降解甲醛的微生物酶制劑的制備工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種降解甲醛的微生物酶制劑的制備工藝。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，針對(duì)現(xiàn)有降解甲醛的微生物酶制劑生產(chǎn)技術(shù)存在的酶產(chǎn)量和酶活力的不足，提供一種采用甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物發(fā)酵培養(yǎng)并提取制備微生物酶制劑的工藝。本發(fā)明制備降解甲醛的微生物酶制劑的工藝包括如下步驟：對(duì)甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物菌株進(jìn)行種子液培養(yǎng)；接種種子液進(jìn)行補(bǔ)料流加發(fā)酵培養(yǎng)；收集發(fā)酵菌體，提取純化胞內(nèi)降解甲醛的酶，制成微生物酶制劑。
【專利說(shuō)明】
降解甲醛的微生物酶制劑的制備工藝
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及降解甲醛的微生物酶制劑的制備工藝?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]室內(nèi)甲醛污染對(duì)人類生活造成巨大威脅，包括在建筑居住空間內(nèi)和在汽車之類的密閉空間內(nèi)。室內(nèi)甲醛主要來(lái)源于室內(nèi)裝修物以及一些皮制制品，還有各種不符合國(guó)家生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)的非法材料。我國(guó)規(guī)定，室內(nèi)甲醛含量不能超過(guò)〇.〇8mg/m3,高濃度甲醛會(huì)引起眼部、 咽喉不適、胸悶、氣喘、皮炎等，還有可怕的致癌風(fēng)險(xiǎn)。
[0003]目前看來(lái)，使用微生物治理甲醛是一種高效、節(jié)約、綠色環(huán)保的新方法。采用甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物來(lái)代謝降解甲醛是順應(yīng)微生物技術(shù)發(fā)展的結(jié)果，各國(guó)研究人員都在篩選降解甲醛能力優(yōu)良的甲基營(yíng)養(yǎng)菌。在申請(qǐng)?zhí)枮?01010204536.7的發(fā)明中，發(fā)明人篩選出一株惡臭假單胞菌xyz-z jut，用來(lái)降解甲醛，該菌株對(duì)甲醛的耐受濃度可達(dá)6g/L，35小時(shí)內(nèi)可全部降解4g/L的甲醛;在申請(qǐng)?zhí)枮?01010185446.8的發(fā)明中，發(fā)明人篩選出一株蠟狀芽孢桿菌 BZ-001H，將其應(yīng)用于高濃度甲醛廢水處理與甲醛突發(fā)污染事故應(yīng)急處理。但直接使用甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物降解甲醛需要有載體培養(yǎng)菌體，且要和含甲醛物品直接接觸，難以在家居生活中進(jìn)行應(yīng)用。
[0004]已經(jīng)的代謝甲醛的途徑，包括核酮糖單磷酸途徑和絲氨酸途徑的同化途徑，也包括四氫葉酸途徑、四氫甲烷蝶呤途徑、谷胱甘肽途徑這三種異化途徑。在微生物異化甲醛的谷胱甘肽途徑過(guò)程中，有甲醛激活酶、谷胱甘肽甲醛脫氫酶、甲酰谷胱甘肽水解酶和甲酸脫氫酶參與；在四氫葉酸途徑中，有亞甲基脫氫酶、次甲基環(huán)化水解酶和甲酸脫氫酶參與；在四氫甲烷蝶呤途徑中，有甲酸激活酶、亞甲基脫氫酶、次甲基環(huán)化水解酶、甲酰轉(zhuǎn)移酶/水解酶復(fù)合體等參與。在這一系列的酶的作用下，甲醛進(jìn)入連鎖反應(yīng)被降解。于是從甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物內(nèi)提取生物酶，直接用酶制劑來(lái)進(jìn)行快速的甲醛處理成為新的研究方向。
