢測，結(jié)果下表。
[0103] 結(jié)果顯示:如上表所示，CIK細胞培養(yǎng)前期(0-7天)CD4+⑶25+Treg細胞增殖速度很 快，CD3+CD56+、CD3+CD8+增殖速度相對緩慢，DC、CIK混合培養(yǎng)添加 CTLA-4mAb 100ng/mL、 ro-lmAb 100ng/mL封閉負調(diào)節(jié)細胞后CD4+CD25+百分比迅速下降為0,而CD3+CD56+、CD3+ ⑶8+增殖速度增快，所占百分比逐漸增大。而經(jīng)過7天的培養(yǎng)，DC細胞占較大比例，且有較高 的成熟度。
【主權(quán)項】
1. 一種臍血淋巴細胞DC-CIK的培養(yǎng)方法，以臍血為原始材料，其特征為，包括如下步 驟：（1)從臍血中分離出臍血單個核細胞，重懸于GT-T551H3培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)；（2)從步驟 (1)中制得的培養(yǎng)液中吸出懸浮細胞;貼壁細胞加入含有rhGM-CSF和rhIL-4的GT-T551H3培 養(yǎng)基，靜置培養(yǎng);第3天半量換GT-T551H3培養(yǎng)基，并補加 rhGM-CSF和rhIL-4;第5天加入腫瘤 特異性抗原刺激;第6天加入rhTNF-a，繼續(xù)培養(yǎng)到第7天，得到DC細胞；（3)吸出的懸浮細胞 放入⑶3mAb包被過的培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中補加 IFN-γ及經(jīng)滅活過的自體血 漿;第2天補GT-T551H3培養(yǎng)基，同時添加 IL-2和經(jīng)滅活過的自體血漿;第3天補GT-T551H3培 養(yǎng)基，同時添加兒-2和％經(jīng)滅活過的自體血漿;第4天補GT-T551H3培養(yǎng)基，同時添加 IL-2和 經(jīng)滅活過的自體血漿，培養(yǎng)至第7天，得到CIK細胞；（4)將DC細胞和CIK細胞混合，將混合后 的細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)袋中，補GT-T551H3培養(yǎng)基，同時添加 IL-2、經(jīng)滅活過的自體血漿、CTLA-4mAb和PD-lmAb，靜置培養(yǎng)5-7天，得到DC-CIK細胞；（5)第14天將培養(yǎng)好的DC-CIK細胞離心 收集，并用氯化鈉溶液洗滌，再向收集好的細胞中加入人血清白蛋白，并用氯化鈉溶液定 容，得到產(chǎn)品。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的臍血淋巴細胞DC-CIK的培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟（1)中， GT-T551H3培養(yǎng)基中，臍血單個核細胞的細胞濃度為(1-2) X 106個/mL，靜置培養(yǎng)2小時。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的臍血淋巴細胞DC-CIK的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(2)中，貝占 壁細胞加入含有rhGM-CSF 1000U/mL、rhIL-4 500U/mL的GT-T551H3培養(yǎng)基15mL，靜置培養(yǎng)； 第3天半量換GT-T551H3培養(yǎng)基，并補加 rhGM-CSF 1000U/mL、rhIL-4 500U/mL;第5天加入腫 瘤特異性抗原50ug/mL刺激;第6天加入rhTNF-a500U/mL，繼續(xù)培養(yǎng)到第7天。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的臍血淋巴細胞DC-CIK的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(3)中，懸 浮細胞放入5ug/ml的CD3mAb包被過的培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中補加 IFN-γ 1000U/ ml及1 %經(jīng)過56°滅活過的自體血漿;第2天補GT-T551H3培養(yǎng)基20ml，同時添加 IL-2 1000U/ mL和1 %經(jīng)過56°滅活過的自體血漿;第3天補GT-T551H3培養(yǎng)基20ml，同時添加 IL-2 1000U/ mL和1 %經(jīng)過56°滅活過的自體血漿；第4天補GT-T551H3培養(yǎng)基至240ml，同時添加 IL-2 1000U/mL和1 %經(jīng)過56°滅活過的自體血漿，培養(yǎng)至第7天。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的臍血淋巴細胞DC-CIK的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(4)中，將 DC細胞和CIK細胞混合，將混合后的細胞轉(zhuǎn)移至1.8L培養(yǎng)袋中，補GT-T551H3培養(yǎng)基至 1000ml，同時添加 IL-2 500U/mL，1 %經(jīng)過56° 滅活過的自體血漿，<：11^-411^1310〇1^/11^、？〇-lmAb 100ng/mL，靜置培養(yǎng) 5-7 天。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的臍血淋巴細胞DC-CIK的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(5)中，用 0.9wt %氯化鈉溶液洗滌收集的DC-CIK細胞2次，然后向DC-CIK細胞中加入體積百分比為 20%的人血清白蛋白5mL，并用0.9wt%氯化鈉溶液定容至100mL。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的臍血淋巴細胞DC-DIK的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述靜置培養(yǎng) 的條件為在溫度為37°C、C02體積百分比為含量為5%、相對飽和濕度為100%的C0 2培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)。
【文檔編號】C12N5/0783GK105969727SQ201510999660
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2015年12月29日
【發(fā)明人】張慧慧, 王芝輝, 武建明, 張劍慧, 譚毅
【申請人】山東省齊魯細胞治療工程技術(shù)有限公司