[0005]在申請(qǐng)?zhí)枮?01080025041.6的發(fā)明中，發(fā)明人利用提取自惡臭假單胞菌的甲醛歧化酶制備溶液來(lái)降解樹脂中的甲醛;在申請(qǐng)?zhí)枮?01210583389.8的發(fā)明中，發(fā)明人在含醛環(huán)境中培養(yǎng)擬南芥，提取酶液和輔助制劑配合，得到甲醛生物降解劑；在申請(qǐng)?zhí)枮?201110054640.7的發(fā)明中，發(fā)明人培養(yǎng)一株假單胞菌10FA1，提取甲醛脫氫酶，制備甲醛生物降解劑。提取微生物酶來(lái)降解甲醛，是治理家居生活中甲醛的好思路。但現(xiàn)有技術(shù)應(yīng)用存在著瓶頸，一是難以規(guī)?；苽浯祟愇⑸锩钢苿请y以保證獲得的酶制劑保持高活力。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是:針對(duì)上述現(xiàn)有降解甲醛的微生物酶制劑生產(chǎn)技術(shù)存在的酶產(chǎn)量和酶活力的不足，提供一種采用甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物發(fā)酵培養(yǎng)并提取制備酶的工〇
[0007]本發(fā)明針對(duì)上述問(wèn)題而提出的技術(shù)方案是:1.將甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物菌株接種于培養(yǎng)基A，進(jìn)行種子液培養(yǎng)；2.將培養(yǎng)一段時(shí)間的種子液，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基B，使用補(bǔ)料液C進(jìn)行流加培養(yǎng)；3.發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心，收集獲得菌體；4.使用磷酸氫二鈉-磷酸氫鈉緩沖液洗滌菌體，獲得菌懸液；5.使用超聲波破碎機(jī)破碎菌懸液，獲得破碎菌懸液；6.使用微濾膜過(guò)濾破碎菌懸液，去除殘余菌體，獲得胞內(nèi)物質(zhì)溶液；7.將飽和硫酸銨溶液與上述胞內(nèi)物質(zhì)溶液混合，保持4°C條件沉淀3-5小時(shí)后，以 10000-15000 r/min轉(zhuǎn)速，離心5-15 min，收集底層沉淀，獲得沉淀物質(zhì)，再次溶解沉淀物質(zhì)獲得粗提酶液；8.使用超濾膜濾掉粗提酶液中的小于20KD的雜蛋白；9.使用離子交換柱對(duì)上述粗提酶液進(jìn)行吸附脫鹽，獲得去鹽的粗提酶液；10.對(duì)去鹽的粗提酶液進(jìn)行凝膠柱層析，分離得到精提酶液；11.使用冷凍干燥機(jī)對(duì)精提酶液進(jìn)行冷凍干燥，獲得微生物酶制劑。
[0008]與現(xiàn)有降解甲醛的微生物酶制劑制備技術(shù)相比，采用本發(fā)明技術(shù)方案的優(yōu)點(diǎn)是:1.以補(bǔ)料液流加培養(yǎng)方式，實(shí)時(shí)補(bǔ)充碳氮源，保持菌體持續(xù)生長(zhǎng)，刺激代謝甲醛活力， 從甲基營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌中提取胞內(nèi)生物酶系，最終獲得的微生物酶產(chǎn)量得到明顯的提升；2.最終獲得的微生物酶活力得到顯著的提高，可高效處理家居生活中的甲醛?！靖綀D說(shuō)明】
[0009]圖1是降解甲醛的微生物酶制劑的制備工藝的流程圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0010]本發(fā)明降解甲醛的微生物酶制劑的制備工藝的優(yōu)選實(shí)施方案的具體內(nèi)容是:1.將甲基營(yíng)養(yǎng)型菌株接種于裝有培養(yǎng)基A的三角瓶中，使用搖床培養(yǎng)培養(yǎng)，設(shè)置搖床條件，轉(zhuǎn)速在180r/min，溫度在35°C，培養(yǎng)12-18小時(shí)；2.將種子液接種于裝有培養(yǎng)基B的裝料系數(shù)為60%發(fā)酵罐中，接種量為2-4%，控制發(fā)酵溫度在25-30°C，轉(zhuǎn)速在200-500r/min，通氣量在0.8v/v/min，pH在7-8;當(dāng)發(fā)酵液中糖濃度低于5g/L時(shí)，開(kāi)始補(bǔ)料操作，控制補(bǔ)料液C的補(bǔ)料速度在0.4-0.6g/L/h，培養(yǎng)過(guò)程持續(xù)48-72 小時(shí)，在發(fā)酵結(jié)束前8小時(shí)停止補(bǔ)料；3.對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心，收集菌體；4.使用磷酸氫二鈉-磷酸氫鈉緩沖液洗滌菌體，制成菌懸液；5.將破碎機(jī)探頭(設(shè)置破碎功率為500W、破碎時(shí)間為6S、破碎時(shí)間間隔為8S)插入菌懸液，使得探頭一半長(zhǎng)度沉沒(méi)入菌懸液中，獲得破碎菌懸液；6.使用微濾膜對(duì)破碎菌懸液進(jìn)行過(guò)濾，去除殘余菌體，獲得胞內(nèi)物質(zhì)溶液；7.將飽和硫酸銨溶液與上述胞內(nèi)物質(zhì)溶液混合，保持4°C條件沉淀3-5小時(shí)后，以 10000-15000 r/min轉(zhuǎn)速，離心5-15 min，收集底層沉淀。將沉淀復(fù)溶于濃度為10-20 mmol/ L的Tris-HCl緩沖液，獲得粗提酶液；8.使用超濾膜濾掉上述粗提酶液中的小于20KD的雜蛋白；9.再使用離子交換柱(D201型樹脂、裝柱高度50cm、柱內(nèi)徑3cm)對(duì)上述粗提酶液進(jìn)行吸附脫鹽，控制進(jìn)樣流速在8-12 V/h，獲得去鹽的粗提酶液；10.使用凝膠層析柱(裝柱高度50cm、柱內(nèi)徑3cm)對(duì)去鹽的粗提酶液進(jìn)行層析，分離得到精提酶液；11.使用冷凍干燥機(jī)對(duì)精提酶液進(jìn)行冷凍干燥，獲得微生物酶制劑。
[0011]首次對(duì)所述甲基營(yíng)養(yǎng)型菌株進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，需要進(jìn)行菌種復(fù)壯，菌種復(fù)壯方法為: 將菌株從保藏狀態(tài)緩慢解凍，恢復(fù)到室溫狀態(tài)，將解凍的菌種挑到固體LB培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，進(jìn)行菌種復(fù)壯；1.挑選培養(yǎng)基中成長(zhǎng)茁壯的菌落，挑選大塊的菌落接種到新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；2.重復(fù)上述步驟數(shù)次，使得菌種復(fù)壯。
[0012]所述微生物酶制劑的制備工藝中的甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物從德國(guó)微生物保藏中心購(gòu)買，保藏編號(hào)為DSM21893，屬于ifetAj^/oAacteri?[〇〇13]所述生物補(bǔ)料液以流加培養(yǎng)的方式進(jìn)行補(bǔ)料，優(yōu)選補(bǔ)料速度在0.4-0.6g/L/h。也可以根據(jù)實(shí)際發(fā)酵情況，采用間歇式補(bǔ)料的方法進(jìn)行補(bǔ)料。
[0014]培養(yǎng)基中添加亞硫酸鈉，能增強(qiáng)甲基營(yíng)養(yǎng)菌的甲醛代謝能力。使用破碎機(jī)時(shí)，功率設(shè)置不可過(guò)大，否則會(huì)造成大量酶損失。在實(shí)際分離純化過(guò)程中，可以靈活調(diào)節(jié)各種參數(shù)， 平衡酶的損失和酶的純度。本發(fā)明最終獲得微生物酶制劑是包括甲醛脫氫酶在內(nèi)的降解甲醛的微生物酶系。
[0015]獲得微生物酶制劑后，以分光光度法測(cè)定其對(duì)甲醛的降解活性。
[0016]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施例1取20個(gè)容量為250ml的三角瓶，往每瓶裝入50ml培養(yǎng)基A(蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/ L、牛肉膏10 g/L、氯化鈉10 g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、甲醛2g/L)，封口三角瓶，于121°C滅菌 30min。往滅菌后的三角瓶中接種菌株，使用搖床培養(yǎng)，設(shè)置搖床條件，轉(zhuǎn)速在180r/min，溫度在35°C，培養(yǎng)12-18小時(shí);將培養(yǎng)完畢的種子液以2%接種量接種于裝有30L培養(yǎng)基B(蔗糖 40 g/L、豆柏水解液50 g/L、酵母膏5 g/L、硫酸亞鐵5 mg/L、甲醛2 g/L、磷酸二氫鉀0.5 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、硫酸錳10m g/L、亞硫酸鈉2 g/L)的發(fā)酵罐中，控制溫度在25°C左右，通氣速率在0.8v/v/min，pH在7-8。當(dāng)發(fā)酵液中鹿糖濃度低于5g/L時(shí)，開(kāi)始連續(xù)流加補(bǔ)料液C(鹿糖30 g/L、豆柏水解液40 g/L、酵母膏4 g/L、甲醛1.5 g/L、亞硫酸鈉1.5 g/L)，持續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，在發(fā)酵結(jié)束前8小時(shí)停止流加培養(yǎng)液。
[0017]對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心，收集菌體;使用磷酸氫二鈉-磷酸氫鈉緩沖液洗滌菌體，制成菌懸液;將破碎機(jī)探頭(設(shè)置破碎功率為500W、破碎時(shí)間為6S、破碎時(shí)間間隔為8S)插入菌懸液，使得探頭一半長(zhǎng)度沉沒(méi)入菌懸液中，獲得破碎菌懸液;使用微濾膜對(duì)破碎菌懸液進(jìn)行過(guò)濾，去除殘余菌體，獲得胞內(nèi)物質(zhì)溶液;將飽和硫酸銨溶液與上述胞內(nèi)物質(zhì)溶液混合，保持4 °(:條件沉淀3-5小時(shí)后，以10000-15000 r/min轉(zhuǎn)速，離心5-15 min，收集底層沉淀。將沉淀復(fù)溶于濃度為10-20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，獲得粗提酶液;使用超濾膜濾掉上述粗提酶液中的小于20KD的雜蛋白；再使用離子交換柱(D201型樹脂，裝柱高度50 cm，柱內(nèi)徑3 cm)對(duì)上述粗提酶液進(jìn)行吸附脫鹽，控制進(jìn)樣流速在8 V/h，獲得去鹽的粗提酶液;使用凝膠層析柱(裝柱高度50 cm，柱內(nèi)徑3 cm)對(duì)去鹽的粗提酶液進(jìn)行層析，分離得到精提酶液;使用冷凍干燥機(jī)對(duì)精提酶液進(jìn)行冷凍干燥，獲得微生物酶制劑，產(chǎn)量為33.03g，獲得的酶活為48.55U/mg〇 [〇〇18] 實(shí)施例2取20個(gè)容量為250ml的三角瓶，往每瓶裝入50ml培養(yǎng)基A(蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/ L、牛肉膏10 g/L、氯化鈉10 g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、甲醛2g/L)，封口三角瓶，于121°C滅菌 30min。往滅菌后的三角瓶中接種復(fù)壯菌株，使用搖床培養(yǎng)，設(shè)置搖床條件，轉(zhuǎn)速在180r/ min，溫度在35°C，培養(yǎng)12-18小時(shí)。將培養(yǎng)完畢的種子液以3%接種量接種于裝有30L培養(yǎng)基B (鹿糖45 g/L、豆柏水解液60 g/L、酵母膏6 g/L、硫酸亞鐵6m g/L、甲醛2 g/L、磷酸二氫鉀 0.6 g/L、硫酸鎂0.5g/L、硫酸錳20m g/L、亞硫酸鈉2 g/L)的發(fā)酵罐中，控制溫度在25°C 左右，通氣速率在〇.8v/v/min，pH在7-8。當(dāng)發(fā)酵液中鹿糖濃度低于5g/L時(shí)，開(kāi)始連續(xù)流加補(bǔ)料液C(蔗糖35 g/L、豆柏水解液50 g/L、酵母膏5 g/L、甲醛2 g/L、亞硫酸鈉3g/L)，持續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，在發(fā)酵結(jié)束前8小時(shí)停止流加培養(yǎng)液。
[0019]對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心，收集菌體;使用磷酸氫二鈉-磷酸氫鈉緩沖液洗滌菌體，制成菌懸液;將破碎機(jī)探頭(設(shè)置破碎功率為500W、破碎時(shí)間為6S、破碎時(shí)間間隔為8S)插入菌懸液，使得探頭一半長(zhǎng)度沉沒(méi)入菌懸液中，獲得破碎菌懸液;使用微濾膜對(duì)破碎菌懸液進(jìn)行過(guò)濾，去除殘余菌體，獲得胞內(nèi)物質(zhì)溶液;將飽和硫酸銨溶液與上述胞內(nèi)物質(zhì)溶液混合，保持4 °(:條件沉淀3-5小時(shí)后，以10000-15000 r/min轉(zhuǎn)速，離心5-15 min，收集底層沉淀。將沉淀復(fù)溶于濃度為10-20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，獲得粗提酶液;使用超濾膜濾掉上述粗提酶液中的小于20KD的雜蛋白；再使用離子交換柱(D201型樹脂、裝柱高度50 cm、柱內(nèi)徑3 cm)對(duì)上述粗提酶液進(jìn)行吸附脫鹽，控制進(jìn)樣流速在9 V/h，獲得去鹽的粗提酶液;使用凝膠層析柱(裝柱高度50 cm、柱內(nèi)徑3 cm)對(duì)去鹽的粗提酶液進(jìn)行層析，分離得到精提酶液;使用冷凍干燥機(jī)對(duì)精提酶液進(jìn)行冷凍干燥，獲得微生物酶制劑，產(chǎn)量為33.66g，酶活為 44.28U/mg〇
[0020]實(shí)施例3取24個(gè)容量為250ml的三角瓶，往每瓶裝入60ml培養(yǎng)基A(蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/ L、牛肉膏10 g/L、氯化鈉10 g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、甲醛2g/L)，封口三角瓶，于121°C滅菌 30min。往滅菌后的三角瓶中接種復(fù)壯菌株，使用搖床培養(yǎng)，設(shè)置搖床條件，轉(zhuǎn)速在180r/ min，溫度在35°C，培養(yǎng)12-18小時(shí)。將培養(yǎng)完畢的種子液以4%接種量接種于裝有30L培養(yǎng)基B (鹿糖80 g/L、豆柏水解液60 g/L、酵母膏8 g/L、硫酸亞鐵5 mg/L、甲醛2 g/L、磷酸二氫鉀 0.8 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳40m g/L、亞硫酸鈉2 g/L)的發(fā)酵罐中，控制溫度在25°C左右，通氣速率在0.8v/v/min，pH在7-8。當(dāng)發(fā)酵液中鹿糖濃度低于5g/L時(shí)，開(kāi)始連續(xù)流加補(bǔ)料液C(蔗糖50 g/L、豆柏水解液50 g/L、酵母膏6 g/L、甲醛1.5 g/L、亞硫酸鈉1.5 g/L)，持續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，在發(fā)酵結(jié)束前8小時(shí)停止流加培養(yǎng)液。[0021 ]對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心，收集菌體;使用磷酸氫二鈉-磷酸氫鈉緩沖液洗滌菌體，制成菌懸液;將破碎機(jī)探頭(設(shè)置破碎功率為500W、破碎時(shí)間為6S、破碎時(shí)間間隔為8S)插入菌懸液，使得探頭一半長(zhǎng)度沉沒(méi)入菌懸液中，獲得破碎菌懸液;使用微濾膜對(duì)破碎菌懸液進(jìn)行過(guò)濾，去除殘余菌體，獲得胞內(nèi)物質(zhì)溶液;將飽和硫酸銨溶液與上述胞內(nèi)物質(zhì)溶液混合，保持4 °(:條件沉淀3-5小時(shí)后，以10000-15000 r/min轉(zhuǎn)速，離心5-15 min，收集底層沉淀。將沉淀復(fù)溶于濃度為10-20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，獲得粗提酶液;使用超濾膜濾掉上述粗提酶液中的小于20KD的雜蛋白；再使用離子交換柱(D201型樹脂、裝柱高度50 cm、柱內(nèi)徑3cm)對(duì)上述粗提酶液進(jìn)行吸附脫鹽，控制進(jìn)樣流速在lOV/h，獲得去鹽的粗提酶液;使用凝膠層析柱(裝柱高度50 cm、柱內(nèi)徑3 cm)對(duì)去鹽的粗提酶液進(jìn)行層析，分離得到精提酶液;使用冷凍干燥機(jī)對(duì)精提酶液進(jìn)行冷凍干燥，獲得微生物酶制劑，產(chǎn)量為33.12g，酶活為 42.18U/mg〇 [〇〇22] 實(shí)施例4取24個(gè)容量為250ml的三角瓶，往每瓶裝入60ml培養(yǎng)基A(蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/ L、牛肉膏10 g/L、氯化鈉10 g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、甲醛2g/L)，封口三角瓶，于121°C滅菌 30min。往滅菌后的三角瓶中接種復(fù)壯菌株，使用搖床培養(yǎng)，設(shè)置搖床條件，轉(zhuǎn)速在180r/ min，溫度在35°C，培養(yǎng)12-18小時(shí)。將培養(yǎng)完畢的種子液以4%接種量接種于裝有30L培養(yǎng)基B (鹿糖80 g/L、豆柏水解液60 g/L、酵母膏8 g/L、硫酸亞鐵8mg/L、甲醛6 g/L、磷酸二氫鉀 0.8 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳50m g/L、亞硫酸鈉2 g/L)的發(fā)酵罐中，控制溫度在25°C 左右，通氣速率在〇.8v/v/min，pH在7-8。當(dāng)發(fā)酵液中鹿糖濃度低于5g/L時(shí)，開(kāi)始連續(xù)流加補(bǔ)料液C(蔗糖50 g/L、豆柏水解液50 g/L、酵母膏6 g/L、甲醛1.5 g/L、亞硫酸鈉1.5 g/L)，持續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，在發(fā)酵結(jié)束前8小時(shí)停止流加培養(yǎng)液。
[0023]對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心，收集菌體;使用磷酸氫二鈉-磷酸氫鈉緩沖液洗滌菌體，制成菌懸液;將破碎機(jī)探頭(設(shè)置破碎功率為500W、破碎時(shí)間為6S、破碎時(shí)間間隔為8S)插入菌懸液，使得探頭一半長(zhǎng)度沉沒(méi)入菌懸液中，獲得破碎菌懸液;使用微濾膜對(duì)破碎菌懸液進(jìn)行過(guò)濾，去除殘余菌體，獲得胞內(nèi)物質(zhì)溶液;將飽和硫酸銨溶液與上述胞內(nèi)物質(zhì)溶液混合，保持4 °(:條件沉淀3-5小時(shí)后，以10000-15000 r/min轉(zhuǎn)速，離心5-15 min，收集底層沉淀。將沉淀復(fù)溶于濃度為10-20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，獲得粗提酶液;使用超濾膜濾掉上述粗提酶液中的小于20KD的雜蛋白；再使用離子交換柱(D201型樹脂、裝柱高度50 cm、柱內(nèi)徑3 cm)對(duì)上述粗提酶液進(jìn)行吸附脫鹽，控制進(jìn)樣流速在10V/h，獲得去鹽的粗提酶液;使用凝膠層析柱(裝柱高度50 cm、柱內(nèi)徑3 cm)對(duì)去鹽的粗提酶液進(jìn)行層析，分離得到精提酶液;使用冷凍干燥機(jī)對(duì)精提酶液進(jìn)行冷凍干燥。獲得微生物酶制劑，產(chǎn)量為31.6 2 g，酶活為 49.18U/mg〇
[0024]實(shí)施例5取20個(gè)容量為250ml的三角瓶，往每瓶裝入50ml培養(yǎng)基A(蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/ L、牛肉膏10 g/L、氯化鈉10 g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、甲醛2g/L)，封口三角瓶，于121°C滅菌 30min。往滅菌后的三角瓶中接種復(fù)壯菌株，使用搖床培養(yǎng)，設(shè)置搖床條件，轉(zhuǎn)速在180r/ min，溫度在35°C，培養(yǎng)12-18小時(shí)。將培養(yǎng)完畢的種子液以3%接種量接種于裝有30L培養(yǎng)基B (鹿糖80 g/L、豆柏水解液100 g/L、酵母膏10 g/L、硫酸亞鐵10 mg/L、甲醛4 g/L、磷酸二氫鉀lg/L、硫酸鎂0.3g/L、硫酸錳50m g/L、亞硫酸鈉4g/L)的發(fā)酵罐中，控制溫度在25°C左右，通氣速率在0.8v/v/min，pH在7-8。當(dāng)發(fā)酵液中鹿糖濃度低于5g/L時(shí)，開(kāi)始連續(xù)流加補(bǔ)料液C(鹿糖60 g/L、豆柏水解液80 g/L、酵母膏6 g/L、甲醛3 g/L、亞硫酸鈉3 g/L)，持續(xù)培養(yǎng) 48-72小時(shí)，在發(fā)酵結(jié)束前8小時(shí)停止流加培養(yǎng)液。
[0025]對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心，收集菌體;使用磷酸氫二鈉-磷酸氫鈉緩沖液洗滌菌體，制成菌懸液;將破碎機(jī)探頭(設(shè)置破碎功率為500W、破碎時(shí)間為6S、破碎時(shí)間間隔為8S)插入菌懸液，使得探頭一半長(zhǎng)度沉沒(méi)入菌懸液中，獲得破碎菌懸液;使用微濾膜對(duì)破碎菌懸液進(jìn)行過(guò)濾，去除殘余菌體，獲得胞內(nèi)物質(zhì)溶液;將飽和硫酸銨溶液與上述胞內(nèi)物質(zhì)溶液混合，保持4°(:條件沉淀3-5小時(shí)后，以10000-15000 r/min轉(zhuǎn)速，離心5-15 min，收集底層沉淀。將沉淀復(fù)溶于濃度為10-20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，獲得粗提酶液;使用超濾膜濾掉上述粗提酶液中的小于20KD的雜蛋白；再使用離子交換柱(D201型樹脂、裝柱高度50 cm、柱內(nèi)徑3 cm)對(duì)上述粗提酶液進(jìn)行吸附脫鹽，控制進(jìn)樣流速在10 V/h，獲得去鹽的粗提酶液;使用凝膠層析柱(裝柱高度50 cm、柱內(nèi)徑3 cm)對(duì)去鹽的粗提酶液進(jìn)行層析，分離得到精提酶液； 使用冷凍干燥機(jī)對(duì)精提酶液進(jìn)行冷凍干燥，獲得微生物酶制劑，產(chǎn)量為30.54g，酶活為 47.18U/mg〇
[0026]實(shí)施例6取20個(gè)容量為250ml的三角瓶，往每瓶裝入50ml培養(yǎng)基A(蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/ L、牛肉膏10 g/L、氯化鈉10 g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、甲醛2g/L)，封口三角瓶，于121°C滅菌 30min。往滅菌后的三角瓶中接種復(fù)壯菌株，使用搖床培養(yǎng)，設(shè)置搖床條件，轉(zhuǎn)速在180r/ min，溫度在35°C，培養(yǎng)12-18小時(shí)。將培養(yǎng)完畢的種子液以3%接種量接種于裝有30L培養(yǎng)基B (鹿糖80 g/L、豆柏水解液100 g/L、酵母膏10 g/L、硫酸亞鐵10m g/L、甲醛4 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳50m g/L、亞硫酸鈉4g/L)的發(fā)酵罐中，控制溫度在25°C左右，通氣速率在0.8v/v/min，pH在7-8。當(dāng)發(fā)酵液中鹿糖濃度低于5g/L時(shí)，開(kāi)始連續(xù)流加補(bǔ)料液C(鹿糖60 g/L、豆柏水解液80 g/L、酵母膏6 g/L、甲醛3 g/L、亞硫酸鈉3 g/L)，持續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，在發(fā)酵結(jié)束前8小時(shí)停止流加培養(yǎng)液。
[0027]對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心，收集菌體;使用磷酸氫二鈉-磷酸氫鈉緩沖液洗滌菌體，制成菌懸液;將破碎機(jī)探頭(設(shè)置破碎功率為500W、破碎時(shí)間為6S、破碎時(shí)間間隔為8S)插入菌懸液，使得探頭一半長(zhǎng)度沉沒(méi)入菌懸液中，獲得破碎菌懸液;使用微濾膜對(duì)破碎菌懸液進(jìn)行過(guò)濾，去除殘余菌體，獲得胞內(nèi)物質(zhì)溶液;將飽和硫酸銨溶液與上述胞內(nèi)物質(zhì)溶液混合，保持4 °(:條件沉淀3-5小時(shí)后，以10000-15000 r/min轉(zhuǎn)速，離心5-15 min，收集底層沉淀。將沉淀復(fù)溶于濃度為10-20mmol/L的Tris-HCl緩沖液，獲得粗提酶液;使用超濾膜濾掉上述粗提酶液中的小于20KD的雜蛋白；再使用離子交換柱(D201型樹脂、裝柱高度50 cm、柱內(nèi)徑3 cm) 對(duì)上述粗提酶液進(jìn)行吸附脫鹽，控制進(jìn)樣流速在12V/h，獲得去鹽的粗提酶液;使用凝膠層析柱(裝柱高度50 cm、柱內(nèi)徑3 cm)對(duì)去鹽的粗提酶液進(jìn)行層析，分離得到精提酶液;使用冷凍干燥機(jī)對(duì)精提酶液進(jìn)行冷凍干燥。獲得微生物酶制劑，產(chǎn)量為30.9g，酶活為52.45U/mg〇
[0028]上述內(nèi)容，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非用于限制本發(fā)明的實(shí)施方案，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的主要構(gòu)思和精神，可以十分方便地進(jìn)行相應(yīng)的變通或修改，故本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以權(quán)利要求書所要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.降解甲醛的微生物酶制劑的制備工藝，其特征是，包括以下步驟:(I)將甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物菌株接種于培養(yǎng)基A，進(jìn)行種子液培養(yǎng)；(2 )將培養(yǎng)一段時(shí)間的種子液，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基B，使用補(bǔ)料液C進(jìn)行流加培養(yǎng)；(3 )發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心，收集獲得菌體；(4)使用磷酸氫二鈉-磷酸氫鈉緩沖液洗滌菌體，獲得菌懸液；(5 )使用超聲波破碎機(jī)破碎菌懸液，獲得破碎菌懸液；(6)使用微濾膜過(guò)濾破碎菌懸液，去除殘余菌體，獲得胞內(nèi)物質(zhì)溶液；(7)將飽和硫酸銨溶液與上述胞內(nèi)物質(zhì)溶液混合，保持4°C條件沉淀3-5小時(shí)后，以 10000-15000 r/min轉(zhuǎn)速，離心5-15 min，收集底層沉淀，獲得沉淀物質(zhì)，再次溶解沉淀物質(zhì) 獲得粗提酶液；(8)使用超濾膜濾掉粗提酶液中的小于20KD的雜蛋白；(9)使用離子交換柱對(duì)上述粗提酶液進(jìn)行吸附脫鹽，獲得去鹽的粗提酶液；(10 )對(duì)去鹽的粗提酶液進(jìn)行凝膠柱層析，分離得到精提酶液；(II)使用冷凍干燥機(jī)對(duì)精提酶液進(jìn)行冷凍干燥，獲得微生物酶制劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降解甲醛的微生物酶制劑的制備工藝，其特征是，所述的培養(yǎng) 基和補(bǔ)料液的成份包括如下:培養(yǎng)基A:蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、牛肉膏10 g/L、氯化鈉10 g/L、磷酸二氫鉀 0.58/1、甲醛28/1;培養(yǎng)基B:蔗糖40-80 g/L、豆柏水解液50-100 g/L、酵母膏5-10 g/L、硫酸亞鐵5-1〇11^凡、甲醛2-6 8凡、磷酸二氫鉀0.5-]^凡、硫酸鎂0.1-〇.5 8凡、硫酸猛1〇-5〇1118凡、亞硫 酸鈉 1-4 g/L;補(bǔ)料液C:鹿糖30-60 g/L、豆柏水解液40-80 g/L、酵母膏4-8 g/L、甲醛1-4 g/L、亞硫 酸鈉 1-4 g/L。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的降解甲醛的微生物酶制劑的制備工藝，其特征是:所述種 子液接種量為2-4%，發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程在50L發(fā)酵罐中進(jìn)行，裝料系數(shù)為60%;發(fā)酵條件為溫度 25-30°C;補(bǔ)料液C的補(bǔ)料速度為0.4-0.6g/ L /h。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降解甲醛的微生物酶制劑的制備工藝，其特征是:所述離子交 換柱采用D201型樹脂進(jìn)行柱填充，柱內(nèi)徑3cm，裝柱高度30-50cm;優(yōu)化的工藝條件為，進(jìn)樣 流速6-10 V/h、溫度20-25°C。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的降解甲醛的微生物酶制劑的制備工藝，其特征是:所述凝膠柱 采用葡萄糖凝膠進(jìn)行柱填充，柱內(nèi)徑3cm，裝柱高度20-50 cm;優(yōu)化的工藝條件為，進(jìn)樣流速 8-12 V/h〇
【文檔編號(hào)】B01D53/85GK105969743SQ201610354693
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年5月26日
【發(fā)明人】楊鴻淯
【申請(qǐng)人】深圳市微泰斯生物工程有限公司